流体切应力作用下中性粒细胞F-肌动蛋白的变化*
作者：田 卫 陈槐卿 陈蕴颖 雷 松 陈云爽 步 宏 魏于全
单位：田 卫 陈槐卿 陈云爽 (华西医科大学 生物医学工程研究室，成都 610041)；陈蕴颖 步 宏 (华西医科大 附属第一医院移植免疫实验室，成都 610041)；雷 松 魏于全 (华西医科大学 附属第一医院肿瘤生物治疗中心，成都610041)
关键词：中性粒细胞；F-actin；稳定剪切；正弦振荡剪切
生物医学工程学杂志990401 摘要 中性粒细胞担负着机体的防御功能，其生理特点关系着功能实现。由于中性粒细胞的成熟储存与功能发挥是在不同的力学环境中完成的，因而也就存在着不同的环境适应。F-actin的含量与细胞的力学性质有着密切关系。通过对不同切应力下F-actin含量及分布的观察，我们发现：在低切应力范围内随着切应力的升高F-actin的含量下降，不同的剪切类型所产生的效果有所差异；切应力与f-MLP或TNF联合作用会使F-actin的含量比f-MLP或TNF单独作用时下降，其趋势与单纯切应力作用相似。切应力作用后，细胞膜附近的F-actin明显减少。f-MLP或TNF使F-actin含量升高则主要集中在细胞边缘，这时再施加切应力，细胞边缘的F-actin含量也会显著下降。结果表明：中性粒细胞在流体切应力作用下通过F-actin的解聚，降低细胞膜附近的硬度，增加细胞的变形能力，从而减少细胞在流体中的阻力，有利于细胞更好地通过循环，完成其功能。当切应力上升到较大值后，细胞内F-actin含量会上升，以抵抗力学的破坏作用。可以得出的结论是：切应力作用下，中性粒细胞内F-actin含量随所受切应力的大小呈现双向调节，表现出灵活的力学适应性。
, 百拇医药
Changes of F-actin in Neutrophils under Fluid Shear Stress
Tian Wei1 Chen Huaiqing1 Chen Yunying2 Lei Song3 Chen Yunshuang1
Bu Hong2 Wei Yuquan3
1 (Institute of Biomedical Engineering, West China University of Medical Sciences, Chengdu 610041)
2 (Lab of Transplant Immunology, West China University of Medical Sciences, Chengdu 610044)
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3 (Biotherapy Centrer of Cancer, West China University of Medical Sciences, Chengdu 610044)
Abstract Neutrophils are the main defender in the body, and their physiological characters are associated with functions. Because the environments of neutrophils maturation and storage are different from their function environment, they have to adapt thess changes. Filamentous actin (F-actin), as one of the important cytoskeleton components of neutrophils, has different quantity and distribution under different physiological conditions. Previous researches are all focused on static activation of neutrophils using various stimulants such as formyl-methionyl-leucyl-phenylalanine (f-MLP) and tumor necrosis factor(TNF). In our study, Low-Shear 30 and NXE-1 rheometers were used to provide steady or sinusoidaloscillatory fluid shear stress on separated neutrophils. Fluorescent agent Tritc-Phalloidin was added to label F-actin and the mean fluorescent intensity tested by flow cytometry was used as the indication of F-actin quantity and confocal laser scan microscope was used to detect the distribution of F-actin in neutrophils. We found that F-actin polymerization was significantly decreased under both steady and sinusoidal-oscillatory shear stress when the shear stress was below certain level. The density of the cortex F-actin near cell membrane in cells sheared became thinner than in that without shear stress. f-MLP and TNF both could increase actin polymerization in neutophils due to activation. When neutorphils were activated with f-MLP or TNF under shear stress, the quantity of F-actin in the cells was also decreased, but it was still higher than that in the cells absent of f-MLP or TNF. We concluded that neutrophils had different mechanical properties in different fluid environments. F-actin content and distribution would change according to the shear stress values to play their determinant role in neutrophils mechanical adaptation. The mechanism of actin polymerization in neutrophils for mechanical action is probably different from that for chemoattractants and cytokine activation.
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Key words Neutrophils F-actin Steady shear Sinusoidal-oscillatory shear
1 引 言
中性粒细胞是机体内重要的防御细胞，其生理病理行为直接关系到体内的抗炎、免疫及心脑血管系统功能。循环中的中性粒细胞占体内成熟中性粒细胞的比例并不多，但恰恰是这些循环的细胞，随着血流绕行全身，监视各类侵害，执行消毒杀菌的功能；而大量储存的中性粒细胞随时补充进入循环中，增强其防御效能。所以说血流环境是中性粒细胞的重要生理环境，更是其功能环境。体外研究各种流场下中性粒细胞的行为，有助于全面了解其生理状态和功能变化。
细胞的骨架系统由于其特有的网络结构而承担着多种功能，如维持细胞形态、参与细胞运动、信号传递、力学适应等。肌动蛋白在骨架系统中无论是所占比重还是所起作用都至关重要[1]。因此，在细胞骨架研究中，肌动蛋白的变化是一个焦点，特别是在力学作用下，肌动蛋白的变化更引人注目。
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目前，对中性粒细胞的研究受各种条件的限制，多是考虑静态下的变化，如激活状态、粘附分子表达等，而真正考察流动状态下的中性粒细胞生理适应少有报道，因此，本文将从细胞骨架着手，对这流体切应力作用下细胞的变化进行较为系统的研究。
2 材料与方法
2.1 试剂与仪器
Tritc-Phalloidin(Sigma公司，美国)；淋巴细胞分离液(上海试剂二厂)；低分子羟乙基淀粉注射液(Fresenius公司，德国)；0.1%台盼蓝；0.15M PBS；0.2%NaCl；3.7%甲醛；10%甲醇；0.4%TritonX-100(Sigma公司，美国)；甲酰三肽(f-MLP)(Sigma公司，美国)；肿瘤坏死因子-α(TNFα)(GIBCO BRL，美国)；细胞松弛素B(CTB)(Sigma公司，美国)。
流变仪(Low-Shear 30，瑞士)；NXE-1粘度计(成都仪器厂)；流式细胞仪(FCM)(ELITE ESP，Coulter，美国)；细胞离心机(Cytocentrifuge 7620，美国)；共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)(MRC1024，Biorad，美国)；普通离心机(北京医用离心机厂)。
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2.2 中性粒细胞的分离和纯化
采用密度梯度离心后溶血的方法，简要为：(1)人肘前静脉采血10ml，肝素抗凝(12.5U/ml)。低速离心去除富含血小板血浆。(2)等体积加入低分子羟乙基淀粉注射液，混匀后37℃静置20min，取上层悬液小心加到淋巴细胞分离液上，2000rpm离心20min。(3)弃上清液及淋巴细胞层，沉淀以低渗液溶血30s，加PBS终止溶血，离心后取沉淀，稀释至需要的细胞浓度。(4)台盼蓝染色鉴定，活细胞数在98%以上。
2.3 切应力对中性粒细胞悬液作用
采用Low-Shear流变仪，选择其20、27和29三个档位，对应的切变率分别为5.96s-1、51.2s-1和94.5s-1，作单纯稳定旋转剪切；另外在20、27和29三个档位作正弦振荡剪切，对应的频率分别为0.0758Hz、0.650Hz和1.202Hz，对应的最大切变率分别为3.11s-1、26.7s-1和49.3s-1；使用NXE-1粘度计，选取150s-1、300s-1和600s-1作高切变率下的稳定剪切。剪切作用时间为1min，剪切后立即用3.7%甲醛固定。10-7M的f-MLP和10ng/ml的TNF作用各组所选择剪切条件、作用时间与以上相同，只有刺激剂的差异。
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为研究F-actin在细胞内分布的情况，选取了一些实验组加入30μMCTB孵育5 min后进行上述实验，具体组别如表1。
表1 用CTB作用中性粒细胞的不同实验条件
Table 1 Groups of CTB act on neutrophils 空白对照+CTB5′固定
空白对照+CTB5′+f-MLP1′固定
空白对照+CTB5′+TNF1′固定
空白对照+CTB5′+5.96s-1剪切1′固定
空白对照+CTB5′+(f-MLP+5.96s-1剪切)1′固定
, http://www.100md.com 空白对照+CTB5′+(TNF+5.96s-1剪切)1′固定
2.4 F-actin检测
2.4.1 荧光染色 固定后的细胞悬液，以1μg/ml Tritc-Phalloidin,10%甲醇，0.4%TritonX-100避光染色10-15min，离心取沉淀，用PBS洗涤，然后制备成105-106cell/ml悬液。
2.4.2 制片 取90μl细胞悬液，在细胞离心机上1000rpm离心，将细胞铺到载玻片上，甘油封片，备检。
2.4.3 流式细胞仪(FCM)测定 采用ELITE ESP流式细胞仪，以554nm激发，在576nm下检测荧光强度，荧光强度值与F-actin的含量相关，所以用平均荧光强度表示细胞内F-actin的含量。
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2.4.4 共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)观察 采用共聚焦激光扫描显微镜，15mW Ke-Ar离子激光器，554nm激发，发射滤光片585LP，以DIC，NA1.30物镜100倍油镜扫描观察细胞中红色荧光分布，随机选取2～3个视野，使所观察的细胞数>30，全部图像存储后供图像处理。
2.4.5 图像处理 每个条件下随机选取30个细胞，将每个细胞等分为相同面积的细胞边缘和中央两部分，计算各自的灰度并求得边缘与中央的比值，然后将30个细胞的比值求均数及标准差。选取各组中的代表细胞，利用CLSM配套的图像处理软件High coded projection将细胞内F-actin的分布显示出来。
2.5 数据处理
各组流式细胞仪所测得的荧光强度，均与空白对照组相比，求得的百分比值采用配对t-检验；共聚焦激光扫描显微镜图像处理结果，采用两样本均数比较的t-检验。
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3 结 果
3.1 稳定剪切对中性粒细胞F-actin含量的影响
如图1所示，稳定剪切持续施加1分钟，在切变率小于50s-1时，中性粒细胞内F-actin的含量显著下降，如果切变率继续升高，细胞内F-actin的含量会逐渐回升，呈现双向改变；f-MLP或TNF与中性粒细胞悬液作用1分钟后，细胞的F-actin含量显著升高，若同时施加切应力，在低切变率下细胞的F-actin含量也会出现明显的下降趋势，而在切变率增大时(>50s-1)回升；表2为CTB作用后中性粒细胞F-actin含量的变化，从中可见CTB使F-actin的含量下降，剪切后有轻微升高；CTB作用后，f-MLP和TNF均可以使F-actin有所上升，但与CTB作用前相比幅度要小得多；如再施加切应力，F-actin的含量有小幅度上升。
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图1 稳定剪切对中性粒细胞F-actin含量的影响
Fig 1 Effect of steady shear on the content of F-actin in neutrophils
—●—shear ——shear+fMLP —▲—shear+TNF
*,**:vs control P<0.05,P<0.01; #,##:vs f-MLP without shear P<0.05,P<0.01; &,&&:vs TNF without shear P<0.05,P<0.01，n=8
3.2 正弦振荡剪切对中性粒细胞F-actin含量的影响
由图2可以看出，不同频率正弦振荡剪切1分钟，可使中性粒细胞内F-actin含量下降，在低频率时下降幅度较大，频率升高后(1.202Hz)，F-actin含量上升，但仍低于对照组；f-MLP或TNF刺激的同时施加正弦振荡剪切，细胞内F-actin的含量比未受剪切时呈下降趋势，其中f-MLP刺激的各对应剪切组，在频率升高到较大值后(约>1 Hz)，F-actin的含量开始上升，与单独剪切组相比较，趋势较一致；而TNF的各对应剪切组未见明显的升高点，与单独剪切组相比较略有差异。
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表2 CTB对中性粒细胞F-actin含量的影响
Table 2 Effect of CTB on the content of F-actin in neutrophils
无CTB无剪切
(n=4)
30μM CTB
(n=4)
30μM CTB+5.96s-1
(n=4)
无fMLP无TNF
100
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68.2±13.3**
71.0±18.4**
10-7M f-MLP
154.2±17.4
74.6±10.9##
82.7± 6.0##
10ng/ml TNF
135.9±11.8
72.4±13.4&&
81.2± 7.2&&
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表中数字为相对于对照组的荧光强度百分比，**：vs control P<0.01,##:vs f-MLP without shear P<0.01,&&:vs
TNF without shear P<0.01
图2 正弦振荡剪切对中性粒细胞F-actin含量的影响
Fig 2 Effect of sinusoidal-oscillatory shear on the content of F-actin in the neutrophils
—●—shear ——shear+fMLP —▲—shear+TNF
*,**:vs control P<0.05,P<0.01; #,##:vs f-MLP without shear P<0.05,P<0.01; &,&&:vs TNF without shear P<0.05,P<0.01，n=4
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3.3 稳定剪切流与正弦振荡剪切流的比较
比较图1和图2可以发现，正弦振荡剪切时，中性粒细胞内F-actin的含量由降低而升高的转折点最大切变率(约40s-1)比稳定剪切时(约60s-1)低。图3所示，稳定剪切的切变率为51.2s-1，正弦振荡剪切的最大切变率为49.3s-1，尽管切变率均在50s-1左右，F-actin下降程度明显不同。表明以正弦振荡形式施加的剪切对肌动蛋白聚合的影响也呈现双向性，但由于剪切方向及强度的变化使其对F-actin的作用更复杂，与稳定剪切时存在差异。
图3 不同类型剪切对F-actin的影响
Fig 3 Effect of different type of shear on the content of F-actin in neutrophils
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*:vs steady shear P<0.05,n=4
3.4 切应力对中性粒细胞肌动蛋白分布的影响
图4(见封3)所示为CLSM图像荧光分布的High coded projection分析，每幅图的上角是所分析的细胞。剪切作用前F-actin主要分布于细胞膜附近，形成一层较为致密的骨架，支撑起细胞的形状，剪切后这层骨架的荧光强度明显下降，细胞中央强度相对增加(Fig4a、b)，这一点与流式细胞仪的测定结果一致。f-MLP作用后，F-actin在细胞边缘形成一更为致密的骨架层，同时发现该层分布不均匀，提示在一些部位可能会有伪足形成；经过剪切后边缘层的分布显著下降(Fig4c、d)。CTB作用后，细胞边缘F-actin消失，代之以细胞中央分布相对丰富(Fig4e)，剪切后仍维持这种分布状态并有更加集中的趋势(Fig4f)。CTB作用后再加入f-MLP作用于细胞，F-actin分布仍是在细胞的中央部位，这时剪切也不会对分布有大的影响(Fig 4g、h)。
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图4 中性粒细胞内F-actin分布的CLSM图象处理结果
Fig 4 The result of CLSM images for the F-actin distribution in neutrophils(4a)：control，(4b)：shear under 5.96s-1，(4c)：stimulated by f-MLP (4b)：stimulated by f-MLP and shear under 5.96s-1，(4e)：added ctb，(4f)：shear under 5.96s-1 after CTB action，(4g)：stimulated by f-MLP after CTB action，(4h)：
stimulated by f-MLP and shear under 5.96s-1，after CTB action。
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为进一步定量地分析F-actin分布的变化，对各条件下所得到的细胞图像随机各取30个细胞做图像处理，得到的结果如图5。剪切作用使细胞边缘F-actin显著减少；f-MLP在激活细胞的同时使F-actin的分布更集中于边缘，形成一个致密带，此时若施加剪切，同样会显著降低这一区域的F-actin；CTB能使边缘F-actin基本消失，而中央明显增高；CTB作用后，f-MLP和剪切均不会改变F-actin的分布趋势。
图5 不同刺激条件对中性粒细胞内F-actin分布的影响
Fig 5 Effects of different stimulants on the distribution of F-actin in neutrophils
1:control, 2:shear, 3:f-MLP, 4:f-MLP+shear, 5:CTB,6:CTB+shear, 7:CTB+f-MLP，8:CTB+f-MLP+shear
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Shear means under shear rate 5.96s-1 n=30
*,**:vs control P<0.05,P<0.01; ##:vs f-MLP without shear P<0.05, P<0.01; &&:vs CTB P<0.05,P<0.01
4 讨 论
中性粒细胞在体内执行着重要的防御功能，其生理状态的变化将影响到抗炎、免疫和心脑血管等系统功能的正常发挥。中性粒细胞由骨髓成熟后主要储存在骨髓和边缘池，只有不到十分之一的成熟细胞在循环血液中，随着循环血液在机体内监视异物的入侵、执行防御功能。尽管循环中的中性粒细胞所占比例较少，但这些细胞是功能的直接执行者，所以，这一部分细胞的生理状态与整个细胞群所担负的功能有更直接关系。细胞进入循环后必然会根据生存环境的变化而调整自身的各种结构性质和功能状态[2]。
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肌动蛋白作为一种细胞内的结构蛋白，含量丰富，在中性粒细胞中约占全部蛋白重量的10%[2]。肌动蛋白有两种存在形式，分别为单体球状蛋白G-actin和纤维状多聚体F-actin，二者根据细胞的功能状态可以互相转化，在细胞静息状态时则达到一种动态的平衡。所谓动态平衡即不断有F-actin解聚和聚合，使细胞内两种状态的肌动蛋白在浓度上不变，从总体上讲，G-actin的含量要大于F-actin的含量。但由于F-actin参与细胞骨架的构建、细胞运动、细胞硬度与变形能力等多方面功能，因此，众多研究将F-actin作为重点。F-actin的解聚与聚合受到多种相关蛋白、ATP及Ca2+、Mg2+离子的调节作用，表现较为复杂。同时，由于F-actin纤维自身结构特点使之存在极性，即正极和负极，两极的反应能力、与结合蛋白的作用有着显著的差异，一般而言，两极聚合反应的结合常数相差5-6倍，这就进一步增加了F-actin调控的复杂性[3]。因此，研究F-actin的变化可以引发一系列值得深入探讨的问题，为了解中性粒细胞的细胞内调控机制提供有力证据。
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已有的研究表明，细胞骨架，特别是F-actin的含量及分布，对中性粒细胞的形状、硬度和胞浆粘度等细胞力学性质起着决定性的作用，F-actin含量增加使细胞硬度和胞浆粘度增大，在一些药物作用下，改变细胞中F-actin的含量，可以使细胞的力学性质被动地发生改变[4，5]。伴随着细胞在静态与流动之间的迁移，细胞承受的力学环境发生改变，每个细胞的力学模式必然有一个适应性改变，因而作为决定因素的F-actin就会在不同的力学作用下有不同的表现。Moazzam等研究发现[6]，中性粒细胞在静止状态下有伪足伸出，流动时伪足缩回。无论是在体观察还是体外采用微吸管试验，均有类似发现。同时，细胞内颗粒运动的规律也会在两种力学环境中有不同表现即：细胞流动时颗粒的运动程度大于静止状态，表明细胞流动时细胞浆的流动性增大。伪足的形成与消失、胞浆的流动性等均可以看成是F-actin变化的一种反映，由此可以推测F-actin的含量在不同切应力作用下可能发生改变。
从我们的实验结果可以看出，中性粒细胞在稳定切应力作用下，细胞中的F-actin含量明显下降，特别在较低的切变率时(如在50s-1以下)，随切变率增加F-actin含量进行性下降，最低可减少20%左右。以正弦振荡剪切作用于中性粒细胞，发现细胞中的F-actin含量也显著下降；振荡剪切的频率可能影响F-actin聚合，但也可能是由于切变率从最小值以到最大值之间以正弦频率振荡，并且有剪切方向的变化，使流体切应力作用复杂化。切应力作用使F-actin解聚，含量下降，从而降低了胞浆粘度。 当我们使用的切变率由100s-1上升至600s-1时，F-actin的含量是有升高的趋势，这一结果与已有的研究一致[7]，中性粒细胞内F-actin含量的变化可能与采用的剪切力的大小有关。本实验的最大切应力在4 dyne/cm2以下，如果切应力继续增高，F-actin的含量可能会大幅上升，从我们的结果中能看出这一趋势，表明F-actin的含量随着切应力的变化呈现双向改变。
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已有大量报道证实，f-MLP和TNF等因素尽管是不同类型的刺激因子，均可使中性粒细胞激活。在激活后的一个重要表现即为细胞有伪足伸出，F-actin含量升高[7，8]。有很多工作已经以此两种指标对中性粒细胞的激活程度进行评估。从我们的研究结果分析，f-MLP和TNF的确使F-actin的含量显著升高，但是同时施加的不同大小或形式的剪切作用，影响了升高的程度。流体剪切作用使F-actin含量改变与f-MLP、TNF等静态激活中性粒细胞使F-actin含量改变有一定的可迭加性，故推测力学刺激与化学刺激具有独立的不同机理，其间的细致差异需要深入研究。因此，在用F-actin的含量作为评价中性粒细胞激活程度的指标时，应考虑不同的流体力学条件，相同力学条件下的比较才有科学性。
我们的研究结果还发现，剪切作用后，F-actin的分布也有相应的改变，细胞膜附近由原来的密集变为稀疏。通常F-actin集中在细胞膜附近，以束状或二维网状应力纤维密集于其下，细胞膜与F-actin有着紧密的联系，他们之间的相互交联决定了细胞膜的硬度及流动性。膜附近F-actin含量的降低，必然减少了与膜的交联，使膜硬度下降，流动性增强，更加易于变形。f-MLP或TNF作用下，中性粒细胞伪足形成比例增高，同时F-actin也在细胞膜附近更加集中，切应力作用后细胞边缘的F-actin分布也显著降低。CTB可以使F-actin的交联下降，同时肌动蛋白的聚合也会降低[9]。从我们的结果中可以发现，CTB使细胞中F-actin的含量明显下降，并且由原来集中于边缘变为集中到中央，提示细胞内的F-actin在CTB作用下可能由边缘向中央迁移；这时，f-MLP和TNF的作用下F-actin上升的幅度也减小，且升高的部位也在细胞中央，表明f-MLP和TNF可以使细胞边缘和中央的F-actin都增加，但是以边缘为主；同时CTB作用后，剪切应力不会使F-actin降低而是有轻微升高，这现象在有无f-MLP和TNF组间均可以看到，进一步说明剪切应力大幅度降低了细胞边缘F-actin，而对中央的F-actin可能有升高，但总的结果是使细胞内F-actin含量降低。
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总之，中性粒细胞从静态进入到流动状态后，在一定的切应力范围内，为适应流体作用，减少流体阻力，通过使F-actin解聚降低F-actin的含量，进而改变细胞自身的力学特性，有利于细胞顺利地通过循环，完成其特有功能。如果切应力较高时，细胞为抵御流体切应力的破坏作用，通过促进聚合增加F-actin含量，这也是一种自我保护。力学作用下F-actin的含量改变与单独刺激因子作用下中性粒细胞激活后F-actin变化的调控途径可能是不同的，两者之间互不干扰，最终是以一种近似于加和的方式来综合表现的。值得进一步关注的问题是，中性粒细胞如何感受并传递力学信号，通过什么途径调节F-actin的解聚与聚合过程，从而达到力学适应的目的。这是细胞生物力学研究中最热也最棘手的问题。
致谢：四川大学生物力学研究所袁华博士为本研究提供了图像分析及结果处理，在此表示感谢!
* 国家自然科学基金重点资助项目(39830110)
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参考文献
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9 MacLean-Fletcher S,Pollard TD. Mechanism of action of cytochalasin B on actin. Cell, 1980； 20∶329
(收稿：1998-12-8), http://www.100md.com
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3 (Biotherapy Centrer of Cancer, West China University of Medical Sciences, Chengdu 610044)
Abstract Neutrophils are the main defender in the body, and their physiological characters are associated with functions. Because the environments of neutrophils maturation and storage are different from their function environment, they have to adapt thess changes. Filamentous actin (F-actin), as one of the important cytoskeleton components of neutrophils, has different quantity and distribution under different physiological conditions. Previous researches are all focused on static activation of neutrophils using various stimulants such as formyl-methionyl-leucyl-phenylalanine (f-MLP) and tumor necrosis factor(TNF). In our study, Low-Shear 30 and NXE-1 rheometers were used to provide steady or sinusoidaloscillatory fluid shear stress on separated neutrophils. Fluorescent agent Tritc-Phalloidin was added to label F-actin and the mean fluorescent intensity tested by flow cytometry was used as the indication of F-actin quantity and confocal laser scan microscope was used to detect the distribution of F-actin in neutrophils. We found that F-actin polymerization was significantly decreased under both steady and sinusoidal-oscillatory shear stress when the shear stress was below certain level. The density of the cortex F-actin near cell membrane in cells sheared became thinner than in that without shear stress. f-MLP and TNF both could increase actin polymerization in neutophils due to activation. When neutorphils were activated with f-MLP or TNF under shear stress, the quantity of F-actin in the cells was also decreased, but it was still higher than that in the cells absent of f-MLP or TNF. We concluded that neutrophils had different mechanical properties in different fluid environments. F-actin content and distribution would change according to the shear stress values to play their determinant role in neutrophils mechanical adaptation. The mechanism of actin polymerization in neutrophils for mechanical action is probably different from that for chemoattractants and cytokine activation.
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Key words Neutrophils F-actin Steady shear Sinusoidal-oscillatory shear
1 引 言
中性粒细胞是机体内重要的防御细胞，其生理病理行为直接关系到体内的抗炎、免疫及心脑血管系统功能。循环中的中性粒细胞占体内成熟中性粒细胞的比例并不多，但恰恰是这些循环的细胞，随着血流绕行全身，监视各类侵害，执行消毒杀菌的功能；而大量储存的中性粒细胞随时补充进入循环中，增强其防御效能。所以说血流环境是中性粒细胞的重要生理环境，更是其功能环境。体外研究各种流场下中性粒细胞的行为，有助于全面了解其生理状态和功能变化。
细胞的骨架系统由于其特有的网络结构而承担着多种功能，如维持细胞形态、参与细胞运动、信号传递、力学适应等。肌动蛋白在骨架系统中无论是所占比重还是所起作用都至关重要[1]。因此，在细胞骨架研究中，肌动蛋白的变化是一个焦点，特别是在力学作用下，肌动蛋白的变化更引人注目。
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目前，对中性粒细胞的研究受各种条件的限制，多是考虑静态下的变化，如激活状态、粘附分子表达等，而真正考察流动状态下的中性粒细胞生理适应少有报道，因此，本文将从细胞骨架着手，对这流体切应力作用下细胞的变化进行较为系统的研究。
2 材料与方法
2.1 试剂与仪器
Tritc-Phalloidin(Sigma公司，美国)；淋巴细胞分离液(上海试剂二厂)；低分子羟乙基淀粉注射液(Fresenius公司，德国)；0.1%台盼蓝；0.15M PBS；0.2%NaCl；3.7%甲醛；10%甲醇；0.4%TritonX-100(Sigma公司，美国)；甲酰三肽(f-MLP)(Sigma公司，美国)；肿瘤坏死因子-α(TNFα)(GIBCO BRL，美国)；细胞松弛素B(CTB)(Sigma公司，美国)。
流变仪(Low-Shear 30，瑞士)；NXE-1粘度计(成都仪器厂)；流式细胞仪(FCM)(ELITE ESP，Coulter，美国)；细胞离心机(Cytocentrifuge 7620，美国)；共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)(MRC1024，Biorad，美国)；普通离心机(北京医用离心机厂)。
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2.2 中性粒细胞的分离和纯化
采用密度梯度离心后溶血的方法，简要为：(1)人肘前静脉采血10ml，肝素抗凝(12.5U/ml)。低速离心去除富含血小板血浆。(2)等体积加入低分子羟乙基淀粉注射液，混匀后37℃静置20min，取上层悬液小心加到淋巴细胞分离液上，2000rpm离心20min。(3)弃上清液及淋巴细胞层，沉淀以低渗液溶血30s，加PBS终止溶血，离心后取沉淀，稀释至需要的细胞浓度。(4)台盼蓝染色鉴定，活细胞数在98%以上。
2.3 切应力对中性粒细胞悬液作用
采用Low-Shear流变仪，选择其20、27和29三个档位，对应的切变率分别为5.96s-1、51.2s-1和94.5s-1，作单纯稳定旋转剪切；另外在20、27和29三个档位作正弦振荡剪切，对应的频率分别为0.0758Hz、0.650Hz和1.202Hz，对应的最大切变率分别为3.11s-1、26.7s-1和49.3s-1；使用NXE-1粘度计，选取150s-1、300s-1和600s-1作高切变率下的稳定剪切。剪切作用时间为1min，剪切后立即用3.7%甲醛固定。10-7M的f-MLP和10ng/ml的TNF作用各组所选择剪切条件、作用时间与以上相同，只有刺激剂的差异。
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为研究F-actin在细胞内分布的情况，选取了一些实验组加入30μMCTB孵育5 min后进行上述实验，具体组别如表1。
表1 用CTB作用中性粒细胞的不同实验条件
Table 1 Groups of CTB act on neutrophils 空白对照+CTB5′固定
空白对照+CTB5′+f-MLP1′固定
空白对照+CTB5′+TNF1′固定
空白对照+CTB5′+5.96s-1剪切1′固定
空白对照+CTB5′+(f-MLP+5.96s-1剪切)1′固定
, http://www.100md.com 空白对照+CTB5′+(TNF+5.96s-1剪切)1′固定
2.4 F-actin检测
2.4.1 荧光染色 固定后的细胞悬液，以1μg/ml Tritc-Phalloidin,10%甲醇，0.4%TritonX-100避光染色10-15min，离心取沉淀，用PBS洗涤，然后制备成105-106cell/ml悬液。
2.4.2 制片 取90μl细胞悬液，在细胞离心机上1000rpm离心，将细胞铺到载玻片上，甘油封片，备检。
2.4.3 流式细胞仪(FCM)测定 采用ELITE ESP流式细胞仪，以554nm激发，在576nm下检测荧光强度，荧光强度值与F-actin的含量相关，所以用平均荧光强度表示细胞内F-actin的含量。
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2.4.4 共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)观察 采用共聚焦激光扫描显微镜，15mW Ke-Ar离子激光器，554nm激发，发射滤光片585LP，以DIC，NA1.30物镜100倍油镜扫描观察细胞中红色荧光分布，随机选取2～3个视野，使所观察的细胞数>30，全部图像存储后供图像处理。
2.4.5 图像处理 每个条件下随机选取30个细胞，将每个细胞等分为相同面积的细胞边缘和中央两部分，计算各自的灰度并求得边缘与中央的比值，然后将30个细胞的比值求均数及标准差。选取各组中的代表细胞，利用CLSM配套的图像处理软件High coded projection将细胞内F-actin的分布显示出来。
2.5 数据处理
各组流式细胞仪所测得的荧光强度，均与空白对照组相比，求得的百分比值采用配对t-检验；共聚焦激光扫描显微镜图像处理结果，采用两样本均数比较的t-检验。
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3 结 果
3.1 稳定剪切对中性粒细胞F-actin含量的影响
如图1所示，稳定剪切持续施加1分钟，在切变率小于50s-1时，中性粒细胞内F-actin的含量显著下降，如果切变率继续升高，细胞内F-actin的含量会逐渐回升，呈现双向改变；f-MLP或TNF与中性粒细胞悬液作用1分钟后，细胞的F-actin含量显著升高，若同时施加切应力，在低切变率下细胞的F-actin含量也会出现明显的下降趋势，而在切变率增大时(>50s-1)回升；表2为CTB作用后中性粒细胞F-actin含量的变化，从中可见CTB使F-actin的含量下降，剪切后有轻微升高；CTB作用后，f-MLP和TNF均可以使F-actin有所上升，但与CTB作用前相比幅度要小得多；如再施加切应力，F-actin的含量有小幅度上升。
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图1 稳定剪切对中性粒细胞F-actin含量的影响
Fig 1 Effect of steady shear on the content of F-actin in neutrophils
—●—shear ——shear+fMLP —▲—shear+TNF
*,**:vs control P<0.05,P<0.01; #,##:vs f-MLP without shear P<0.05,P<0.01; &,&&:vs TNF without shear P<0.05,P<0.01，n=8
3.2 正弦振荡剪切对中性粒细胞F-actin含量的影响
由图2可以看出，不同频率正弦振荡剪切1分钟，可使中性粒细胞内F-actin含量下降，在低频率时下降幅度较大，频率升高后(1.202Hz)，F-actin含量上升，但仍低于对照组；f-MLP或TNF刺激的同时施加正弦振荡剪切，细胞内F-actin的含量比未受剪切时呈下降趋势，其中f-MLP刺激的各对应剪切组，在频率升高到较大值后(约>1 Hz)，F-actin的含量开始上升，与单独剪切组相比较，趋势较一致；而TNF的各对应剪切组未见明显的升高点，与单独剪切组相比较略有差异。
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表2 CTB对中性粒细胞F-actin含量的影响
Table 2 Effect of CTB on the content of F-actin in neutrophils
无CTB无剪切
(n=4)
30μM CTB
(n=4)
30μM CTB+5.96s-1
(n=4)
无fMLP无TNF
100
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68.2±13.3**
71.0±18.4**
10-7M f-MLP
154.2±17.4
74.6±10.9##
82.7± 6.0##
10ng/ml TNF
135.9±11.8
72.4±13.4&&
81.2± 7.2&&
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表中数字为相对于对照组的荧光强度百分比，**：vs control P<0.01,##:vs f-MLP without shear P<0.01,&&:vs
TNF without shear P<0.01
图2 正弦振荡剪切对中性粒细胞F-actin含量的影响
Fig 2 Effect of sinusoidal-oscillatory shear on the content of F-actin in the neutrophils
—●—shear ——shear+fMLP —▲—shear+TNF
*,**:vs control P<0.05,P<0.01; #,##:vs f-MLP without shear P<0.05,P<0.01; &,&&:vs TNF without shear P<0.05,P<0.01，n=4
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3.3 稳定剪切流与正弦振荡剪切流的比较
比较图1和图2可以发现，正弦振荡剪切时，中性粒细胞内F-actin的含量由降低而升高的转折点最大切变率(约40s-1)比稳定剪切时(约60s-1)低。图3所示，稳定剪切的切变率为51.2s-1，正弦振荡剪切的最大切变率为49.3s-1，尽管切变率均在50s-1左右，F-actin下降程度明显不同。表明以正弦振荡形式施加的剪切对肌动蛋白聚合的影响也呈现双向性，但由于剪切方向及强度的变化使其对F-actin的作用更复杂，与稳定剪切时存在差异。
图3 不同类型剪切对F-actin的影响
Fig 3 Effect of different type of shear on the content of F-actin in neutrophils
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*:vs steady shear P<0.05,n=4
3.4 切应力对中性粒细胞肌动蛋白分布的影响
图4(见封3)所示为CLSM图像荧光分布的High coded projection分析，每幅图的上角是所分析的细胞。剪切作用前F-actin主要分布于细胞膜附近，形成一层较为致密的骨架，支撑起细胞的形状，剪切后这层骨架的荧光强度明显下降，细胞中央强度相对增加(Fig4a、b)，这一点与流式细胞仪的测定结果一致。f-MLP作用后，F-actin在细胞边缘形成一更为致密的骨架层，同时发现该层分布不均匀，提示在一些部位可能会有伪足形成；经过剪切后边缘层的分布显著下降(Fig4c、d)。CTB作用后，细胞边缘F-actin消失，代之以细胞中央分布相对丰富(Fig4e)，剪切后仍维持这种分布状态并有更加集中的趋势(Fig4f)。CTB作用后再加入f-MLP作用于细胞，F-actin分布仍是在细胞的中央部位，这时剪切也不会对分布有大的影响(Fig 4g、h)。
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图4 中性粒细胞内F-actin分布的CLSM图象处理结果
Fig 4 The result of CLSM images for the F-actin distribution in neutrophils(4a)：control，(4b)：shear under 5.96s-1，(4c)：stimulated by f-MLP (4b)：stimulated by f-MLP and shear under 5.96s-1，(4e)：added ctb，(4f)：shear under 5.96s-1 after CTB action，(4g)：stimulated by f-MLP after CTB action，(4h)：
stimulated by f-MLP and shear under 5.96s-1，after CTB action。
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为进一步定量地分析F-actin分布的变化，对各条件下所得到的细胞图像随机各取30个细胞做图像处理，得到的结果如图5。剪切作用使细胞边缘F-actin显著减少；f-MLP在激活细胞的同时使F-actin的分布更集中于边缘，形成一个致密带，此时若施加剪切，同样会显著降低这一区域的F-actin；CTB能使边缘F-actin基本消失，而中央明显增高；CTB作用后，f-MLP和剪切均不会改变F-actin的分布趋势。
图5 不同刺激条件对中性粒细胞内F-actin分布的影响
Fig 5 Effects of different stimulants on the distribution of F-actin in neutrophils
1:control, 2:shear, 3:f-MLP, 4:f-MLP+shear, 5:CTB,6:CTB+shear, 7:CTB+f-MLP，8:CTB+f-MLP+shear
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Shear means under shear rate 5.96s-1 n=30
*,**:vs control P<0.05,P<0.01; ##:vs f-MLP without shear P<0.05, P<0.01; &&:vs CTB P<0.05,P<0.01
4 讨 论
中性粒细胞在体内执行着重要的防御功能，其生理状态的变化将影响到抗炎、免疫和心脑血管等系统功能的正常发挥。中性粒细胞由骨髓成熟后主要储存在骨髓和边缘池，只有不到十分之一的成熟细胞在循环血液中，随着循环血液在机体内监视异物的入侵、执行防御功能。尽管循环中的中性粒细胞所占比例较少，但这些细胞是功能的直接执行者，所以，这一部分细胞的生理状态与整个细胞群所担负的功能有更直接关系。细胞进入循环后必然会根据生存环境的变化而调整自身的各种结构性质和功能状态[2]。
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肌动蛋白作为一种细胞内的结构蛋白，含量丰富，在中性粒细胞中约占全部蛋白重量的10%[2]。肌动蛋白有两种存在形式，分别为单体球状蛋白G-actin和纤维状多聚体F-actin，二者根据细胞的功能状态可以互相转化，在细胞静息状态时则达到一种动态的平衡。所谓动态平衡即不断有F-actin解聚和聚合，使细胞内两种状态的肌动蛋白在浓度上不变，从总体上讲，G-actin的含量要大于F-actin的含量。但由于F-actin参与细胞骨架的构建、细胞运动、细胞硬度与变形能力等多方面功能，因此，众多研究将F-actin作为重点。F-actin的解聚与聚合受到多种相关蛋白、ATP及Ca2+、Mg2+离子的调节作用，表现较为复杂。同时，由于F-actin纤维自身结构特点使之存在极性，即正极和负极，两极的反应能力、与结合蛋白的作用有着显著的差异，一般而言，两极聚合反应的结合常数相差5-6倍，这就进一步增加了F-actin调控的复杂性[3]。因此，研究F-actin的变化可以引发一系列值得深入探讨的问题，为了解中性粒细胞的细胞内调控机制提供有力证据。
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已有的研究表明，细胞骨架，特别是F-actin的含量及分布，对中性粒细胞的形状、硬度和胞浆粘度等细胞力学性质起着决定性的作用，F-actin含量增加使细胞硬度和胞浆粘度增大，在一些药物作用下，改变细胞中F-actin的含量，可以使细胞的力学性质被动地发生改变[4，5]。伴随着细胞在静态与流动之间的迁移，细胞承受的力学环境发生改变，每个细胞的力学模式必然有一个适应性改变，因而作为决定因素的F-actin就会在不同的力学作用下有不同的表现。Moazzam等研究发现[6]，中性粒细胞在静止状态下有伪足伸出，流动时伪足缩回。无论是在体观察还是体外采用微吸管试验，均有类似发现。同时，细胞内颗粒运动的规律也会在两种力学环境中有不同表现即：细胞流动时颗粒的运动程度大于静止状态，表明细胞流动时细胞浆的流动性增大。伪足的形成与消失、胞浆的流动性等均可以看成是F-actin变化的一种反映，由此可以推测F-actin的含量在不同切应力作用下可能发生改变。
从我们的实验结果可以看出，中性粒细胞在稳定切应力作用下，细胞中的F-actin含量明显下降，特别在较低的切变率时(如在50s-1以下)，随切变率增加F-actin含量进行性下降，最低可减少20%左右。以正弦振荡剪切作用于中性粒细胞，发现细胞中的F-actin含量也显著下降；振荡剪切的频率可能影响F-actin聚合，但也可能是由于切变率从最小值以到最大值之间以正弦频率振荡，并且有剪切方向的变化，使流体切应力作用复杂化。切应力作用使F-actin解聚，含量下降，从而降低了胞浆粘度。 当我们使用的切变率由100s-1上升至600s-1时，F-actin的含量是有升高的趋势，这一结果与已有的研究一致[7]，中性粒细胞内F-actin含量的变化可能与采用的剪切力的大小有关。本实验的最大切应力在4 dyne/cm2以下，如果切应力继续增高，F-actin的含量可能会大幅上升，从我们的结果中能看出这一趋势，表明F-actin的含量随着切应力的变化呈现双向改变。
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已有大量报道证实，f-MLP和TNF等因素尽管是不同类型的刺激因子，均可使中性粒细胞激活。在激活后的一个重要表现即为细胞有伪足伸出，F-actin含量升高[7，8]。有很多工作已经以此两种指标对中性粒细胞的激活程度进行评估。从我们的研究结果分析，f-MLP和TNF的确使F-actin的含量显著升高，但是同时施加的不同大小或形式的剪切作用，影响了升高的程度。流体剪切作用使F-actin含量改变与f-MLP、TNF等静态激活中性粒细胞使F-actin含量改变有一定的可迭加性，故推测力学刺激与化学刺激具有独立的不同机理，其间的细致差异需要深入研究。因此，在用F-actin的含量作为评价中性粒细胞激活程度的指标时，应考虑不同的流体力学条件，相同力学条件下的比较才有科学性。
我们的研究结果还发现，剪切作用后，F-actin的分布也有相应的改变，细胞膜附近由原来的密集变为稀疏。通常F-actin集中在细胞膜附近，以束状或二维网状应力纤维密集于其下，细胞膜与F-actin有着紧密的联系，他们之间的相互交联决定了细胞膜的硬度及流动性。膜附近F-actin含量的降低，必然减少了与膜的交联，使膜硬度下降，流动性增强，更加易于变形。f-MLP或TNF作用下，中性粒细胞伪足形成比例增高，同时F-actin也在细胞膜附近更加集中，切应力作用后细胞边缘的F-actin分布也显著降低。CTB可以使F-actin的交联下降，同时肌动蛋白的聚合也会降低[9]。从我们的结果中可以发现，CTB使细胞中F-actin的含量明显下降，并且由原来集中于边缘变为集中到中央，提示细胞内的F-actin在CTB作用下可能由边缘向中央迁移；这时，f-MLP和TNF的作用下F-actin上升的幅度也减小，且升高的部位也在细胞中央，表明f-MLP和TNF可以使细胞边缘和中央的F-actin都增加，但是以边缘为主；同时CTB作用后，剪切应力不会使F-actin降低而是有轻微升高，这现象在有无f-MLP和TNF组间均可以看到，进一步说明剪切应力大幅度降低了细胞边缘F-actin，而对中央的F-actin可能有升高，但总的结果是使细胞内F-actin含量降低。
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总之，中性粒细胞从静态进入到流动状态后，在一定的切应力范围内，为适应流体作用，减少流体阻力，通过使F-actin解聚降低F-actin的含量，进而改变细胞自身的力学特性，有利于细胞顺利地通过循环，完成其特有功能。如果切应力较高时，细胞为抵御流体切应力的破坏作用，通过促进聚合增加F-actin含量，这也是一种自我保护。力学作用下F-actin的含量改变与单独刺激因子作用下中性粒细胞激活后F-actin变化的调控途径可能是不同的，两者之间互不干扰，最终是以一种近似于加和的方式来综合表现的。值得进一步关注的问题是，中性粒细胞如何感受并传递力学信号，通过什么途径调节F-actin的解聚与聚合过程，从而达到力学适应的目的。这是细胞生物力学研究中最热也最棘手的问题。
致谢：四川大学生物力学研究所袁华博士为本研究提供了图像分析及结果处理，在此表示感谢!
* 国家自然科学基金重点资助项目(39830110)
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(收稿：1998-12-8), http://www.100md.com