生物材料体内外试验相关性研究——体外白细胞趋化试验与体内肌肉埋植试验的相关性探讨*
作者：闻学雷 张彩霞 刘晓亮 顾国珍 钱云芳 孟爱英 黄哲玮
单位：上海生物材料研究测试中心，上海第二医科大学 附属第九人民医院，上海 200023
关键词：生物材料；白细胞趋化试验；肌肉埋植试验；相关性
生物医学工程学杂志990301 摘要 探讨生物材料体内外试验的相关性。对七种生物材料分别以体外白细胞趋化性试验和体内肌肉埋植试验来评价材料的组织毒性。体外试验表明不同毒性材料对白细胞趋化能力有不同程度的影响，而导致机体对异物产生不同的抗炎反应；各期体内试验反映了材料在肌肉组织中不同的炎性反应。经Spearman秩相关统计处理，两种方法的相关系数较高(介于0.89286～0.98198)，初步显示白细胞趋化性试验和肌肉埋植试验具较好相关性。
Study on Correlation Between in Vivo and in Vitro Tests of
, 百拇医药
Biomaterials—Correlation Between Leukocyte Chemotaxis
Test and Muscular Implant Test in Rabbits
Wen Xuelei Zhang Caixia Liu Xiaoliang Gu Guozhen Qian Yunfang
Meng Aiying Huang Zhewei
(Shanghai Biomaterial Research and Test Center, No.9 Hospital Attached to
Shanghai Second Medical University, Shanghai 200023)
, 百拇医药
Abstract The purpose of this study was to investigate the correlation between the results of in vivo and in vitro tests of biomaterials. With muscular implant test and leukocyte chemotaxis test, the levels of tissue toxicity of seven biomaterials were evaluated. The samples with high-level toxicity showed weak leukocyte chemotaxis, which would influence the anti-inflammatory reaction to foreign bodies. By the method of Spearman rank correlation,the coefficient was between 0.89286-0.98198 indicating that the correlation of the two tests is excellent.
, http://www.100md.com
Key words Biomaterials Leukocyte chemotaxis test Muscular implant test Correlation
1 引 言
随着生物材料在医学领域的广泛应用，对材料安全性评价的方法也日益受到关注。兔肌肉埋植试验是常用的评价生物材料安全性的体内方法，而尊重生命、减少试验动物的数量亦是大趋势，故寻找试验周期短、与体内动物试验相关性好、经济的体外方法是当前对生物材料评价方法研究的方向[1]。本研究用白细胞趋化性试验与兔肌肉埋植试验对七种生物材料的组织毒性进行了评定，并经统计学分析来试述这两种方法间的相关性。
2 材料和方法
2.1 试验材料
见表1。
, http://www.100md.com
表1 试验材料
Table 1 Seven experimental materials No.
Materials
Manufacturers
1#
Fluorinated ethylenepropylene copolymer
Shanghai Plastics Institute
2#
Polymethyl methacrylate**(Dental Base Resin Type Ⅱ)
, http://www.100md.com
Medicines & Materials Factory of Shanghai 2nd Medical University
3#
Glass ionomer cement(Fuji Ionomer Type Ⅱ LC)
GC Corporation
4#
Composite resin(H-18 Ultramicrofiller Composite Resin)
Shanghai Qingpu Dental Materials Factory
5#
, 百拇医药
Glass ionomer cement(GI-1 Glass Ionomer Cement)
Shanghai Qingpu Dental Materials Factory
6#
Glass ionomer cement (Fuji Ionomer Type Ⅱ)
GC Corporation
7#
Composite resin(ConciseTM Composite)
3M Dental Products
, 百拇医药
** Adding dibutyl tin dilaurate for high toxicity
2.2 试验方法
2.2.1 白细胞趋化试验[2，3] 白细胞趋化试验可通过中性粒细胞趋化性的强弱来表征组织抗炎反应的能力。
(1)试样制备：1#材料制备成长10 mm，直径1 mm的圆柱体；其他六种材料按生产商规定的调和比例、调和时间进行操作，在特制模具中制备成直径5 mm，厚1 mm的圆片，其中2#材料在调和时加入二月桂酸二丁基锡(Dibutyl tin dilaurate)。试样分别在生理盐水中用超声波洗涤15 min，每个表面经紫外线照射24 h，灭菌备用。
(2)试验步骤：①各材料试样分别置于试管中，均按每cm2试样表面积加10 ml RPMI1640培养液，于37 ℃静置浸渍24 h。浸渍液浓度为100%，以RPMI1640培养液作为阴性对照；②将阴性对照液、各试样浸渍液及阳性对照液(N-FORMYL-MET-LEU-PHE，FMLP)分别加入Boydon小室的下室，每种液体3孔，每孔25 μl；滤膜(5 μm)覆盖其上；③取肝素抗凝兔血10 ml，生理盐水1倍稀释；④取Ficoll分层液置于试管，将稀释血沿管壁缓缓注入，使两者形成明显液面，稀释血与分层液体积比约2∶1；⑤以1500～2000 r/min离心20 min；用毛细吸管插至白细胞层上，将此层细胞并附带少量红细胞吸到另一试管中；加红细胞溶解液，静置至试管内悬液澄清；⑥以1000 r/min离心10 min后，弃上清液，留白细胞于试管底部；生理盐水清洗两遍，以DMEM培养液制备白细胞悬液；⑦用龙胆紫作活细胞染色，并在显微镜下计数，调整悬液浓度至2×106/ml；在Boydon小室的上室中加此悬液50 μl/孔；于37 ℃培养1 h；⑧弃小室内各孔液体，取出滤膜；滤膜在固定液(Diff-Quik Fixatide)中静置5 min，依次进行伊红、吉姆萨染色各5 min，并制片；⑨10×100高倍显微镜观察，每孔计20个视野细胞总数，取3孔平均值。
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2.2.2 兔肌肉埋植试验[4] 肌肉埋植试验是应用体内植入技术来表征材料的生物相容性，是一种最常用的评价方法，参照美国材料试验协会ASTMF763-82标准中的有关内容进行。
(1)试验动物：健康成熟的新西兰兔，体重约2.5 kg。
(2)试样制备：七种材料均制备成长10 mm，直径1 mm的圆柱体，试样表面光滑，边缘圆钝；试样分别在生理盐水中用超声波洗涤15 h，每个表面经紫外线照射24 min，灭菌备用。
(3)试验步骤：①2.5%异戊巴比妥钠作兔耳背静脉推注麻醉，剂量为70 mg/kg；②兔背部常规备皮、消毒、铺巾；③切开皮肤，用针头将试样经针孔推送入背脊肌；脊柱一侧植入4个同一试样，相互间隔约2.5 cm，另一侧植入2个阴性对照试样；切口缝合、消毒；④在植入第7、14、30、90、180 d分期处死动物；取植入试样及周围肌肉组织，肉眼观察试样周围组织情况，10%福尔马林固定；⑤常规石蜡包埋、切片、伊红染色、制片、光镜观察。
, 百拇医药
2.3 评价
2.3.1 白细胞趋化试验 在白细胞趋化性试验中，细胞计数值越高则趋化性越强。将每种材料浸渍液的3孔细胞数的均值除以阳性对照液3孔细胞数的均值，作为各种材料浸渍液在白细胞趋化性试验中的百分值。
2.3.2 兔肌肉埋植试验 根据肌肉组织的炎性细胞反应和纤维囊形成情况来计分值。
(1)炎性细胞反应：
4分：试样周围未见或仅见极少量淋巴细胞；
3分：试样周围可见少量淋巴细胞；
2分：试样周围有少量嗜中性粒细胞及淋巴细胞浸润和巨细胞反应；
1分：试样周围可见以嗜中性粒细胞浸润为主的炎性反应，可见吞噬细胞。
, 百拇医药
(2)纤维囊形成：
4分：囊壁厚度稳定，≤0.03 mm，无继续增厚现象；
3分：纤维化囊壁致密，壁的厚度比形成初期要薄；
2分：试样周围可见纤维母细胞与胶原纤维，并已形成纤维囊腔结构；
1分：试样周围可见小血管与纤维母细胞增生，开始形成疏松的囊壁。
将每种材料不同试验期炎性细胞反应与纤维囊形成情况的得分之和的平均值作为各种材料在兔肌肉埋植试验不同植入期中的分值，并把90 d和180 d植入组合并为长期，14 d和30 d植入组合并作为中期，7 d植入组作为短期，以利统计学处理。
2.3.3 数据处理 用Spearman秩相关统计方法[5]对两种试验的相关性进行分析，如P<0.05，则两试验方法具相关性。
, 百拇医药
3 结 果
(1)根据材料浸渍液的细胞计数均值的不同，提示不同毒性的材料对白细胞趋化性有不同程度的影响(见表2)。
表2 各种材料浸渍液在白细胞趋化性试验中的3孔细胞数的均值和百分值
Table 2 Mean Leukocytic counts and scores in leukocyte chemotaxis test Material No.
Mean counts(
±s)
Scores
1#
, http://www.100md.com
102.00±10.06
0.86
2#
48.00±3.56
0.41
3#
56.33±4.08
0.48
4#
86.67±8.53
0.73
5#
, 百拇医药
57.67±5.17
0.49
6#
76.33±7.02
0.64
7#
72.67±8.19
0.61
The mean counts of positive control is 118.2±12.58 and the negative control 36.7±3.1
(2)材料的组织反应情况(见表3)。
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表3 各种材料在兔肌肉埋植试验不同植入期中的分值
Table 3 Scores in muscular implant test Material No.
Short-term
Mid-term
Long-term
1#
5
6.6
8
2#
2.2
, http://www.100md.com
2.18
5.18
3#
2.25
4.25
5.5
4#
3.25
5.63
6.25
5#
3
, http://www.100md.com 5.13
5.5
6#
4.5
4.5
6.25
7#
4
5.5
6
(3) Spearman秩相关统计方法分析的结果显示：P介于0.0001～0.0068，r介于0.89286～0.98198，说明两种方法有较好相关性(见表4)。表4 Spearman秩相关统计方法对两种试验方法的相关性分析结果
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Table 4 Correlation between the results of leukocyte chemotaxis test and muscular implant test by Spearman rank correlation method Sacrifice periods
(Days after insertion
of implants)
Probability
(p)
Coefficient of
correlation
(r)
, 百拇医药
Short-term(7 days)
0.0068
0.89286
Mid-term(14 days/30 days)
0.0068
0.89286
Long-term(90 days/180 days)
0.0001
0.98198
4 讨 论
(1)本研究采用兔肌肉埋植试验和白细胞趋化性试验分别作为体内、外检测材料组织毒性的方法，经Spearman秩相关统计方法处理，结果显示这两种试验方法具有相关性。而今，体外毒性试验仍不能替代体内动物试验，纵览近十年的Silver Platte MEDLINE，未见系统性的关于多种生物材料检测的体内外方法相关性研究的报道；寻找检测材料组织毒性新的、有效的体外方法无疑是有益的尝试。
, 百拇医药
(2)本研究采用了七种常见的生物材料，其中1#聚全氟乙丙烯(Fluorinated ethylene-propylene copolymer)为全氟乙烯-丙烯共聚物，已用于低温生物储存袋(保存白细胞、血小板、骨髓等)，为无毒材料。由于进行两种方法的相关性评价，所用试验材料的组织毒性必须要有较明显的级差；2#为加有二月桂酸二丁基锡的聚甲基丙烯酸甲酯(Polymethyl methacrylate)，曾在该义齿基托树脂调和时加入苯酚溶液，但因树脂聚合后苯酚仍游离于聚合物外，则改加二月桂酸二丁基锡以增加试样的毒性；3#为FUJI Ⅱ光固化玻璃离子水门汀(Fuji Ionomer Type Ⅱ LC)；4#为H-18超微填料复合树脂 (H-18 ultramicrofiller composite resi-
n)，其主要成分为超微粒二氧化硅和双酚A丙烯酸酯；5#为GI-1玻璃离子粘固剂(GI-1 Glass Ionomer cenent)，其主要成分为含钙、铝、硅、氟等元素的玻璃粉和聚丙烯酸水溶液；6#为FuJiⅡ玻璃离子水门汀(Fjui Ionomer Type Ⅱ)；7#为3M复合树脂(ConciseTM Composit-
, 百拇医药
e)。
(3)白细胞趋化性试验采用Boyden首创的膜滤过法，Boyden小室是最主要的试验器具，他包括上下两室，其间有滤膜分隔，具趋化作用的液体置于下室，白细胞悬液置于上室，经孵育，白细胞向滤膜作定向运动，通过对下室侧滤膜上的白细胞计数来反应趋化能力。本试验中，根据材料浸渍液的细胞计数均值的大小依次为1#、4#、6#、7#、5#、3#和2#，介于阴性和阳性对照之间，说明了方法的可行性。强趋化性的阳性对照FMLP是一种由甲硫氨酸、亮氨酸和苯丙氨酸组成的三肽，弱趋化性的阴性对照为RPMI1640培养液，均对白细胞无毒性作用；而各材料浸渍液对白细胞则有毒性作用，且体外试验中白细胞的量有限，浸渍液毒性对白细胞的杀伤作用可导致白细胞计数值下降。从试验结果分析，2#材料浸渍液对中性粒细胞的趋化程度最小，1#最大，可初步认为在体外试验中毒性大的材料表现为弱趋化性，推测其毒性减弱了白细胞的趋化能力而不利于机体对异物的正常抗炎反应能力。用材料组细胞计数值与阳性对照组细胞计数值的比值来表示材料浸渍液的相对毒性，可有效地减小随机测量误差。
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(4)根据Spearman秩相关统计方法，当概率P<0.05时，两种方法有相关性。本研究所得P值都小于0.01，说明差异有高度显著性，其相关系数r介于0.89286～0.98198，说明100%材料浸渍液浓度的白细胞趋化性试验结果与不同植入期兔肌肉埋植试验结果间具相关性，且相关程度较高。
5 结 论
本研究初步显示了体外白细胞趋化性试验与体内兔肌肉埋植试验具有相关性。另外，通过白细胞趋化性试验与大鼠皮下埋植试验的相关性分析也得到同样的结果(另文发表)，但要达到确立白细胞趋化性试验为体外评价材料安全性的标准之一，仍有待更深一步的探索。
致谢 本研究承上海市第九人民医院病理科韩忠镕主任医师、免疫教研室陆昌语教授、药理教研室曹东医师和上海第二医科大学生物统计教研室苏炳华教授的不吝指教。
* 国家自然科学基金资助项目(39410215)
, 百拇医药
参考文献
1 刘晓亮，张彩霞.体外细胞毒性试验评价齿科材料的现状及展望.口腔材料器械杂志，1998；7(1)∶26
2 Faik W, Richard H, Goodwin JR et al. A 48-well micro chemotaxis assembly for rapid and accurated measurement of leukocyte migration. J Immunol Methods, 1980； 33∶259
3 Harvath L, Falk W, Leonard EJ. Rapid quantitation of neutrophil chemotaxis:use of a polyvinylpyrrolidone-free polycarbonate membrane in a multi well assembly. J Immunol Methods, 1980； 37∶39
4 美国材料试验协会(ASTM)编著.医用装置标准.成都：成都科技大学出版社.1990∶325-330
5 郭祖超主编.医用数理统计方法.第三版.北京：人民卫生也版社.1988∶205-218
(收稿：1998-05-20 修回：1998-08-20), 百拇医药
单位：上海生物材料研究测试中心，上海第二医科大学 附属第九人民医院，上海 200023
关键词：生物材料；白细胞趋化试验；肌肉埋植试验；相关性
生物医学工程学杂志990301 摘要 探讨生物材料体内外试验的相关性。对七种生物材料分别以体外白细胞趋化性试验和体内肌肉埋植试验来评价材料的组织毒性。体外试验表明不同毒性材料对白细胞趋化能力有不同程度的影响，而导致机体对异物产生不同的抗炎反应；各期体内试验反映了材料在肌肉组织中不同的炎性反应。经Spearman秩相关统计处理，两种方法的相关系数较高(介于0.89286～0.98198)，初步显示白细胞趋化性试验和肌肉埋植试验具较好相关性。
Study on Correlation Between in Vivo and in Vitro Tests of
, 百拇医药
Biomaterials—Correlation Between Leukocyte Chemotaxis
Test and Muscular Implant Test in Rabbits
Wen Xuelei Zhang Caixia Liu Xiaoliang Gu Guozhen Qian Yunfang
Meng Aiying Huang Zhewei
(Shanghai Biomaterial Research and Test Center, No.9 Hospital Attached to
Shanghai Second Medical University, Shanghai 200023)
, 百拇医药
Abstract The purpose of this study was to investigate the correlation between the results of in vivo and in vitro tests of biomaterials. With muscular implant test and leukocyte chemotaxis test, the levels of tissue toxicity of seven biomaterials were evaluated. The samples with high-level toxicity showed weak leukocyte chemotaxis, which would influence the anti-inflammatory reaction to foreign bodies. By the method of Spearman rank correlation,the coefficient was between 0.89286-0.98198 indicating that the correlation of the two tests is excellent.
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Key words Biomaterials Leukocyte chemotaxis test Muscular implant test Correlation
1 引 言
随着生物材料在医学领域的广泛应用，对材料安全性评价的方法也日益受到关注。兔肌肉埋植试验是常用的评价生物材料安全性的体内方法，而尊重生命、减少试验动物的数量亦是大趋势，故寻找试验周期短、与体内动物试验相关性好、经济的体外方法是当前对生物材料评价方法研究的方向[1]。本研究用白细胞趋化性试验与兔肌肉埋植试验对七种生物材料的组织毒性进行了评定，并经统计学分析来试述这两种方法间的相关性。
2 材料和方法
2.1 试验材料
见表1。
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表1 试验材料
Table 1 Seven experimental materials No.
Materials
Manufacturers
1#
Fluorinated ethylenepropylene copolymer
Shanghai Plastics Institute
2#
Polymethyl methacrylate**(Dental Base Resin Type Ⅱ)
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Medicines & Materials Factory of Shanghai 2nd Medical University
3#
Glass ionomer cement(Fuji Ionomer Type Ⅱ LC)
GC Corporation
4#
Composite resin(H-18 Ultramicrofiller Composite Resin)
Shanghai Qingpu Dental Materials Factory
5#
, 百拇医药
Glass ionomer cement(GI-1 Glass Ionomer Cement)
Shanghai Qingpu Dental Materials Factory
6#
Glass ionomer cement (Fuji Ionomer Type Ⅱ)
GC Corporation
7#
Composite resin(ConciseTM Composite)
3M Dental Products
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** Adding dibutyl tin dilaurate for high toxicity
2.2 试验方法
2.2.1 白细胞趋化试验[2，3] 白细胞趋化试验可通过中性粒细胞趋化性的强弱来表征组织抗炎反应的能力。
(1)试样制备：1#材料制备成长10 mm，直径1 mm的圆柱体；其他六种材料按生产商规定的调和比例、调和时间进行操作，在特制模具中制备成直径5 mm，厚1 mm的圆片，其中2#材料在调和时加入二月桂酸二丁基锡(Dibutyl tin dilaurate)。试样分别在生理盐水中用超声波洗涤15 min，每个表面经紫外线照射24 h，灭菌备用。
(2)试验步骤：①各材料试样分别置于试管中，均按每cm2试样表面积加10 ml RPMI1640培养液，于37 ℃静置浸渍24 h。浸渍液浓度为100%，以RPMI1640培养液作为阴性对照；②将阴性对照液、各试样浸渍液及阳性对照液(N-FORMYL-MET-LEU-PHE，FMLP)分别加入Boydon小室的下室，每种液体3孔，每孔25 μl；滤膜(5 μm)覆盖其上；③取肝素抗凝兔血10 ml，生理盐水1倍稀释；④取Ficoll分层液置于试管，将稀释血沿管壁缓缓注入，使两者形成明显液面，稀释血与分层液体积比约2∶1；⑤以1500～2000 r/min离心20 min；用毛细吸管插至白细胞层上，将此层细胞并附带少量红细胞吸到另一试管中；加红细胞溶解液，静置至试管内悬液澄清；⑥以1000 r/min离心10 min后，弃上清液，留白细胞于试管底部；生理盐水清洗两遍，以DMEM培养液制备白细胞悬液；⑦用龙胆紫作活细胞染色，并在显微镜下计数，调整悬液浓度至2×106/ml；在Boydon小室的上室中加此悬液50 μl/孔；于37 ℃培养1 h；⑧弃小室内各孔液体，取出滤膜；滤膜在固定液(Diff-Quik Fixatide)中静置5 min，依次进行伊红、吉姆萨染色各5 min，并制片；⑨10×100高倍显微镜观察，每孔计20个视野细胞总数，取3孔平均值。
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2.2.2 兔肌肉埋植试验[4] 肌肉埋植试验是应用体内植入技术来表征材料的生物相容性，是一种最常用的评价方法，参照美国材料试验协会ASTMF763-82标准中的有关内容进行。
(1)试验动物：健康成熟的新西兰兔，体重约2.5 kg。
(2)试样制备：七种材料均制备成长10 mm，直径1 mm的圆柱体，试样表面光滑，边缘圆钝；试样分别在生理盐水中用超声波洗涤15 h，每个表面经紫外线照射24 min，灭菌备用。
(3)试验步骤：①2.5%异戊巴比妥钠作兔耳背静脉推注麻醉，剂量为70 mg/kg；②兔背部常规备皮、消毒、铺巾；③切开皮肤，用针头将试样经针孔推送入背脊肌；脊柱一侧植入4个同一试样，相互间隔约2.5 cm，另一侧植入2个阴性对照试样；切口缝合、消毒；④在植入第7、14、30、90、180 d分期处死动物；取植入试样及周围肌肉组织，肉眼观察试样周围组织情况，10%福尔马林固定；⑤常规石蜡包埋、切片、伊红染色、制片、光镜观察。
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2.3 评价
2.3.1 白细胞趋化试验 在白细胞趋化性试验中，细胞计数值越高则趋化性越强。将每种材料浸渍液的3孔细胞数的均值除以阳性对照液3孔细胞数的均值，作为各种材料浸渍液在白细胞趋化性试验中的百分值。
2.3.2 兔肌肉埋植试验 根据肌肉组织的炎性细胞反应和纤维囊形成情况来计分值。
(1)炎性细胞反应：
4分：试样周围未见或仅见极少量淋巴细胞；
3分：试样周围可见少量淋巴细胞；
2分：试样周围有少量嗜中性粒细胞及淋巴细胞浸润和巨细胞反应；
1分：试样周围可见以嗜中性粒细胞浸润为主的炎性反应，可见吞噬细胞。
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(2)纤维囊形成：
4分：囊壁厚度稳定，≤0.03 mm，无继续增厚现象；
3分：纤维化囊壁致密，壁的厚度比形成初期要薄；
2分：试样周围可见纤维母细胞与胶原纤维，并已形成纤维囊腔结构；
1分：试样周围可见小血管与纤维母细胞增生，开始形成疏松的囊壁。
将每种材料不同试验期炎性细胞反应与纤维囊形成情况的得分之和的平均值作为各种材料在兔肌肉埋植试验不同植入期中的分值，并把90 d和180 d植入组合并为长期，14 d和30 d植入组合并作为中期，7 d植入组作为短期，以利统计学处理。
2.3.3 数据处理 用Spearman秩相关统计方法[5]对两种试验的相关性进行分析，如P<0.05，则两试验方法具相关性。
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3 结 果
(1)根据材料浸渍液的细胞计数均值的不同，提示不同毒性的材料对白细胞趋化性有不同程度的影响(见表2)。
表2 各种材料浸渍液在白细胞趋化性试验中的3孔细胞数的均值和百分值
Table 2 Mean Leukocytic counts and scores in leukocyte chemotaxis test Material No.
Mean counts(
±s)Scores
1#
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102.00±10.06
0.86
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48.00±3.56
0.41
3#
56.33±4.08
0.48
4#
86.67±8.53
0.73
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57.67±5.17
0.49
6#
76.33±7.02
0.64
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72.67±8.19
0.61
The mean counts of positive control is 118.2±12.58 and the negative control 36.7±3.1
(2)材料的组织反应情况(见表3)。
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表3 各种材料在兔肌肉埋植试验不同植入期中的分值
Table 3 Scores in muscular implant test Material No.
Short-term
Mid-term
Long-term
1#
5
6.6
8
2#
2.2
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2.18
5.18
3#
2.25
4.25
5.5
4#
3.25
5.63
6.25
5#
3
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5.5
6#
4.5
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6.25
7#
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5.5
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(3) Spearman秩相关统计方法分析的结果显示：P介于0.0001～0.0068，r介于0.89286～0.98198，说明两种方法有较好相关性(见表4)。表4 Spearman秩相关统计方法对两种试验方法的相关性分析结果
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Table 4 Correlation between the results of leukocyte chemotaxis test and muscular implant test by Spearman rank correlation method Sacrifice periods
(Days after insertion
of implants)
Probability
(p)
Coefficient of
correlation
(r)
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Short-term(7 days)
0.0068
0.89286
Mid-term(14 days/30 days)
0.0068
0.89286
Long-term(90 days/180 days)
0.0001
0.98198
4 讨 论
(1)本研究采用兔肌肉埋植试验和白细胞趋化性试验分别作为体内、外检测材料组织毒性的方法，经Spearman秩相关统计方法处理，结果显示这两种试验方法具有相关性。而今，体外毒性试验仍不能替代体内动物试验，纵览近十年的Silver Platte MEDLINE，未见系统性的关于多种生物材料检测的体内外方法相关性研究的报道；寻找检测材料组织毒性新的、有效的体外方法无疑是有益的尝试。
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(2)本研究采用了七种常见的生物材料，其中1#聚全氟乙丙烯(Fluorinated ethylene-propylene copolymer)为全氟乙烯-丙烯共聚物，已用于低温生物储存袋(保存白细胞、血小板、骨髓等)，为无毒材料。由于进行两种方法的相关性评价，所用试验材料的组织毒性必须要有较明显的级差；2#为加有二月桂酸二丁基锡的聚甲基丙烯酸甲酯(Polymethyl methacrylate)，曾在该义齿基托树脂调和时加入苯酚溶液，但因树脂聚合后苯酚仍游离于聚合物外，则改加二月桂酸二丁基锡以增加试样的毒性；3#为FUJI Ⅱ光固化玻璃离子水门汀(Fuji Ionomer Type Ⅱ LC)；4#为H-18超微填料复合树脂 (H-18 ultramicrofiller composite resi-
n)，其主要成分为超微粒二氧化硅和双酚A丙烯酸酯；5#为GI-1玻璃离子粘固剂(GI-1 Glass Ionomer cenent)，其主要成分为含钙、铝、硅、氟等元素的玻璃粉和聚丙烯酸水溶液；6#为FuJiⅡ玻璃离子水门汀(Fjui Ionomer Type Ⅱ)；7#为3M复合树脂(ConciseTM Composit-
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e)。
(3)白细胞趋化性试验采用Boyden首创的膜滤过法，Boyden小室是最主要的试验器具，他包括上下两室，其间有滤膜分隔，具趋化作用的液体置于下室，白细胞悬液置于上室，经孵育，白细胞向滤膜作定向运动，通过对下室侧滤膜上的白细胞计数来反应趋化能力。本试验中，根据材料浸渍液的细胞计数均值的大小依次为1#、4#、6#、7#、5#、3#和2#，介于阴性和阳性对照之间，说明了方法的可行性。强趋化性的阳性对照FMLP是一种由甲硫氨酸、亮氨酸和苯丙氨酸组成的三肽，弱趋化性的阴性对照为RPMI1640培养液，均对白细胞无毒性作用；而各材料浸渍液对白细胞则有毒性作用，且体外试验中白细胞的量有限，浸渍液毒性对白细胞的杀伤作用可导致白细胞计数值下降。从试验结果分析，2#材料浸渍液对中性粒细胞的趋化程度最小，1#最大，可初步认为在体外试验中毒性大的材料表现为弱趋化性，推测其毒性减弱了白细胞的趋化能力而不利于机体对异物的正常抗炎反应能力。用材料组细胞计数值与阳性对照组细胞计数值的比值来表示材料浸渍液的相对毒性，可有效地减小随机测量误差。
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(4)根据Spearman秩相关统计方法，当概率P<0.05时，两种方法有相关性。本研究所得P值都小于0.01，说明差异有高度显著性，其相关系数r介于0.89286～0.98198，说明100%材料浸渍液浓度的白细胞趋化性试验结果与不同植入期兔肌肉埋植试验结果间具相关性，且相关程度较高。
5 结 论
本研究初步显示了体外白细胞趋化性试验与体内兔肌肉埋植试验具有相关性。另外，通过白细胞趋化性试验与大鼠皮下埋植试验的相关性分析也得到同样的结果(另文发表)，但要达到确立白细胞趋化性试验为体外评价材料安全性的标准之一，仍有待更深一步的探索。
致谢 本研究承上海市第九人民医院病理科韩忠镕主任医师、免疫教研室陆昌语教授、药理教研室曹东医师和上海第二医科大学生物统计教研室苏炳华教授的不吝指教。
* 国家自然科学基金资助项目(39410215)
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参考文献
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4 美国材料试验协会(ASTM)编著.医用装置标准.成都：成都科技大学出版社.1990∶325-330
5 郭祖超主编.医用数理统计方法.第三版.北京：人民卫生也版社.1988∶205-218
(收稿：1998-05-20 修回：1998-08-20), 百拇医药