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编号:10273758
新型亲和吸附剂对血液中循环免疫复合物吸附性能的研究
http://www.100md.com 《生物医学工程学杂志》 1999年第3期
     作者:于美丽 贾克培 吕文岚 付 立 宋继昌 杨 彦 郭贤权

    单位:于美丽 贾克培 吕文岚 付 立 宋继昌(天津市第三中心医院,天津 300170);杨 彦(南开大学 分子生物学研究所,天津 300071);郭贤权(南开大学 高分子化学研究所,天津 300071)

    关键词:亲和吸附剂;循环免疫复合物;吸附率;吸附量

    生物医学工程学杂志990305 摘要 从5种亲和吸附剂中筛选出对病理性循环免疫复合物具有特异性吸附的吸附剂,测定其比表面积、孔结构参数:平均孔径、孔容,并讨论了吸附诸条件对CIC吸附性能的影响。

    The Properties of New Affinity Adsorbent for Adsorbing

    the Cycle Immune Complex in Blood
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    Yu Meili1 Jia Kepei1 Lu Wenlan1 Fu Li1 Song Jichang1 Yang Yan2 Guo Xianquan3

    1 (The Third Central Hospital of Tianjin, Tianjin 300170)

    2 (Institute of Molecular Biology, Nankai University, Tiangjin 300071)

    3 (Institute of Polymer Chemistry, Nankai University, Tianjin 300071)

    Abstract This study was designed to select an affinity adsorbent from 5 kinds of adsorbents available. The adsorbent AA3 was found being specific to the adsorption of pathologic cycle immune complex(CIC). The physical properties such as specific surface area, proe volume and average pore diameter of adsorbents were determined. A discussion on the factors that affect the adsorption of CIC is also presented in this paper.
, 百拇医药
    Key words Affinity adsorbent Cycle immune complex Adsorption capacity Adsorption efficiency

    1 前 言

    循环免疫复合物(Cycle Immune Complex,CIC)是许多免疫性疾病的生物活性物质,它可以沉积在任何部位的血管内膜上,引起不同程度的免疫损伤。例如循环于血中的CIC常在肾小球毛细血管基底膜上沉积,引起肾小球肾炎[1]。这是由于肾小球存在有Fc和C3b受体利于免疫复合物沉积,同时肾小球毛细血管管径细,血流慢也有利于血管内皮细胞滞留免疫复合物。如何清除体内的循环免疫复合物,有效地治疗肾小球肾炎等免疫性疾病一直困扰着临床医生。目前对于免疫复合物疾病的治疗临床上尚无有效治疗方法,主要采用口服激素和镇痛药物。由于激素仅抑制了体内的免疫反应,不能清除体内的病理性物质,治疗效果不理想,而且激素的副作用已受到重视。解热镇痛剂作为缓解症状的药物其治疗效果更差。众所周知,70年代以来,血液吸附在临床实践中已成功的用于治疗外源性和内源性中毒[2,3],但采用血液灌流吸附疗法清除血液中病理性大分子CIC来治疗免疫性疾病尚未见报道。为此作者采用亲和吸附剂(Affinity Adsorbent, AA)作为吸附材料,试图寻找一种安全、有效的清除体内病理性循环免疫复合物的方法,以期为临床血液灌流治疗肾小球肾炎等免疫性疾病开辟新的途径。
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    2 实验部分

    2.1 材料和仪器

    吸附剂类型(Resin type)为AA1(L-苯丙氨酸,L-phenylalanine)、AA2(L-色氨酸,L-tryptophan)、AA3(L-酪氨酸,L-tyrosine)、AA4(L-脯氨酸,L-proline)、AA5(L-羟脯氨酸,L-hydroxy proline)五种吸附剂,均由南开大学分子生物学研究所杨彦教授提供。

    UV-240紫外分光光度仪(日本岛津),MRX酶标仪(美国),HL-2型恒流泵(上海彭代实业有限公司)。

    2.2 亲和吸附剂的制备及预处理

    采用醋酸乙烯脂为单体,三烯丙基异氰尿酸脂为交联剂,在制孔剂存在下进行悬浮聚合,制得乳白色的大孔VT共聚物作为载体,经化学修饰,固载不同的氨基酸配体,制得AA系列吸附剂。
, 百拇医药
    将AA系列亲和吸附剂用无水乙醇充分溶涨,尔后,用生理盐水洗涤,晾干,真空干燥待用。

    2.3 血清CIC的测定

    CIC的测定采用C1q-ELISA法测定,试剂盒由天津血液研究所提供。通过对30例健康人血中的CIC进行测定,其平均值为(39.7+24.3) μg/ml,与试剂盒提供的正常对照值相吻和,用以作为人血清中CIC测定的正常对照。

    2.4 静态吸附实验

    在25 ml具塞三角瓶中,加入一定浓度的免疫复合物血清,投入定量的吸附剂,置于一定温度的恒温水槽中,振荡一定时间取样,测定吸附前、后血清中循环免疫复合物的浓度(concentration of CIC),按下式计算吸附率(adsorption efficiency, %)和吸附量(adsortpion capacity, μg/g干树脂)。
, 百拇医药
    式中:C0和C分别为吸附前、后血中的CIC的浓度;M为树脂的干重(g);V为血清体积(ml)。

    2.5 动态吸附实验

    在自制的聚四氟乙烯灌流器中,装入7 g吸附剂,该吸附剂经75%乙醇充分溶涨后用生理盐水冲洗干净,在37 ℃下,一定初始浓度的免疫复合物血清由恒流泵连接流入灌流器,其装置见图1。一定时间取样,测定吸附前、后血中免疫复合物的浓度,计算吸附率和吸附量。

    图1 动态吸附实验装置

    Fig 1 Apparatus for circulating adsorption

    1.Cycle Immune Complex, CIC; 2.Column filled with adsorbent; 3.Pump
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    3 结果与讨论

    3.1 亲和吸附剂的物理性质

    由表1可知,AA3比表面积(Specific area,S)最大,其次为AA4,随后按AA5、AA1、AA2顺序下降。平均孔径(Average Pore diameter)的顺序由AA2、AA1、AA5、AA4、AA3的规律性逐次递减。孔容(Pore Volume, V)的递减顺序与平均孔径变化相似。

    表1 5种亲合吸附剂的物理性能

    Table 1 Characterization of the physical structure of 5 kinds of affinity adsorbents Resin type

    Specific
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    area

    (m2/g)

    Average pore

    diameter

    (nm)

    Pore

    volume

    (ml/g)

    AA1

    67.47

    232

    0.7524
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    AA2

    58.49

    256

    0.7480

    AA3

    107.21

    49

    0.2629

    AA4

    84.15

    64

    0.2693

    AA5
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    72.73

    86

    0.3541

    3.2 吸附剂对血清CIC的吸附性能

    通过5种亲和吸附剂对血清中CIC吸附性能的实验表明,AA1至AA5对CIC均有不同吸附功效,其中AA3吸附剂的吸附率最高,达41.7%,吸附量为135.2 μg/g。这与AA3的孔结构性质及免疫复合物的特殊结构有关。由于AA3的平均孔径较小,而比表面积较高,有利于氨基酸配体在其表面进行反应,较多的氨基酸配体与CIC通过物理化学吸附作用结合在一起导致AA3的吸附率和吸附量较高(吸附剂用量0.5 g,CIC浓度为162.0 μg/ml的血清1 ml,生理盐水1 ml,37 ℃水浴2 h,平均5次实验)。

    亲和吸附剂对血中CIC具有不同吸附功效。其吸附率和吸附量从AA3→AA2→AA1→AA4→AA5逐渐降低,其中AA3吸附剂的吸附率和吸附量最大,分别为41.0%和135.2 μg/g。这可能与AA3吸附剂的孔结构、固载的配体性能及其CIC的结构特征有关。根据“相似吸附相似”原理,AA3吸附剂固载的配体与CIC的结构相似,使其吸附效果较高,另外AA3的比表面积较大,在孔径适合于吸附CIC孔道时,比表面积越大,吸附率和吸附量越高(见表2)。表2 5种吸附剂对血清中CIC的吸附作用
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    Table 2 Adsorption properties of the 5 kinds of adsorbents to CIC in serum Resin

    type

    Exchange

    capacity

    (mmol/g)

    Concentration of CIC

    (μg/ml)

    Adsorption

    efficiency

    (%)
, 百拇医药
    Adsorption

    capacity

    (μg/g)

    C0(x)

    C(±s)

    AA1

    0.30

    81.0

    56.3±4.3

    30.5

    98.8
, 百拇医药
    AA2

    0.29

    81.0

    50.5±2.7

    37.6

    122.2

    AA3

    0.33

    81.0

    47.2±3.8

    41.7

    135.2

    AA4
, http://www.100md.com
    0.30

    81.0

    58.8±10.1

    27.4

    88.8

    AA5

    0.29

    81.0

    61.5±7.3

    24.1

    78.0

    3.3 AA3吸附剂对CIC的平衡吸附

, 百拇医药     AA3吸附率随时间变化的规律见表3,当血中CIC浓度在微克级时为90 min,其平衡吸附率达39.8%(吸附剂用量0.5 g,CIC浓度为144.4 μg/ml的血清1 ml,生理盐水1 ml,37 ℃水浴,平均5次实验)。表3 吸附时间对AA3吸附率的影响

    Table 3 Influence of time on adsorption efficiency of AA3 Time

    (min)

    Concentration of CIC

    (μg/ml)

    Adsorption

    efficiency

    (%)
, 百拇医药
    C0(x)

    C(±s)

    15

    72.2

    62.9±6.3

    12.8

    30

    72.2

    58.8±4.8

    18.5

    45

, 百拇医药     72.2

    53.2±5.5

    26.3

    60

    72.2

    47.1±7.2

    34.6

    90

    72.2

    43.5±4.7

    39.8

    120

    72.2
, 百拇医药
    43.9±9.6

    39.2

    C Vs. C0,P<0.05

    3.4 温度对AA3吸附率的影响

    AA3吸附剂随温度的升高吸附率有所升高,但在27~47 ℃间变化不明显(吸附剂用量0.5 g,CIC浓度为107.0 μg/ml的血清1 ml,生理盐水1 ml,平均5次实验,吸附时间为90 min),见表4。

    表4 温度对AA3吸附率的影响

    Table 4 Influence of temperature on adsorption efficiency of AA3 Temperature

, 百拇医药     (℃)

    Concentration of CIC

    (μg/ml)

    Adsorption

    efficiency

    (%)

    C0(x)

    C(±s)

    7

    53.5

    38.6±4.3
, 百拇医药
    27.8

    17

    53.5

    36.6±2.1

    31.6

    27

    53.5

    33.9±2.8

    36.6

    37

    53.5

    32.7±3.1

    38.9
, 百拇医药
    47

    53.5

    32.4±3.7

    39.4

    C Vs. C0,P<0.05

    3.5 血清CIC浓度对AA3吸附率的影响

    随血清CIC浓度的升高,AA3吸附率有所降低,而吸附量随之增高,(吸附剂用量0.5 g,血清2 ml,37 ℃水浴,90 min,平均5次实验),见表5。

    表5 血清CIC浓度对AA3吸附率的影响

    Table 5 Influence of concentration on adsorption efficiency of AA3 Concentration of CIC
, 百拇医药
    (μg/ml)

    Adsorption

    efficiency

    (%)

    Adsorption

    capacity

    (μg/g)

    C0(x)

    C(±s)

    26.75

    16.16±2.22
, http://www.100md.com
    39.6

    42.36

    36.10

    22.30±5.31

    38.2

    55.20

    53.50

    33.24±4.70

    38.0

    81.04

    72.20

    45.27±4.83

, http://www.100md.com     37.3

    107.72

    107.00

    67.62±6.45

    36.8

    177.56

    144.40

    93.86±9.37

    35.1

    202.16

    C Vs. C0,P<0.05

    3.6 AA3吸附剂用量对血清CIC吸附率的影响
, 百拇医药
    不同吸附剂用量对CIC的吸附性能的影响,随AA3吸附剂用量的增加吸附量降低而吸附率先增高至用量为0.8 g时出现最大值,随后降低(血清浓度158.8 μg/g,体积1 ml;生理盐水1 ml,37 ℃水浴,90 min,平均5次实验),见表6。

    表6 AA3吸附剂用量对血清CIC吸附率的影响

    Table 6 The AA3 adsorbent weights and their adsorption efficiency Weight

    of resin

    (g)

    Concentration of CIC

    (μg/ml)
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    Adsorptiopn

    capacity

    (μg/ml)

    Adsorption

    efficiency

    (%)

    C0(x)

    C(±s)

    0.1

    79.4

    51.0±7.3
, 百拇医药
    282.6

    35.7

    0.4

    79.4

    47.8±6.8

    158.0

    39.8

    0.6

    79.4

    46.7±5.8

    109.1

    41.2

    0.8
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    79.4

    44.7±4.6

    86.7

    43.7

    1.0

    79.4

    41.2±4.2

    76.4

    48.1

    C Vs. C0,P<0.05

    3.7 模拟体外血液灌流对CIC吸附性能的影响

    当血清CIC初始浓度一定时,AA3的吸附率随吸附时间的延长而增大,至90 min,吸附率趋于稳定即达40%(见图2)。
, 百拇医药
    图2 AA3吸附剂动态吸附性能

    Fig 2 Dynamic adsorption curves of AA3 adsorbent

    上述吸附剂对血清CIC的吸附实验为进一步开展吸附剂对动物模型的体外血液灌流实验提供了科学依据。详细动物模型的制作及体外血液灌流实验另有文章报道。

    参考文献

    1 宋庭益,史敏言,姚立人等.免疫学基础与临床.安徽:安徽科学技术出版社,1980

    2 Behm E, Kuroda T, Yamawaki N. Biomat Art Cell, Art Org, 1987; 15(1)∶101

    3 Chiellini E, Guistip(ed). Polymers in Medicine, Biomedical and Pharmacological Application. Polymers Sci, and Tech, Plenum Press, 1983;23

    4 Eoffler D, Angello V, Kunkel HG. J Exp Med, 1971∶145-289

    (收稿:1998-03-10 修回:1998-08-20), http://www.100md.com