水溶性高分子材料聚(羟烷基)-天冬酰胺的合成性能及键合药物体内释放研究*
作者：章志坚 汤谷平 陈启琪 王 斌 马明铭 张晓东
单位：(浙江医科大学 药学系，杭州 310031)
关键词：聚天冬酰胺；羟烷基；乙酰水杨酸；体内释放
生物医学工程学杂志990407 摘要 以天冬氨酸为单体合成了聚天冬酰胺，用不同长度的羟烷基作为侧链基制成聚-α、β-(羟烷基)-DL-天冬酰胺。用红外光谱法，差热分析法对材料进行了表征；对材料的急性毒性、稳定性等作了研究，实验表明该类材料为低毒性材料，并有较好的稳定性。以乙酰水杨酸为模型药物，大白兔为实验动物进行体内释放实验，结果证明侧链基越长，释药速率加快。
A Water-soluble Synthetic Polymer, α,β-Poly(hydroxyalkyl)-
DL-Asparamide, and Conjugating Drug
, 百拇医药
Zhang Zhijan Tang Guping Chen Qiqi Wang Bin Ma Mingming Zhang Xiaodong
(Department of Pharmacy, Zhejiang Medical University, Hangzhou 310031)
Abstract A water-soluble polymer α,β-poly (hydroxyalkyl)-DL-asparamide was synthesized by polysuccinimide(PSI) and different lengths of hydroxyalkyls, including α,β-poly(hydroxyethyl)-DL-asparamide(PHEA),α,β-poly(hydroxypropyl)-DL-asparamide(PHPA),and α,β-poly(hydroxybutyl)-DL-asparamide(PHBA). These polymers were characterized by differential scanning calorimetry(DSC) and infrared spectrophotometry(IR). Stability and acutetoxicity of these polymers were studied. The experiment indicated that these materials were of low-toxicity and high stability. Acetylsalicylic acid, as a model drug, was conjugated into polymers; the drug loadings were 38.63%, 37.68% and 38.70% respectively. Polymer drugs were made into cylinder, and in-vivo release in rabbits was set out. It showed that the longer the spacer was linked into the polymer, the faster the drug was released.
, 百拇医药
Key words Polysuccinimide(PSI) Hydroxyalkyl Acetylsalicylic acid In-vivo release
Ringsdof[1]曾经就高分子载体药物提出模型，该模型包括：药、悬臂、输送基因，使整个高分子链能有溶解的基因。因此，对高分子材料侧链基的改性修饰，可以在一定程度上改变母体材料的性能。从药物释放的角度来看，键合的药物千变万化，他们的结构、基团均不相同，这就需要改变，调节侧链基的性能，包括对其长短、功能性、亲疏水性等多方面的调节，以达到所需键合药物的释放需要，而成为“智能型”材料。
课题组已对聚(羟烷基)-DL-天冬酰胺键合不同药物进行了报道[2～4]。我们以不同长度的羟烷基为侧链基(其中羟烷基分别为氨基乙醇、氨基丙醇、氨基丁醇)，对材料的急性毒性，光、温度、湿度pH值等对材料稳定性的影响作了系统的研究。将模型药物乙酰水杨酸键入材料上制成前体药物，并以棒剂为给药剂型进行了兔体内释放实验，比较不同长度的侧链基对药物释放的影响，结果与预计的相符。
, 百拇医药
1 实验部分
1.1 仪器、药品与动物
红外分析仪(日本岛津公司)：高效液相色谱仪HPLC-6A(日本岛津公司)；热分析仪(美国PE公司)，天冬氨酸(上海试剂三厂，化学纯)；氨基乙醇(上海助剂厂，化学纯)，氨基丙醇(上海试剂一厂，化学纯)，氨基丁醇(本实验室合成，红外，核磁等鉴定)，水杨酸(上海青海新产品研究所，分析纯)，乙酰水杨酸(浙江衢州制药厂，分析纯)。INH小白鼠，纯种大白兔由浙江医科大学动物中心提供。
1.2 聚(羟烷基)-DL-天冬酰胺材料的合成
按文献[5]所报道的方法予以合成。
1.3 聚(羟烷基)-DL-天冬酰胺材料的表征
1.3.1 聚(羟烷基)-天冬酰胺的红外分析 图1是聚丁二酰亚胺、聚-α、β-(羟丁基)-DL-天冬酰及键合乙酰水杨酸的红外图谱。在2-a中，1770 cm-1、1705 cm-1为酰亚胺的υ C=O，3 200 cm-1为υ OH；在2-b中，3300 cm-1为υ OH强吸收峰，1645 cm-1、1540 cm-1为酰胺基中υ C-O、υ C-N强吸收；在2-c中，在1750 cm-1处有-C的υ C=O吸收。
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图1 高分子材料及控释药物的红外光谱
a:聚丁二酰亚胺；b:聚α，β-(4-羟丁基)-DL-天冬酰胺；
c:乙酰水杨酸-聚-α，β-(4-羟基-DL-天冬酰胺共价复合物)
Fig 1 The IR spectrum of polymer and controlled drug
a:polysuccinimide, PSI; b:PHBA; c:ASA PHBA
1.3.2 聚-(羟烷基)-DL-天冬酰胺及键合药物的差热分析 图2是PHBA和ASA-PHBA的差热分析图，由图可知模型药物乙酰水杨酸(ASA)已键合于高分子材料上。
, 百拇医药
图2 高分子材料及控释药物的热分析图
a：乙酰水杨酸；b：乙酰水杨酸-聚α，β-(3-羟丙基)-DL-天冬酰胺共价复合物；c：聚α，β-(3-羟丙基)-DL-天冬酰胺
Fig 2 The DSC curve of polymer and controlled drug
a:ASA; b:ASA-PHPA; c:PHPA
1.3.3 聚α、β-(羟烷基)-DL-天冬酰胺急性毒性试验 精密称取PHEA，PHPA，PHBA各9.050 g，用生理盐水18 ml加热溶解，使其浓度为0.5028 g/ml，冷却备用。取120只INH小白鼠，雌雄各半，重量约20 g，随机分组，每组8只，根据重量腹腔注射，观察PHEA、PHPA、PHBA的致死情况，用寇式法计算三种材料的最大致死量，他们分别是PHEA>19.53 g/kg，PHPA>15.03 g/kg，PHBA>11.72 g/kg。
, 百拇医药
1.3.4 聚α、β-(羟烷基)-DL-天冬酰胺稳定性试验
(1)湿度对材料的影响 精密称取材料各3份，置于敞口小烧杯中，放在恒温培养箱中，维持培养箱内湿度在75%左右，温度为37 ℃，10 d后取出试样，进行凝胶色谱分析。图3为0 d和10 d材料PHPA的凝胶色谱图，由图可知材料在该环境下基本稳定。
图3 湿度对材料稳定性的影响
Fig 3 Effect of humidity on polymer stability
0 d和10 d材料的凝胶色谱图
The GPC of polymer in day 0 and day 10
, 百拇医药
(2)光照对材料的影响 精密称取材料各8份，置于敞口烧杯中，用2000 LX以上的光照度照射，分别于第1、3、5、10 d各随机取出两份，称重，并用凝胶色谱测定分子量的变化。图4是以PHPA为例，表示光照时间与分子量的关系。
图4 光照对材料稳定性的影响
Fig 4 Effect of light on polymer stability
(3)温度对材料的影响 精密称取材料各6份，置于敞口烧杯中，分别放在40、60、80 ℃的恒温培养箱中，10 d后取出试样，进行凝胶色谱分析。图5是不同温度条件下材料分子量的变化情况。
, 百拇医药 图5 温度对材料稳定性的影响
Fig 5 Effect of temperature on polymer stability
(4)pH值对材料的影响 精密称取材料各6份在100 ml试剂瓶中，分别加入pH值为12，10，8，7.4，4.2的溶液50 ml，密闭，置于37 ℃恒温水浴中4 h，取出后分别用NaOH或HCl溶液调至pH=7，转移并定容至100 ml，进行凝胶色谱测定，图6是不同酸碱度对材料影响曲线。
图6 pH值对材料稳定性的影响
Fig 6 Effect of pH on polymer stability
1.4 聚α、β-(羟烷基)-DL-天冬酰胺键合药物试验
, 百拇医药
1.4.1 合成载体药物的合成 PHEA，PHPA，PHBA与乙酰水杨酸的合成按文献[6]报道的方法进行。
(1)标准曲线的制备 精密称取水杨酸(SA)98.4 mg，溶于0.1 mol/L NaOH溶液中，定容至100 ml容量瓶中，得浓度为0.984 mg/ml，分别精密移取标准液0.10、0.20、0.30、0.40、0.50 ml于25 ml容量瓶，定容至刻度，在295 nm波长处，用751G分光光度计上测定吸收值，得标准曲线为A=0.0322+0.102452C(r=0.999,n=5)。
(2)回收率测定 精密称取乙酰水杨酸(ASA)1.0 mg和1.5 mg，加入适量约3 mg高聚物于10 ml安瓿瓶中，加入8 ml 0.1 mol/L NaOH在沸水浴中煮沸2 h，冷却后转移入100 ml容量瓶中，加至刻度，混匀后在295 nm波长处测定吸收度，结果如表1所示。
, 百拇医药 * CASA(μg/ml)=CSA(μg/ml)×
表1 方法回收率(n=3)
Table 1 Recoveries of the method(n=3) Polymer-drug
Concentration add
(μg/ml)
Recovery
(%)
RSD
(%)
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ASA-PHEA
乙酰水杨酸-α，β-(2-羟乙基)-DL-天冬酰胺共价复合物)
1.000
90.50
1.2
1.400
87.76
1.3
ASA-PHPA
乙酰水杨酸-α，β-(3-羟丙基)-DL-天冬酰胺共价复合物)
1.000
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91.18
1.0
1.500
89.13
1.4
ASA-PHBA
乙酰水杨酸-α，β-(4-羟丁基)-DL-天冬酰胺共价复合物)
1.000
90.18
1.2
1.500
90.79
, 百拇医药
1.4
1.4.2 载药率的测定 精密称取ASA-PHEA，ASA-PHPA，ASA-PHBA样品各4 mg于10 ml安瓿瓶中，按回收率测定同样的方法进行操作，结果如表2所示。
表2 药物接入率的测定(n=3)
Table 2 The determination of drug-loadings (n=3) Polymer-drug
Drug-loading
(%)
RSD
(%)
ASA-PHEA
, 百拇医药
乙酰水杨酸-α，β-(2-羟乙基)-DL-天冬酰胺共价复合物)
38.63
1.5
ASA-PHPA
乙酰水杨酸-α，β-(3-羟丙基)-DL-天冬酰胺共价复合物)
37.68
1.4
ASA-PHBA
乙酰水杨酸-α，β-(4-羟丁基)-DL-天冬酰胺共价复合物)
38.70
1.4
, 百拇医药
1.4.3 高分子载体药物体内释放研究 色谱条件的建立：色谱柱为ODS，250×6 mmID，10 μm不锈钢Waster柱，流动相：0.072%H3PO4∶CH3OH∶CH3CN=215∶265∶20(v/v)，流速0.6 ml/min，检测波长295 nm，灵敏度：0.02，以苯甲酸为内标物。色谱图如图7所示。(其中1号峰为内标物苯甲酸，2号峰为水杨酸)。
图7 阿司匹林-聚天冬酰胺体内释放色谱图
a:血清的色谱图；b：标准和内标物在血清中色谱图；1号峰为内标物；2号峰为标准品；c:样品和内标物在血清中的色谱图，1号峰为内标物；2号峰为样品
Fig 7 Chromatogram of ASA-PHPA
, 百拇医药
a:chromatogram of serum; b:chromatogram of internal standard and standard; c:chromatagram of internal standard and sample
1.4.4 血样预处理和回收率 精密吸取一定浓度分别为0.4、1.6、6.4 μg/ml的ASA甲醇溶液100 μl，加空白血样0.6 μl，按血样预处理的方法操作，并进行HPLC测定，得血样回收率如表3所示，以PHPA为例。
表3 体内释放回收率
Table 3 Recoveries of release in vivo(n=3) Concentration add(μg/ml)
Recovery(%)
, 百拇医药 RSD(%)
0.400
96.20
1.0
1.600
97.75
2.9
6.400
95.80
1.1
1.4.5 体内释放实验 精密称取25 mg高分子载体药物，装入不锈钢模具，用50 kg/cm2压力压紧药物，在60 ℃温度下恒温10 min后，再次压紧药物，制得长5mm，直径1.5 mm的无色透明药棒，重新称重后药物损失小于5%。分别将接入率为38.6%的ADSA-PHEA，37.7%的ASA-PHPA，38.7%的ASA-PHBA压成棒状。
, 百拇医药
将9只2.5 kg左右的纯种大白兔随机分成三组，每只在背部皮下埋植三根(约70 mg)棒状药物。植药24 h后耳缘静脉定期采血。血样按上述血样预处理的方法处理，进行HPLC测定。观察给药两周的血药浓度，结果如图8所示。
图8 阿司匹林-聚天冬酰胺兔体内血药浓度释放曲线
a:乙酰水杨酸-聚α，β-(4-羟丁基)-DL-天冬酰胺共价复合物；b:乙酰水杨酸-聚α，β-(3-羟丙基)-DL-天冬酰胺共价复合物；c:乙酰水杨酸-聚α，β-(2-羟乙基)-DL-天冬酰胺共价复合物
Fig 8 Serum concentration of acetylsalicylic acid-poly-(hydroxyalkyl-)-DL-asparamide in rabbits given in
, 百拇医药
a:ASA-PHBA； b:ASA-PHPA； c:ASA-PHEA
2 讨 论
对聚天冬酰胺及其修饰材料的研究已引起国内外学者的兴趣[7～9]。70年代初G.Antoni[10]提出聚(2-羟乙基)天冬酰胺可作为一种新的血浆替代物，并对其进行了表征，推导出以水、DMF为溶剂的Mark-Houwink方程式。Claudia S Leopold[11]把聚天冬酰胺作为肠道药物载体，将地塞米松(Dexamethasone,DX)键入该材料上。Gaetano Giammana[12]对聚天冬酰胺作了大量的研究工作，选择了无水肼作为侧链基，制成了α、β-Polyasparthydrazid(PAH-
Y)，其具有良好的水溶性，奥弗莱克林(Ofloxacin)已键合于PAHY上，并有很好的临床意义。
, 百拇医药
本课题组的研究从材料和药物两个角度入手，一方面对已合成的材料进行修饰[13～15]，另一方面对药物进行筛选，只要药物结构中含有-N2H、-OH、-COOH的基团，通过化学方法处理后，都能够以化学键形式结合于高分子材料上，特别是对含有-COOH基团的药物，用本论文所报道的合成线路，可得到稳定的收率，对工业化生产将有很好的应用价值。
通过对材料急性毒性和稳定性的实验可知，聚天冬酰胺系列材料属低毒性材料，可利用开发为药物载体、药物辅料。在光照、恒定湿度下处稳定状态。温度过高则由于结构中大量羟基的存在，可能会发生分子间的缔合和缩合现象而导致表现分子量增大。从不同pH值的酸碱溶液对材料的影响来看，材料在强碱性和强酸性环境中易发生分解，而在中性和弱酸性环境中则能稳定存在。
棒状制剂与其它剂型(如悬浊剂)相比，在一定程度上可以减小释药物初期的“爆释”现象。从本实验的释放曲线来看，在兔体内释药三天后曲线已开始平稳。
, 百拇医药
侧链基长短对所键合药物的释放有较大的影响。美国犹它大学S.Kimt等曾报道了侧链基越长，释药越快。本实验的结果也可以看出，释药速率ASA-PHBA>ASA-PHPA>ASA-PHBA。说明侧链基越长，释药速率加快。这可能可以从两方面来解释，一是由于侧链烷基增加，亲脂性增加，母体易于被体液和酶分解而导致释药速率加快，二是以从空间位阻来看，侧链基增长对所链合的药物来说空间位阻相对减少，易于其在所占空间“浮动”，而导致释药加快。
* 国家自然科学基金资助项目(39570219)
参考文献
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2 汤谷平，陈启琪，吴筱丹.高分子药物的研究(Ⅰ)，炔诺酮-聚-α、β-(羟烷基)-DL-天冬酰胺高分子药物体外释放的研究.中国药物化学杂志，1994；4(1)∶28
, 百拇医药
3 陈启琪，刘向东，单达先.氟尿嘧啶-聚天冬酰胺复合物的合成.中国药物化学杂志，1993；3(3)∶163
4 单达先，朱加进，陈启琪.乙酰水杨酸-聚-α、β-(2-羟乙基)-DL-天冬酰胺共价复合物的合成.中国药物化学杂志.1994；4(4)∶279
5 汤谷平，单达先，陈启琪.高分子载体α、β-聚(羟烷基)-DL-天冬酰胺的合成及分子量测定.功能高分子学报，1994；7(4)∶445
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7 史宗洁，贺兰湘，高小海.以血卟啉为导向基团的高分子抗肿瘤药物的合成及其性能研究.中国医药工业杂志，1993；24(8)∶352
8 Peter R. Byron, Zhuang Sun, Hirokazu Katayama. Solute Absorption from the airways of the isolated rat lung. Ⅳ. Mechanisms of absorption of fluorophore-labeled Poly-α、β-TN-(2-hydroxyethyl)-DL-asparamide. Pharmaceutical Research, 1994; 11(2)∶221
, 百拇医药
9 Filipovic-Grcic J, Maysinger D, Zorc B. Macromolecular Prodrugs. Ⅳ. Alginate-chitosan microspheres of PHEA-L-dopa adduct. International Journal of Pharmaceutics, 1995; 116∶39
10 Antoni G, Neri P, Pedersen TG. Hydrodynamic Properties of a new plasma expander:Poly hydroxyethyl as partamide. Biopolymers, 1974; 13∶1721
11 Claudia S. Leopold, Darid R. Frieud. In Vitro study of the assessment of poly (L-aspartic acid) as a drug carrier for colon-specific drug delivery. International Journal of Pharmaceutics, 1995; 126∶139
, 百拇医药
12 Gaetano Giammona, Bianca Carlisi, Gennara Cavallaro. A new water-soluble synthetic polymer, α,β-polyasparthydrazid as potential plasma expander and drug carrier. Journal of Controlled Release, 1994; 29∶63
13 汤谷平，陈启琪，孙华瑜.生物降解性聚天冬氨酸-谷氨酸共聚物的合成及表征.浙江医科大学学报，1996； 25(2)∶95
14 汤谷平，陈启琪.生物降解性聚(羟丙基，丙基)-DC-天冬酰胺高聚物的合成及表征.生物医学工程学杂志，1997；14(2)∶99
15 汤谷平，陈启琪，单达先.乙酰水杨酸-聚天冬酰胺棒状药物体外释放的研究.中国医药工业杂志，1996；27(8)∶108
(收稿：1998-03-11), 百拇医药
单位：(浙江医科大学 药学系，杭州 310031)
关键词：聚天冬酰胺；羟烷基；乙酰水杨酸；体内释放
生物医学工程学杂志990407 摘要 以天冬氨酸为单体合成了聚天冬酰胺，用不同长度的羟烷基作为侧链基制成聚-α、β-(羟烷基)-DL-天冬酰胺。用红外光谱法，差热分析法对材料进行了表征；对材料的急性毒性、稳定性等作了研究，实验表明该类材料为低毒性材料，并有较好的稳定性。以乙酰水杨酸为模型药物，大白兔为实验动物进行体内释放实验，结果证明侧链基越长，释药速率加快。
A Water-soluble Synthetic Polymer, α,β-Poly(hydroxyalkyl)-
DL-Asparamide, and Conjugating Drug
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Zhang Zhijan Tang Guping Chen Qiqi Wang Bin Ma Mingming Zhang Xiaodong
(Department of Pharmacy, Zhejiang Medical University, Hangzhou 310031)
Abstract A water-soluble polymer α,β-poly (hydroxyalkyl)-DL-asparamide was synthesized by polysuccinimide(PSI) and different lengths of hydroxyalkyls, including α,β-poly(hydroxyethyl)-DL-asparamide(PHEA),α,β-poly(hydroxypropyl)-DL-asparamide(PHPA),and α,β-poly(hydroxybutyl)-DL-asparamide(PHBA). These polymers were characterized by differential scanning calorimetry(DSC) and infrared spectrophotometry(IR). Stability and acutetoxicity of these polymers were studied. The experiment indicated that these materials were of low-toxicity and high stability. Acetylsalicylic acid, as a model drug, was conjugated into polymers; the drug loadings were 38.63%, 37.68% and 38.70% respectively. Polymer drugs were made into cylinder, and in-vivo release in rabbits was set out. It showed that the longer the spacer was linked into the polymer, the faster the drug was released.
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Key words Polysuccinimide(PSI) Hydroxyalkyl Acetylsalicylic acid In-vivo release
Ringsdof[1]曾经就高分子载体药物提出模型，该模型包括：药、悬臂、输送基因，使整个高分子链能有溶解的基因。因此，对高分子材料侧链基的改性修饰，可以在一定程度上改变母体材料的性能。从药物释放的角度来看，键合的药物千变万化，他们的结构、基团均不相同，这就需要改变，调节侧链基的性能，包括对其长短、功能性、亲疏水性等多方面的调节，以达到所需键合药物的释放需要，而成为“智能型”材料。
课题组已对聚(羟烷基)-DL-天冬酰胺键合不同药物进行了报道[2～4]。我们以不同长度的羟烷基为侧链基(其中羟烷基分别为氨基乙醇、氨基丙醇、氨基丁醇)，对材料的急性毒性，光、温度、湿度pH值等对材料稳定性的影响作了系统的研究。将模型药物乙酰水杨酸键入材料上制成前体药物，并以棒剂为给药剂型进行了兔体内释放实验，比较不同长度的侧链基对药物释放的影响，结果与预计的相符。
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1 实验部分
1.1 仪器、药品与动物
红外分析仪(日本岛津公司)：高效液相色谱仪HPLC-6A(日本岛津公司)；热分析仪(美国PE公司)，天冬氨酸(上海试剂三厂，化学纯)；氨基乙醇(上海助剂厂，化学纯)，氨基丙醇(上海试剂一厂，化学纯)，氨基丁醇(本实验室合成，红外，核磁等鉴定)，水杨酸(上海青海新产品研究所，分析纯)，乙酰水杨酸(浙江衢州制药厂，分析纯)。INH小白鼠，纯种大白兔由浙江医科大学动物中心提供。
1.2 聚(羟烷基)-DL-天冬酰胺材料的合成
按文献[5]所报道的方法予以合成。
1.3 聚(羟烷基)-DL-天冬酰胺材料的表征
1.3.1 聚(羟烷基)-天冬酰胺的红外分析 图1是聚丁二酰亚胺、聚-α、β-(羟丁基)-DL-天冬酰及键合乙酰水杨酸的红外图谱。在2-a中，1770 cm-1、1705 cm-1为酰亚胺的υ C=O，3 200 cm-1为υ OH；在2-b中，3300 cm-1为υ OH强吸收峰，1645 cm-1、1540 cm-1为酰胺基中υ C-O、υ C-N强吸收；在2-c中，在1750 cm-1处有-C的υ C=O吸收。
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图1 高分子材料及控释药物的红外光谱
a:聚丁二酰亚胺；b:聚α，β-(4-羟丁基)-DL-天冬酰胺；
c:乙酰水杨酸-聚-α，β-(4-羟基-DL-天冬酰胺共价复合物)
Fig 1 The IR spectrum of polymer and controlled drug
a:polysuccinimide, PSI; b:PHBA; c:ASA PHBA
1.3.2 聚-(羟烷基)-DL-天冬酰胺及键合药物的差热分析 图2是PHBA和ASA-PHBA的差热分析图，由图可知模型药物乙酰水杨酸(ASA)已键合于高分子材料上。
, 百拇医药
图2 高分子材料及控释药物的热分析图
a：乙酰水杨酸；b：乙酰水杨酸-聚α，β-(3-羟丙基)-DL-天冬酰胺共价复合物；c：聚α，β-(3-羟丙基)-DL-天冬酰胺
Fig 2 The DSC curve of polymer and controlled drug
a:ASA; b:ASA-PHPA; c:PHPA
1.3.3 聚α、β-(羟烷基)-DL-天冬酰胺急性毒性试验 精密称取PHEA，PHPA，PHBA各9.050 g，用生理盐水18 ml加热溶解，使其浓度为0.5028 g/ml，冷却备用。取120只INH小白鼠，雌雄各半，重量约20 g，随机分组，每组8只，根据重量腹腔注射，观察PHEA、PHPA、PHBA的致死情况，用寇式法计算三种材料的最大致死量，他们分别是PHEA>19.53 g/kg，PHPA>15.03 g/kg，PHBA>11.72 g/kg。
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1.3.4 聚α、β-(羟烷基)-DL-天冬酰胺稳定性试验
(1)湿度对材料的影响 精密称取材料各3份，置于敞口小烧杯中，放在恒温培养箱中，维持培养箱内湿度在75%左右，温度为37 ℃，10 d后取出试样，进行凝胶色谱分析。图3为0 d和10 d材料PHPA的凝胶色谱图，由图可知材料在该环境下基本稳定。
图3 湿度对材料稳定性的影响
Fig 3 Effect of humidity on polymer stability
0 d和10 d材料的凝胶色谱图
The GPC of polymer in day 0 and day 10
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(2)光照对材料的影响 精密称取材料各8份，置于敞口烧杯中，用2000 LX以上的光照度照射，分别于第1、3、5、10 d各随机取出两份，称重，并用凝胶色谱测定分子量的变化。图4是以PHPA为例，表示光照时间与分子量的关系。
图4 光照对材料稳定性的影响
Fig 4 Effect of light on polymer stability
(3)温度对材料的影响 精密称取材料各6份，置于敞口烧杯中，分别放在40、60、80 ℃的恒温培养箱中，10 d后取出试样，进行凝胶色谱分析。图5是不同温度条件下材料分子量的变化情况。
, 百拇医药 图5 温度对材料稳定性的影响
Fig 5 Effect of temperature on polymer stability
(4)pH值对材料的影响 精密称取材料各6份在100 ml试剂瓶中，分别加入pH值为12，10，8，7.4，4.2的溶液50 ml，密闭，置于37 ℃恒温水浴中4 h，取出后分别用NaOH或HCl溶液调至pH=7，转移并定容至100 ml，进行凝胶色谱测定，图6是不同酸碱度对材料影响曲线。
图6 pH值对材料稳定性的影响
Fig 6 Effect of pH on polymer stability
1.4 聚α、β-(羟烷基)-DL-天冬酰胺键合药物试验
, 百拇医药
1.4.1 合成载体药物的合成 PHEA，PHPA，PHBA与乙酰水杨酸的合成按文献[6]报道的方法进行。
(1)标准曲线的制备 精密称取水杨酸(SA)98.4 mg，溶于0.1 mol/L NaOH溶液中，定容至100 ml容量瓶中，得浓度为0.984 mg/ml，分别精密移取标准液0.10、0.20、0.30、0.40、0.50 ml于25 ml容量瓶，定容至刻度，在295 nm波长处，用751G分光光度计上测定吸收值，得标准曲线为A=0.0322+0.102452C(r=0.999,n=5)。
(2)回收率测定 精密称取乙酰水杨酸(ASA)1.0 mg和1.5 mg，加入适量约3 mg高聚物于10 ml安瓿瓶中，加入8 ml 0.1 mol/L NaOH在沸水浴中煮沸2 h，冷却后转移入100 ml容量瓶中，加至刻度，混匀后在295 nm波长处测定吸收度，结果如表1所示。
, 百拇医药 * CASA(μg/ml)=CSA(μg/ml)×
表1 方法回收率(n=3)
Table 1 Recoveries of the method(n=3) Polymer-drug
Concentration add
(μg/ml)
Recovery
(%)
RSD
(%)
, http://www.100md.com
ASA-PHEA
乙酰水杨酸-α，β-(2-羟乙基)-DL-天冬酰胺共价复合物)
1.000
90.50
1.2
1.400
87.76
1.3
ASA-PHPA
乙酰水杨酸-α，β-(3-羟丙基)-DL-天冬酰胺共价复合物)
1.000
, http://www.100md.com
91.18
1.0
1.500
89.13
1.4
ASA-PHBA
乙酰水杨酸-α，β-(4-羟丁基)-DL-天冬酰胺共价复合物)
1.000
90.18
1.2
1.500
90.79
, 百拇医药
1.4
1.4.2 载药率的测定 精密称取ASA-PHEA，ASA-PHPA，ASA-PHBA样品各4 mg于10 ml安瓿瓶中，按回收率测定同样的方法进行操作，结果如表2所示。
表2 药物接入率的测定(n=3)
Table 2 The determination of drug-loadings (n=3) Polymer-drug
Drug-loading
(%)
RSD
(%)
ASA-PHEA
, 百拇医药
乙酰水杨酸-α，β-(2-羟乙基)-DL-天冬酰胺共价复合物)
38.63
1.5
ASA-PHPA
乙酰水杨酸-α，β-(3-羟丙基)-DL-天冬酰胺共价复合物)
37.68
1.4
ASA-PHBA
乙酰水杨酸-α，β-(4-羟丁基)-DL-天冬酰胺共价复合物)
38.70
1.4
, 百拇医药
1.4.3 高分子载体药物体内释放研究 色谱条件的建立：色谱柱为ODS，250×6 mmID，10 μm不锈钢Waster柱，流动相：0.072%H3PO4∶CH3OH∶CH3CN=215∶265∶20(v/v)，流速0.6 ml/min，检测波长295 nm，灵敏度：0.02，以苯甲酸为内标物。色谱图如图7所示。(其中1号峰为内标物苯甲酸，2号峰为水杨酸)。
图7 阿司匹林-聚天冬酰胺体内释放色谱图
a:血清的色谱图；b：标准和内标物在血清中色谱图；1号峰为内标物；2号峰为标准品；c:样品和内标物在血清中的色谱图，1号峰为内标物；2号峰为样品
Fig 7 Chromatogram of ASA-PHPA
, 百拇医药
a:chromatogram of serum; b:chromatogram of internal standard and standard; c:chromatagram of internal standard and sample
1.4.4 血样预处理和回收率 精密吸取一定浓度分别为0.4、1.6、6.4 μg/ml的ASA甲醇溶液100 μl，加空白血样0.6 μl，按血样预处理的方法操作，并进行HPLC测定，得血样回收率如表3所示，以PHPA为例。
表3 体内释放回收率
Table 3 Recoveries of release in vivo(n=3) Concentration add(μg/ml)
Recovery(%)
, 百拇医药 RSD(%)
0.400
96.20
1.0
1.600
97.75
2.9
6.400
95.80
1.1
1.4.5 体内释放实验 精密称取25 mg高分子载体药物，装入不锈钢模具，用50 kg/cm2压力压紧药物，在60 ℃温度下恒温10 min后，再次压紧药物，制得长5mm，直径1.5 mm的无色透明药棒，重新称重后药物损失小于5%。分别将接入率为38.6%的ADSA-PHEA，37.7%的ASA-PHPA，38.7%的ASA-PHBA压成棒状。
, 百拇医药
将9只2.5 kg左右的纯种大白兔随机分成三组，每只在背部皮下埋植三根(约70 mg)棒状药物。植药24 h后耳缘静脉定期采血。血样按上述血样预处理的方法处理，进行HPLC测定。观察给药两周的血药浓度，结果如图8所示。
图8 阿司匹林-聚天冬酰胺兔体内血药浓度释放曲线
a:乙酰水杨酸-聚α，β-(4-羟丁基)-DL-天冬酰胺共价复合物；b:乙酰水杨酸-聚α，β-(3-羟丙基)-DL-天冬酰胺共价复合物；c:乙酰水杨酸-聚α，β-(2-羟乙基)-DL-天冬酰胺共价复合物
Fig 8 Serum concentration of acetylsalicylic acid-poly-(hydroxyalkyl-)-DL-asparamide in rabbits given in
, 百拇医药
a:ASA-PHBA； b:ASA-PHPA； c:ASA-PHEA
2 讨 论
对聚天冬酰胺及其修饰材料的研究已引起国内外学者的兴趣[7～9]。70年代初G.Antoni[10]提出聚(2-羟乙基)天冬酰胺可作为一种新的血浆替代物，并对其进行了表征，推导出以水、DMF为溶剂的Mark-Houwink方程式。Claudia S Leopold[11]把聚天冬酰胺作为肠道药物载体，将地塞米松(Dexamethasone,DX)键入该材料上。Gaetano Giammana[12]对聚天冬酰胺作了大量的研究工作，选择了无水肼作为侧链基，制成了α、β-Polyasparthydrazid(PAH-
Y)，其具有良好的水溶性，奥弗莱克林(Ofloxacin)已键合于PAHY上，并有很好的临床意义。
, 百拇医药
本课题组的研究从材料和药物两个角度入手，一方面对已合成的材料进行修饰[13～15]，另一方面对药物进行筛选，只要药物结构中含有-N2H、-OH、-COOH的基团，通过化学方法处理后，都能够以化学键形式结合于高分子材料上，特别是对含有-COOH基团的药物，用本论文所报道的合成线路，可得到稳定的收率，对工业化生产将有很好的应用价值。
通过对材料急性毒性和稳定性的实验可知，聚天冬酰胺系列材料属低毒性材料，可利用开发为药物载体、药物辅料。在光照、恒定湿度下处稳定状态。温度过高则由于结构中大量羟基的存在，可能会发生分子间的缔合和缩合现象而导致表现分子量增大。从不同pH值的酸碱溶液对材料的影响来看，材料在强碱性和强酸性环境中易发生分解，而在中性和弱酸性环境中则能稳定存在。
棒状制剂与其它剂型(如悬浊剂)相比，在一定程度上可以减小释药物初期的“爆释”现象。从本实验的释放曲线来看，在兔体内释药三天后曲线已开始平稳。
, 百拇医药
侧链基长短对所键合药物的释放有较大的影响。美国犹它大学S.Kimt等曾报道了侧链基越长，释药越快。本实验的结果也可以看出，释药速率ASA-PHBA>ASA-PHPA>ASA-PHBA。说明侧链基越长，释药速率加快。这可能可以从两方面来解释，一是由于侧链烷基增加，亲脂性增加，母体易于被体液和酶分解而导致释药速率加快，二是以从空间位阻来看，侧链基增长对所链合的药物来说空间位阻相对减少，易于其在所占空间“浮动”，而导致释药加快。
* 国家自然科学基金资助项目(39570219)
参考文献
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2 汤谷平，陈启琪，吴筱丹.高分子药物的研究(Ⅰ)，炔诺酮-聚-α、β-(羟烷基)-DL-天冬酰胺高分子药物体外释放的研究.中国药物化学杂志，1994；4(1)∶28
, 百拇医药
3 陈启琪，刘向东，单达先.氟尿嘧啶-聚天冬酰胺复合物的合成.中国药物化学杂志，1993；3(3)∶163
4 单达先，朱加进，陈启琪.乙酰水杨酸-聚-α、β-(2-羟乙基)-DL-天冬酰胺共价复合物的合成.中国药物化学杂志.1994；4(4)∶279
5 汤谷平，单达先，陈启琪.高分子载体α、β-聚(羟烷基)-DL-天冬酰胺的合成及分子量测定.功能高分子学报，1994；7(4)∶445
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, 百拇医药
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10 Antoni G, Neri P, Pedersen TG. Hydrodynamic Properties of a new plasma expander:Poly hydroxyethyl as partamide. Biopolymers, 1974; 13∶1721
11 Claudia S. Leopold, Darid R. Frieud. In Vitro study of the assessment of poly (L-aspartic acid) as a drug carrier for colon-specific drug delivery. International Journal of Pharmaceutics, 1995; 126∶139
, 百拇医药
12 Gaetano Giammona, Bianca Carlisi, Gennara Cavallaro. A new water-soluble synthetic polymer, α,β-polyasparthydrazid as potential plasma expander and drug carrier. Journal of Controlled Release, 1994; 29∶63
13 汤谷平，陈启琪，孙华瑜.生物降解性聚天冬氨酸-谷氨酸共聚物的合成及表征.浙江医科大学学报，1996； 25(2)∶95
14 汤谷平，陈启琪.生物降解性聚(羟丙基，丙基)-DC-天冬酰胺高聚物的合成及表征.生物医学工程学杂志，1997；14(2)∶99
15 汤谷平，陈启琪，单达先.乙酰水杨酸-聚天冬酰胺棒状药物体外释放的研究.中国医药工业杂志，1996；27(8)∶108
(收稿：1998-03-11), 百拇医药