聚(丙基，3-羟丙基)DL-天冬酰胺的体内外降解及键合阿司匹林复合物的释放行为的研究*
作者：周 涛 王 斌 汤谷平 陈启琪
单位：周 涛 (宁波大学 食工系，宁波 315211)；王 斌 汤谷平 陈启琪 (浙江医科大学 药学院，杭州 310006)
关键词：聚天冬酰胺；阿司匹林；体外；体内；降解；释放
生物医学工程学杂志990406 摘要 选用两种不同亲疏水性的聚天冬酰胺修饰材料进行体内外降解实验，研究结果表明，聚天冬酰胺材料的降解过程系酶解，材料的亲疏水性不同，则在体内的降解速度不同，同种材料在埋植部位、肾、肝中的代谢速度也不同。对两种材料的键合阿司匹林复合物的体内外释放试验表明，酶解有利于药物的释放，材料的亲脂性增加有利于药物的释放。
Studies on Degradation of Poly-(propyl, 3-hydroxypropyl)-DL-
, 百拇医药
asparamide and Release of Conjugate Linking
Aspirin in Vivo and in Vitro
Zhou Tao1 Wang Bin2 Tang Guping2 Chen Qiqi2
1 (Department of Food Science and Engineering, Ningbo University, Ningbo 315211)
2 (Pharmacy College, Zhejiang Medical University, Hangzhou 310006)
Abstract Two polyasparamide derivants having different hydrophilicities were selected to be degraded in vivo and in vitro. The results demonstrate that the degradation process of polyasparamide is enzymatic hydrolysis. Materials with different hydrophobicities are different in degradation rate and the same material has different metabolic rates in the planting position, kidney and liver. The release results of two polymeric drugs indicate that protease is of advantage to release of drug, and hydrophobicity of material is also an advantage to the release.
, 百拇医药
Key words Polyasparamide Aspirin In vitro In vivo Degradation Release
1 引 言
聚天冬酰胺是生物降解性优良的高分子材料[1]，由于其毒性低，生物相容性好，合成路线简单，产率高，且可在其母体上引入不同链长，含不同亲疏水性基团的侧链，赋于材料不同的性质，如荷电性及亲水性、亲脂性，最终使材料具有不同的生物降解性和药物透过性，满足多种药物的释放需要，在长效控释药物中具有良好的应用前景，因此成为目前医用高分子领域的研究热点之一。国内外已有不少关于这方面工作的报道[1～6]。课题组合成了各种不同亲疏水性的聚天冬酰胺修饰材料及键合阿司匹林复合物[7]，本文在此基础上，试图通过模拟体内环境，对材料进行体外降解，以及通过小鼠体内的降解试验，初步探讨材料的亲疏水性与其生物降解性的内在联系；通过对两种高分子药物的体内外释放试验，探讨药物的释放规律。
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2 实验部分
2.1 材料及仪器
2.1.1 材料 聚(丙基，3-羟丙基)DL-天冬酰胺(PHPPA)及键合阿司匹林复合物(ASA-PHPPA)均由课题组合成[7]，PHPPA-7∶3和PHPPA-3∶7的分子量分别为8.01万和8.28万，ASA-PHPPA-7∶3和ASA-PHPPA-3∶7的阿司匹林接入率分别为31.53%和42.34%；胰蛋白酶(Trypsin)，Serva公司，1∶250；木瓜蛋白酶(Papain)，E.M.K进口分装，6 000 usp*u/mg；ICR品系雌性小白鼠(重20～30g)及纯种大白兔(重2.1～2.7kg)均由浙江医科大学实验动物中心提供。
2.1.2 仪器 LC-6A高效液相色谱仪(日本岛津公司)；UV-2000紫外-可见分光光度计(日本日立公司)。
, http://www.100md.com 2.2 方法与结果
2.2.1 酶活力测定[8] 在pH为7.5，浓度为0.02 mol/l的磷酸缓冲液(PBS)中，温度为37 ℃时，测得胰蛋白酶和木瓜蛋白酶的初始活力分别为22.8万u/g和4.5万u/g；在浓度为0.5 mg/ml的ASA-PHPPA-7∶3存在下，酶浓度为0.2 mg/ml时，胰蛋白酶在1、3、5 d后的残存活力百分率分别为50.9%、34.2%、22.0%；木瓜蛋白酶分别为56.3%、38.5%、25.3%。
2.2.2 高分子材料的体外酶解 称取一定量的PHPPA-7∶3和PHPPA-3∶7各二份于具塞广口瓶，分别加入50 ml酶-缓冲液，置于37 ℃恒温水槽。胰蛋白酶和木瓜蛋白酶浓度均为0.1 mg/ml，缓冲液均为pH 7.5的0.02 mol/L磷酸缓冲液。取不同反应时间的反应液1 ml经沸水浴杀酶后，再经0.45 μ滤膜过滤，用凝胶色谱法(GPC)测定降解片段的分子量(结果见表1)。
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色谱条件：岛津Diol-150柱φ7.9 mm×25 cm，流动相为重蒸水，差示折光检测，流速0.6 ml/min，柱温35 ℃。
表1 PHPPA在胰蛋白酶和木瓜蛋白酶中主要降解片段的相对分子量(×104)
Table 1 Relative molecular-weight of main degraded fragment of PHPPA in trypsin and papain (×104) Time(d)
时间(天)
PHPPA-7∶3 in trypsin
PHPPA-7∶3在
胰蛋白酶中
, 百拇医药
PHPPA-3∶7 in trypsin
PHPPA-3∶7在
胰蛋白酶中
PHPPA-7∶3 in papain
PHPPA-7∶3在
木瓜蛋白酶中
PHPPA-3∶7 in papain
PHPPA-3∶7在
木瓜蛋白酶中
1
0.86
, 百拇医药
1.52
0.84
0.83
3
0.33,0.27
1.43
2.21,1.00,0.92
1.87,0.27
5
0.33
1.53,1.48,1.27
0.92,0.29
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0.92,0.80,0.26
1.13,1.03,0.94
2.2.3 高分子材料对机体的影响及体内降解试验 将PHPPA在液压机上压成棒状，压力为6 MPa/cm2，药棒直径约3 mm，长度约5 mm，重约45～50 mg。将药棒植入小鼠背部皮下，另取数只小鼠作对照，每隔一周处理一批小鼠。眼眶采血，做血常规(Blood Rt)检查，取血浆测定谷丙转氨酶(GPT)活力及肌酐(Cr)含量以检查肝、肾功能(结果见表2)；取肝、肾及埋植部位皮肤经捣碎匀浆，用蒸馏水超声提取1 h，离心，取上清液经0.45 μ滤膜过滤，进行凝胶色谱分析，检测高聚物在体内的降解情况。色谱条件同2.2.2。图1为小鼠各组织匀浆上清液的凝胶色谱图，两种材料的主要降解片段的相对分子量见表3。表2 小鼠的血常规谷丙转氨酶和肌酐指标(A：埋药组，n=12；B：对照组，n=4)
Table 2 Blood routine,GPT and Cr of mice(A：Plant group,n=12;B:Blank group, n=4) Time(d)
, 百拇医药
时间(天)
Hb(g/100ml blood)
血色素(g/100ml血)
WBC(number/mm3)
白细胞(个/mm3)
GPT(u/L)
谷丙转氨酶(u/L)
Cr(μmol/L)
肌酐(μmol/L)
A
B
, 百拇医药
A
B
A
B
A
B
6
13.5
13.2
11100
10200
23.5
29.0
, 百拇医药 20.5
22.4
13
13.2
14.0
11800
11300
37.7
43.4
21.1
25.2
20
13.1
, http://www.100md.com
12.6
12900
15600
44.7
41.8
24.3
40.3
27
13.4
13.1
16000
15500
41.3
, 百拇医药
37.8
38.6
37.3
34
13.2
13.6
14300
11300
45.9
37.4
19.6
9.2
表3 PHPPA在小鼠体内主要降解片段的相对分子量(×104)
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Table 3 Relative molecular-weight of main degraded fragment of PHPPA in vivo (×104) Time(d)
时间(天)
PHPPA-7∶3
Planting position
埋植部位
Kidney
肾
Liver
肝
PHPPA-3∶7
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Planting position
埋植部位
Kidney
肾
Liver
肝
13
6.58,4.21,1.83,1.51,1.35,1.18,1.18,1.08,0.20
4.24,1.23
3.52,3.29
1.19
3.53,1.53
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0.62,0.17
20
1.08
1.08,0.86
0.81
4.71
2.18,1.25
3.70,1.80,1.32
1.14,0.77
27
-
-
, http://www.100md.com 5.02
-
3.28,1.77,0.42,0.17
3.04,1.06
0.16
图1 埋植PHPPA-7∶3的小鼠的埋药部位(A)，肾(B)，肝(C)的凝胶色谱图(a:0 day，b:13 days,C:27 days)
Fig 1 GPC of planting position(A),kidney(B),liver(C) of mice planted PHPPA-7∶3(a:0 day,b:13 days, c:27 days)
, 百拇医药
2.2.4 ASA-PHPPA的体外释放试验 将ASA-PHPPA-7∶3和ASA-PHPPA-3∶7压成棒状，压力为6 MPa/cm2，药棒直径约3 mm，重约50～65 mg。两种药棒各用胰蛋白酶-缓冲液及缓冲液作为释放体系，酶浓度为0.1 mg/ml，缓冲液为pH7.5的0.02 mol/L磷酸缓冲液，温度37 ℃。在预定时间用3号沙芯滤器抽干释放液，另外补充新鲜释放液，用高效液相色谱测定释放液中水杨酸(SA)的含量。
色谱条件：色谱柱为ODS，250×6 mmID，10 μ不锈钢Waters柱；检测波长302 nm；流动相为甲醇∶水∶冰乙酸=55∶45∶2；流速0.8 ml/min；柱温40 ℃。图2为胰蛋白酶磷酸缓冲液、水杨酸标准品、药物释放液的HPLC图谱。
图2 胰蛋白酶磷酸缓冲液(a)，标准水杨酸(b)，释放液(c)的高效液相色谱图
, 百拇医药
Fig 2 HPLC of Trypsin-PBS(a),Standard SA(b),Release solution(c)
标准曲线的绘制：精确配制一系列不同浓度的水杨酸标准溶液，在HPLC上测定其吸收峰面积A，经回归得标准曲线方程为：
A=-73.5+4469.2c(r=0.9996,n=6)。
方法回收率测定：配制浓度为0.3、1.5、7.5 μg/ml的水杨酸溶液，在HPLC上测定其浓度，计算方法回收率，结果见表4。
表4 药物体外释放回收率(n=3)
Table 4 Recoveries of drug release in vitro(n=3) Concentration of SA
, 百拇医药
added (μg/ml)
SA加样浓度(μg/ml)
Concentration of SA
determined(μg/ml)
实测SA浓度(μg/ml)
Recovery
(%)
回收率(%)
SD
0.3
0.298
99.22
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1.07
1.5
1.463
97.56
1.10
7.5
7.525
100.33
0.77
图3 ASA-PHPPA-7∶3(a)和ASA-PHPPA-3∶7(b)在胰蛋白酶中的释放曲线
Fig 3 Release profile of ASA-PHPPA-7∶3(a) and ASA-PHPPA-3∶7(b) in trypsin
, 百拇医药
图4 ASA-PHPPA-7∶3(a)和ASA-PHPPA-3∶7(b)在磷酸缓冲液中的释放曲线
Fig 4 Release profile of ASA-PHPPA-7∶3(a) and ASA-PHPPA-3∶7(b) in PBS
2.2.5 ASA-PHPPA的体内释放试验 将ASA-PHPPA-7∶3和ASA-PHPPA-3∶7压成药棒，压力为6 MPa/cm2，药棒直径约3 mm，重约70 mg。在兔子背部皮下植入210～220 mg药棒，定期耳缘采血。用HPLC法测定血浆中阿司匹林(ASA)含量。测定方法同标准曲线绘制，以埋药血浆代替空白血浆，不加SA标准液，其余步骤相同，结果见图8。色谱条件同2.2.4。
标准曲线绘制：取空白血浆1 ml于10 ml容量瓶，分别加入0.1 ml浓度依次为16、32、64、128、256、512 μg/ml的水杨酸甲醇溶液，加0.1 mol/L NaOH 2 ml，置85 ℃水浴3 h，然后滴入6 mol/L HCl酸化，再用甲醇稀释至刻度，得到浓度为0.16、0.32、0.64、1.28、2.56、5.12 μg/ml的SA标准液，经0.45 μ滤膜过滤，进行HPLC测定。根据测得的峰面积A和SA的浓度c得回归方程为：A=-52.6+3744.8c(r=0.9989,n=6)。
, 百拇医药
加样回收率测定：方法同标准曲线绘制，以浓度为50、250 μg/ml ASA甲醇溶液代替SA甲醇溶液，其余步骤相同。将测得的SA浓度换算成ASA浓度，结果见表5。
表5 ASA加样回收率(n=3)
Table 5 Recoveries of ASA added (n=3) Concentration of ASA
added (μg/ml)
ASA加样浓度(μg/ml)
Concentration of ASA
determined(μg/ml)
ASA实测浓度(μg/ml)
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Recovery
(%)
回收率(%)
SD
0.5
0.500
100.10
5.16
2.5
2.417
96.67
0.88
3 讨 论
, 百拇医药
3.1 PHPPA的生物降解性及对机体的影响
胰蛋白酶和木瓜蛋白酶都是肽链内切酶，胰蛋白酶存在于胰液中，木瓜蛋白酶是组织蛋白酶的类似物，我们选择这两种酶作为体外降解用酶。实验结果表明，两种材料在这两种酶中都能发生降解。因此认为PHPPA在体内的生物降解也是酶解过程。这一结果与国外一些学者的观点相符[9]。
图5 ASA-PHPPA-7∶3在胰蛋白酶(a)和磷酸缓冲液(b)中的累积释放曲线
Fig 5 Accumulated release curve of ASA-PHPPA-7∶3 in trypsin(a),PBS(b)
, 百拇医药
图6 ASA-PHPPA-3∶7在胰蛋白酶(a)和磷酸缓冲液(b)中的累积释放曲线
Fig 6 Accumulated release curve of ASA-PHPPA-3∶7 in trypsin(a),PBS(b)
图7 兔血浆(a)，血浆中的标准SA(b)和血样中SA(c)的高效液相色谱图
Fig 7 HPLC of plasma(a),standard SA in plasma(b) and SA in sample(c)
图8 ASA-PHPPA-7∶3(a)和ASA-PHPPA-3∶7(b)在兔体中的释放曲线
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Fig 8 Release profile of ASA-PHPPA-7∶3(a) and ASA-PHPPA-3∶7(b) in rabbit
由表3可知，PHPPA-7∶3植入小鼠皮下二至三周内，在埋植部位、肾、肝中都能检测到其降解片段的存在，约一个月后，在埋植部位及肾中已检测不到，但在肝中尚能检测到，表明PHPPA在肝中代谢稍慢；PHPPA-3∶7植入皮下约四周后，在肾、肝中都能检测到其降解片段，在埋植部位检测不到。这表明同种材料在不同组织中的代谢速度不同，似乎也提示脂溶性大的PHPPA在体内生物降解更快些，这可能是由于脂溶性大的材料更易透过生物膜进入细胞，在组织蛋白酶催化下降解，但尚需进一步实验加以确证。
表2结果表明，PHPPA对小鼠的血色素无影响，白血球、GPT及肌酐虽由于个体差异有一定程度的变化，但从80只小鼠的统计结果来看，与空白对照组小鼠相比也无显著影响，表明了该材料的良好生物相容性。
, 百拇医药
3.2 ASA-PHPPA的释放
高分子药物ASA-PHPPA的体外释放应始终处于“漏槽”状态，以不影响药物的释放。由图3、图4可知，药物释放初始有一释药冲击量，在一周以后渐趋平稳，这是由于药棒表面的药物直接与释放介质接触，很容易被水解下来，故有一释药冲击量，而内部的药物必须由水通过药棒间隙进入才能水解下来，故速度较慢。
由于高分子药物的体外释放存在着冲击量，故将其体外累积释放曲线(图5、图6)分为爆释相(0～4 d)和缓释相(4 d以后)，并对其分别进行拟合回归，得四条双相双指数回归方程，ASA-PHPPA-7∶3在胰蛋白酶和PBS中的累积释放分别符合方程：y=3.056e0.04294t+3.6341e0.000961t(r=0.9931,r=0.9987)
y=2.9959e0.04108t+3.4506e0.000977t(r=0.8076,r=0.9974)
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ASA-PHPPA-3∶7的累积释放分别符合
y=1.7973e0.04121t+2.1276e0.000617t(r=0.9437,r=0.9980)
y=1.3886e0.03798t+1.5755e0.000747t(r=0.8009,r=0.9941)
采用两两间多重比较的T检验法，对缓释相的四条累积释放曲线进行方差分析，结果表明两两之间存在显著性差异，即高分子材料的亲疏水性及有无蛋白酶存在对药物释放速度有显著影响。两种高分子药物在胰蛋白酶缓冲液中的释放速度均快于在缓冲液中的释放，这可能是由于酶对材料的降解作用，使药物更易暴露出来被水解；而ASA-PHPPA-7∶3在两种介质中的释放均快于ASA-PHPPA-3∶7，表明材料的脂溶性增加有利于药物的释放，体内释放实验也得到同样结果，这为解决目前存在的释药过缓的问题提供了依据。
, 百拇医药
* 国家自然科学基金资助项目(浙医大承担)
参考文献
1 Filipovic-Grcic J, Maysinger D, Zorc B. Macromolecular prodrugs. Ⅳ.Alginate-chitosan microspheres of PHEA-L-dopa adduct. International Journal of Pharmaceutics, 1995; 116∶39
2 Gaetano Giammona, Vincenzo Tomarchio, Giovanna Pitarresi. Glycidyl methacrylate derivatization of α,β-Poly(N-hydroxyethyl)-DL-aspartamide and α,β-Polyasparthydrazide. Polymer, 1997; 38(13)∶3315
, 百拇医药
3 Peter R. Byron, Zhuang Sun, Hirokazu Katayama. Solute Absorption of fluorophore-labeled Poly-α,β-N(2-hydroxyethyl)-DL-asparamide. Pharmaceutical Research, 1994; 11(2)∶221
4 杨江丰，陈启琪，徐宗藩.炔诺酮-聚天冬酰胺共价复合物体外释放的研究.浙江医科大学学报，1992；21(6)∶248
5 陈启琪，汤谷平，单达先等.炔诺酮-聚天冬酰胺共价复合体水解动力学的研究及炔诺酮含量测定.浙江医科大学学报，1993；22(5)∶199
6 陈启琪，刘向东，单达先等.氟尿嘧啶-聚天冬酰胺复合体的合成.中国药物化学杂志，1993；3(3)∶163
7 周 涛，王 斌，汤谷平等.α，β-聚-DL-天冬酰胺修饰材料及键合阿司匹林共价复合体的合成与表征.宁波大学学报，1998；11(1)∶61
8 北京师范大学生物系.基础生物化学实验.北京：高等教育出版社，1982
9 Dickinson HR. Biodegradation of a poly-(α-amino acid) hydrogel Ⅱ in vitro. J Biomed Mater Res, 1981; 15∶591
(收稿：1998-03-30 修回：1998-12-08), http://www.100md.com
单位：周 涛 (宁波大学 食工系，宁波 315211)；王 斌 汤谷平 陈启琪 (浙江医科大学 药学院，杭州 310006)
关键词：聚天冬酰胺；阿司匹林；体外；体内；降解；释放
生物医学工程学杂志990406 摘要 选用两种不同亲疏水性的聚天冬酰胺修饰材料进行体内外降解实验，研究结果表明，聚天冬酰胺材料的降解过程系酶解，材料的亲疏水性不同，则在体内的降解速度不同，同种材料在埋植部位、肾、肝中的代谢速度也不同。对两种材料的键合阿司匹林复合物的体内外释放试验表明，酶解有利于药物的释放，材料的亲脂性增加有利于药物的释放。
Studies on Degradation of Poly-(propyl, 3-hydroxypropyl)-DL-
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asparamide and Release of Conjugate Linking
Aspirin in Vivo and in Vitro
Zhou Tao1 Wang Bin2 Tang Guping2 Chen Qiqi2
1 (Department of Food Science and Engineering, Ningbo University, Ningbo 315211)
2 (Pharmacy College, Zhejiang Medical University, Hangzhou 310006)
Abstract Two polyasparamide derivants having different hydrophilicities were selected to be degraded in vivo and in vitro. The results demonstrate that the degradation process of polyasparamide is enzymatic hydrolysis. Materials with different hydrophobicities are different in degradation rate and the same material has different metabolic rates in the planting position, kidney and liver. The release results of two polymeric drugs indicate that protease is of advantage to release of drug, and hydrophobicity of material is also an advantage to the release.
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Key words Polyasparamide Aspirin In vitro In vivo Degradation Release
1 引 言
聚天冬酰胺是生物降解性优良的高分子材料[1]，由于其毒性低，生物相容性好，合成路线简单，产率高，且可在其母体上引入不同链长，含不同亲疏水性基团的侧链，赋于材料不同的性质，如荷电性及亲水性、亲脂性，最终使材料具有不同的生物降解性和药物透过性，满足多种药物的释放需要，在长效控释药物中具有良好的应用前景，因此成为目前医用高分子领域的研究热点之一。国内外已有不少关于这方面工作的报道[1～6]。课题组合成了各种不同亲疏水性的聚天冬酰胺修饰材料及键合阿司匹林复合物[7]，本文在此基础上，试图通过模拟体内环境，对材料进行体外降解，以及通过小鼠体内的降解试验，初步探讨材料的亲疏水性与其生物降解性的内在联系；通过对两种高分子药物的体内外释放试验，探讨药物的释放规律。
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2 实验部分
2.1 材料及仪器
2.1.1 材料 聚(丙基，3-羟丙基)DL-天冬酰胺(PHPPA)及键合阿司匹林复合物(ASA-PHPPA)均由课题组合成[7]，PHPPA-7∶3和PHPPA-3∶7的分子量分别为8.01万和8.28万，ASA-PHPPA-7∶3和ASA-PHPPA-3∶7的阿司匹林接入率分别为31.53%和42.34%；胰蛋白酶(Trypsin)，Serva公司，1∶250；木瓜蛋白酶(Papain)，E.M.K进口分装，6 000 usp*u/mg；ICR品系雌性小白鼠(重20～30g)及纯种大白兔(重2.1～2.7kg)均由浙江医科大学实验动物中心提供。
2.1.2 仪器 LC-6A高效液相色谱仪(日本岛津公司)；UV-2000紫外-可见分光光度计(日本日立公司)。
, http://www.100md.com 2.2 方法与结果
2.2.1 酶活力测定[8] 在pH为7.5，浓度为0.02 mol/l的磷酸缓冲液(PBS)中，温度为37 ℃时，测得胰蛋白酶和木瓜蛋白酶的初始活力分别为22.8万u/g和4.5万u/g；在浓度为0.5 mg/ml的ASA-PHPPA-7∶3存在下，酶浓度为0.2 mg/ml时，胰蛋白酶在1、3、5 d后的残存活力百分率分别为50.9%、34.2%、22.0%；木瓜蛋白酶分别为56.3%、38.5%、25.3%。
2.2.2 高分子材料的体外酶解 称取一定量的PHPPA-7∶3和PHPPA-3∶7各二份于具塞广口瓶，分别加入50 ml酶-缓冲液，置于37 ℃恒温水槽。胰蛋白酶和木瓜蛋白酶浓度均为0.1 mg/ml，缓冲液均为pH 7.5的0.02 mol/L磷酸缓冲液。取不同反应时间的反应液1 ml经沸水浴杀酶后，再经0.45 μ滤膜过滤，用凝胶色谱法(GPC)测定降解片段的分子量(结果见表1)。
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色谱条件：岛津Diol-150柱φ7.9 mm×25 cm，流动相为重蒸水，差示折光检测，流速0.6 ml/min，柱温35 ℃。
表1 PHPPA在胰蛋白酶和木瓜蛋白酶中主要降解片段的相对分子量(×104)
Table 1 Relative molecular-weight of main degraded fragment of PHPPA in trypsin and papain (×104) Time(d)
时间(天)
PHPPA-7∶3 in trypsin
PHPPA-7∶3在
胰蛋白酶中
, 百拇医药
PHPPA-3∶7 in trypsin
PHPPA-3∶7在
胰蛋白酶中
PHPPA-7∶3 in papain
PHPPA-7∶3在
木瓜蛋白酶中
PHPPA-3∶7 in papain
PHPPA-3∶7在
木瓜蛋白酶中
1
0.86
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1.52
0.84
0.83
3
0.33,0.27
1.43
2.21,1.00,0.92
1.87,0.27
5
0.33
1.53,1.48,1.27
0.92,0.29
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0.92,0.80,0.26
1.13,1.03,0.94
2.2.3 高分子材料对机体的影响及体内降解试验 将PHPPA在液压机上压成棒状，压力为6 MPa/cm2，药棒直径约3 mm，长度约5 mm，重约45～50 mg。将药棒植入小鼠背部皮下，另取数只小鼠作对照，每隔一周处理一批小鼠。眼眶采血，做血常规(Blood Rt)检查，取血浆测定谷丙转氨酶(GPT)活力及肌酐(Cr)含量以检查肝、肾功能(结果见表2)；取肝、肾及埋植部位皮肤经捣碎匀浆，用蒸馏水超声提取1 h，离心，取上清液经0.45 μ滤膜过滤，进行凝胶色谱分析，检测高聚物在体内的降解情况。色谱条件同2.2.2。图1为小鼠各组织匀浆上清液的凝胶色谱图，两种材料的主要降解片段的相对分子量见表3。表2 小鼠的血常规谷丙转氨酶和肌酐指标(A：埋药组，n=12；B：对照组，n=4)
Table 2 Blood routine,GPT and Cr of mice(A：Plant group,n=12;B:Blank group, n=4) Time(d)
, 百拇医药
时间(天)
Hb(g/100ml blood)
血色素(g/100ml血)
WBC(number/mm3)
白细胞(个/mm3)
GPT(u/L)
谷丙转氨酶(u/L)
Cr(μmol/L)
肌酐(μmol/L)
A
B
, 百拇医药
A
B
A
B
A
B
6
13.5
13.2
11100
10200
23.5
29.0
, 百拇医药 20.5
22.4
13
13.2
14.0
11800
11300
37.7
43.4
21.1
25.2
20
13.1
, http://www.100md.com
12.6
12900
15600
44.7
41.8
24.3
40.3
27
13.4
13.1
16000
15500
41.3
, 百拇医药
37.8
38.6
37.3
34
13.2
13.6
14300
11300
45.9
37.4
19.6
9.2
表3 PHPPA在小鼠体内主要降解片段的相对分子量(×104)
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Table 3 Relative molecular-weight of main degraded fragment of PHPPA in vivo (×104) Time(d)
时间(天)
PHPPA-7∶3
Planting position
埋植部位
Kidney
肾
Liver
肝
PHPPA-3∶7
, http://www.100md.com
Planting position
埋植部位
Kidney
肾
Liver
肝
13
6.58,4.21,1.83,1.51,1.35,1.18,1.18,1.08,0.20
4.24,1.23
3.52,3.29
1.19
3.53,1.53
, http://www.100md.com
0.62,0.17
20
1.08
1.08,0.86
0.81
4.71
2.18,1.25
3.70,1.80,1.32
1.14,0.77
27
-
-
, http://www.100md.com 5.02
-
3.28,1.77,0.42,0.17
3.04,1.06
0.16
图1 埋植PHPPA-7∶3的小鼠的埋药部位(A)，肾(B)，肝(C)的凝胶色谱图(a:0 day，b:13 days,C:27 days)
Fig 1 GPC of planting position(A),kidney(B),liver(C) of mice planted PHPPA-7∶3(a:0 day,b:13 days, c:27 days)
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2.2.4 ASA-PHPPA的体外释放试验 将ASA-PHPPA-7∶3和ASA-PHPPA-3∶7压成棒状，压力为6 MPa/cm2，药棒直径约3 mm，重约50～65 mg。两种药棒各用胰蛋白酶-缓冲液及缓冲液作为释放体系，酶浓度为0.1 mg/ml，缓冲液为pH7.5的0.02 mol/L磷酸缓冲液，温度37 ℃。在预定时间用3号沙芯滤器抽干释放液，另外补充新鲜释放液，用高效液相色谱测定释放液中水杨酸(SA)的含量。
色谱条件：色谱柱为ODS，250×6 mmID，10 μ不锈钢Waters柱；检测波长302 nm；流动相为甲醇∶水∶冰乙酸=55∶45∶2；流速0.8 ml/min；柱温40 ℃。图2为胰蛋白酶磷酸缓冲液、水杨酸标准品、药物释放液的HPLC图谱。
图2 胰蛋白酶磷酸缓冲液(a)，标准水杨酸(b)，释放液(c)的高效液相色谱图
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Fig 2 HPLC of Trypsin-PBS(a),Standard SA(b),Release solution(c)
标准曲线的绘制：精确配制一系列不同浓度的水杨酸标准溶液，在HPLC上测定其吸收峰面积A，经回归得标准曲线方程为：
A=-73.5+4469.2c(r=0.9996,n=6)。
方法回收率测定：配制浓度为0.3、1.5、7.5 μg/ml的水杨酸溶液，在HPLC上测定其浓度，计算方法回收率，结果见表4。
表4 药物体外释放回收率(n=3)
Table 4 Recoveries of drug release in vitro(n=3) Concentration of SA
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added (μg/ml)
SA加样浓度(μg/ml)
Concentration of SA
determined(μg/ml)
实测SA浓度(μg/ml)
Recovery
(%)
回收率(%)
SD
0.3
0.298
99.22
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1.07
1.5
1.463
97.56
1.10
7.5
7.525
100.33
0.77
图3 ASA-PHPPA-7∶3(a)和ASA-PHPPA-3∶7(b)在胰蛋白酶中的释放曲线
Fig 3 Release profile of ASA-PHPPA-7∶3(a) and ASA-PHPPA-3∶7(b) in trypsin
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图4 ASA-PHPPA-7∶3(a)和ASA-PHPPA-3∶7(b)在磷酸缓冲液中的释放曲线
Fig 4 Release profile of ASA-PHPPA-7∶3(a) and ASA-PHPPA-3∶7(b) in PBS
2.2.5 ASA-PHPPA的体内释放试验 将ASA-PHPPA-7∶3和ASA-PHPPA-3∶7压成药棒，压力为6 MPa/cm2，药棒直径约3 mm，重约70 mg。在兔子背部皮下植入210～220 mg药棒，定期耳缘采血。用HPLC法测定血浆中阿司匹林(ASA)含量。测定方法同标准曲线绘制，以埋药血浆代替空白血浆，不加SA标准液，其余步骤相同，结果见图8。色谱条件同2.2.4。
标准曲线绘制：取空白血浆1 ml于10 ml容量瓶，分别加入0.1 ml浓度依次为16、32、64、128、256、512 μg/ml的水杨酸甲醇溶液，加0.1 mol/L NaOH 2 ml，置85 ℃水浴3 h，然后滴入6 mol/L HCl酸化，再用甲醇稀释至刻度，得到浓度为0.16、0.32、0.64、1.28、2.56、5.12 μg/ml的SA标准液，经0.45 μ滤膜过滤，进行HPLC测定。根据测得的峰面积A和SA的浓度c得回归方程为：A=-52.6+3744.8c(r=0.9989,n=6)。
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加样回收率测定：方法同标准曲线绘制，以浓度为50、250 μg/ml ASA甲醇溶液代替SA甲醇溶液，其余步骤相同。将测得的SA浓度换算成ASA浓度，结果见表5。
表5 ASA加样回收率(n=3)
Table 5 Recoveries of ASA added (n=3) Concentration of ASA
added (μg/ml)
ASA加样浓度(μg/ml)
Concentration of ASA
determined(μg/ml)
ASA实测浓度(μg/ml)
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Recovery
(%)
回收率(%)
SD
0.5
0.500
100.10
5.16
2.5
2.417
96.67
0.88
3 讨 论
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3.1 PHPPA的生物降解性及对机体的影响
胰蛋白酶和木瓜蛋白酶都是肽链内切酶，胰蛋白酶存在于胰液中，木瓜蛋白酶是组织蛋白酶的类似物，我们选择这两种酶作为体外降解用酶。实验结果表明，两种材料在这两种酶中都能发生降解。因此认为PHPPA在体内的生物降解也是酶解过程。这一结果与国外一些学者的观点相符[9]。
图5 ASA-PHPPA-7∶3在胰蛋白酶(a)和磷酸缓冲液(b)中的累积释放曲线
Fig 5 Accumulated release curve of ASA-PHPPA-7∶3 in trypsin(a),PBS(b)
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图6 ASA-PHPPA-3∶7在胰蛋白酶(a)和磷酸缓冲液(b)中的累积释放曲线
Fig 6 Accumulated release curve of ASA-PHPPA-3∶7 in trypsin(a),PBS(b)
图7 兔血浆(a)，血浆中的标准SA(b)和血样中SA(c)的高效液相色谱图
Fig 7 HPLC of plasma(a),standard SA in plasma(b) and SA in sample(c)
图8 ASA-PHPPA-7∶3(a)和ASA-PHPPA-3∶7(b)在兔体中的释放曲线
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Fig 8 Release profile of ASA-PHPPA-7∶3(a) and ASA-PHPPA-3∶7(b) in rabbit
由表3可知，PHPPA-7∶3植入小鼠皮下二至三周内，在埋植部位、肾、肝中都能检测到其降解片段的存在，约一个月后，在埋植部位及肾中已检测不到，但在肝中尚能检测到，表明PHPPA在肝中代谢稍慢；PHPPA-3∶7植入皮下约四周后，在肾、肝中都能检测到其降解片段，在埋植部位检测不到。这表明同种材料在不同组织中的代谢速度不同，似乎也提示脂溶性大的PHPPA在体内生物降解更快些，这可能是由于脂溶性大的材料更易透过生物膜进入细胞，在组织蛋白酶催化下降解，但尚需进一步实验加以确证。
表2结果表明，PHPPA对小鼠的血色素无影响，白血球、GPT及肌酐虽由于个体差异有一定程度的变化，但从80只小鼠的统计结果来看，与空白对照组小鼠相比也无显著影响，表明了该材料的良好生物相容性。
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3.2 ASA-PHPPA的释放
高分子药物ASA-PHPPA的体外释放应始终处于“漏槽”状态，以不影响药物的释放。由图3、图4可知，药物释放初始有一释药冲击量，在一周以后渐趋平稳，这是由于药棒表面的药物直接与释放介质接触，很容易被水解下来，故有一释药冲击量，而内部的药物必须由水通过药棒间隙进入才能水解下来，故速度较慢。
由于高分子药物的体外释放存在着冲击量，故将其体外累积释放曲线(图5、图6)分为爆释相(0～4 d)和缓释相(4 d以后)，并对其分别进行拟合回归，得四条双相双指数回归方程，ASA-PHPPA-7∶3在胰蛋白酶和PBS中的累积释放分别符合方程：y=3.056e0.04294t+3.6341e0.000961t(r=0.9931,r=0.9987)
y=2.9959e0.04108t+3.4506e0.000977t(r=0.8076,r=0.9974)
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ASA-PHPPA-3∶7的累积释放分别符合
y=1.7973e0.04121t+2.1276e0.000617t(r=0.9437,r=0.9980)
y=1.3886e0.03798t+1.5755e0.000747t(r=0.8009,r=0.9941)
采用两两间多重比较的T检验法，对缓释相的四条累积释放曲线进行方差分析，结果表明两两之间存在显著性差异，即高分子材料的亲疏水性及有无蛋白酶存在对药物释放速度有显著影响。两种高分子药物在胰蛋白酶缓冲液中的释放速度均快于在缓冲液中的释放，这可能是由于酶对材料的降解作用，使药物更易暴露出来被水解；而ASA-PHPPA-7∶3在两种介质中的释放均快于ASA-PHPPA-3∶7，表明材料的脂溶性增加有利于药物的释放，体内释放实验也得到同样结果，这为解决目前存在的释药过缓的问题提供了依据。
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* 国家自然科学基金资助项目(浙医大承担)
参考文献
1 Filipovic-Grcic J, Maysinger D, Zorc B. Macromolecular prodrugs. Ⅳ.Alginate-chitosan microspheres of PHEA-L-dopa adduct. International Journal of Pharmaceutics, 1995; 116∶39
2 Gaetano Giammona, Vincenzo Tomarchio, Giovanna Pitarresi. Glycidyl methacrylate derivatization of α,β-Poly(N-hydroxyethyl)-DL-aspartamide and α,β-Polyasparthydrazide. Polymer, 1997; 38(13)∶3315
, 百拇医药
3 Peter R. Byron, Zhuang Sun, Hirokazu Katayama. Solute Absorption of fluorophore-labeled Poly-α,β-N(2-hydroxyethyl)-DL-asparamide. Pharmaceutical Research, 1994; 11(2)∶221
4 杨江丰，陈启琪，徐宗藩.炔诺酮-聚天冬酰胺共价复合物体外释放的研究.浙江医科大学学报，1992；21(6)∶248
5 陈启琪，汤谷平，单达先等.炔诺酮-聚天冬酰胺共价复合体水解动力学的研究及炔诺酮含量测定.浙江医科大学学报，1993；22(5)∶199
6 陈启琪，刘向东，单达先等.氟尿嘧啶-聚天冬酰胺复合体的合成.中国药物化学杂志，1993；3(3)∶163
7 周 涛，王 斌，汤谷平等.α，β-聚-DL-天冬酰胺修饰材料及键合阿司匹林共价复合体的合成与表征.宁波大学学报，1998；11(1)∶61
8 北京师范大学生物系.基础生物化学实验.北京：高等教育出版社，1982
9 Dickinson HR. Biodegradation of a poly-(α-amino acid) hydrogel Ⅱ in vitro. J Biomed Mater Res, 1981; 15∶591
(收稿：1998-03-30 修回：1998-12-08), http://www.100md.com