靶向治疗中胰岛素的载体作用
作者：欧晓红 匡安仁
单位：欧晓红(华西医科大学 附属第一医院 核医学科，成都 610041)；匡安仁(华西医科大学 附属第一医院 核医学科，成都 610041)
关键词：胰岛素；胰岛素受体；靶向治疗；细胞核
生物医学工程学杂志000124 摘 要：胰岛素与细胞膜上的胰岛素受体结合后，配体-受体复合物能被内吞入细胞，部分胰岛素与受体分离并进入细胞核。某些化合物可与胰岛素偶连，通过胰岛素受体介导的内吞作用进入细胞，达到靶向治疗疾病的目的。
The Use of Insulin as Carrier In Targeted Therapy
Ou Xiaohong Kuang Anren
, 百拇医药 (Department of Nuclear Medicine, The First Affiliated Hospital, West China University of Medicine Sciences, Chengdu 610041)
Abstract：Upon insulin binding to its receptor, the receptor-ligand complexes will be internalized into the target cell. The internalized insulin will leave the endosome and associate with the nuclear matrix. This process might be useful for targeted therapy. Some complex can link with the insulin be internalized into the target cell by insulin receptor-mediated endocytosis and enter the cell nuclei to cure some diseases.
, 百拇医药
Key words：Insulin Insulin receptor Targeted therapy Cell nuclei▲
受体和其配体的结合具有特异性、选择性、饱和性、亲合力强和生物效应明显等特点。利用配体为药物或放射性核素的载体，通过受体介导作用，增加病灶局部药物浓度、提高疗效，降低毒副作用，达到靶向治疗目的，是目前研究最活跃的领域之一。近年来关于以胰岛素为载体，通过受体介导作用靶向治疗的研究受到重视，本文就此方面研究进行综述。
1 胰岛素受体
近年来的研究表明，多种肿瘤细胞膜上的胰岛素受体密度和亲合力增加，如Amir Rurtaran等的研究显示，人肝细胞癌的胰岛素受体密度为正常肝细胞的1000倍。其胰岛素受体与123I-Try(A14)-胰岛素结合的亲和力为正常肝细胞膜胰岛素受体的1.24倍[1]。另有研究显示，乳腺癌中胰岛素受体密度增高[2]；多发性骨髓瘤细胞表达胰岛素受体及其结合活性较正常B淋巴细胞增高[3]。这些肿瘤细胞上胰岛素受体的异常过度表达及其亲和力的明显增高，为利用受体介导靶向作用进行诊断和治疗肿瘤提供了结构和功能的基础。
, 百拇医药
细胞膜上胰岛素受体由两个α亚基和两个β亚基构成，α亚基与β亚基通过二硫键相连。α亚基在细胞外，分子量13.5KD，由719个氨基酸残基构成，具有与胰岛素特异结合的部位。β亚基跨膜存在于胞浆，跨膜部分只有一个α螺旋，分子量9.5KD，由820个氨基酸残基构成，其中跨膜结构域由23个疏水氨基酸残基构成α螺旋。β亚基在胞浆的C末端具有酪氨酸蛋白激酶(TPK)活性。
2 胰岛素进入细胞的机制
胰岛素与细胞膜上胰岛素受体结合后，引起自身酪氨酸的磷酸化，进而引起胞浆内多种含SH2结构的蛋白质磷酸化。其中PP120磷酸化与β亚基近膜区域相互作用，从而引起受体-胰岛素复合物在细胞膜上移动、聚集成簇，进而内陷入细胞[4]。有研究表明激酶功能缺陷的受体不能在细胞膜表面移动和聚集，也不能内陷入细胞。另有研究表明β亚基上NPEY motif及其周围氨基酸残基对受体-胰岛素复合物的内陷起决定性作用[5]。但胰岛素进入细胞还可通过非受体介导途径进行，如胞饮。
, 百拇医药
胰岛素被内吞后的去向及其进入细胞核的机理尚未十分明确。有人将H35肝癌细胞与胰岛素-微金粒结合物共同孵育后，经银加强，在电镜下观察，发现胰岛素内吞达到高锋后，胰岛素—微金粒结合物出现于胞浆、核及微粒体。这一结果提示胰岛素可能从内吞小体释放入胞浆，再由胞浆进入细胞核或微粒体[6]。
3 胰岛素进入细胞核的机制
有人报告，将从H35肝癌细胞中分离的细胞核与胰岛素-BSA-微金粒共价结合物共同孵育后，在电镜下观察发现胰岛素穿过核孔进入细胞核，并与异染色质结合，或与核基质结合[7]。Peralta soler A等用H35肝癌细胞和转染并表达了人胰岛素受体基因的NIH/3T3成纤维细胞研究胰岛素在细胞核中的聚集，发现胰岛素-受体复合物被内吞后，胰岛素从受体上解离下来，部分胰岛素在细胞核中聚集，而胰岛素受体并不进入细胞核[8]。胰岛素的降解主要是由特异性胰岛素降解酶(IDE)引起，而IDE主要存在于细胞浆中。一般来说胰岛素一旦进入细胞浆就会立即被降解，然而目前的研究发现从核内提取的胰岛素基本上是完整的，IDE的调节对胰岛素在核内的聚集有重要作用，Shuko Harada等用1，10-邻二氮杂菲阻断IDE作用，使胰岛素降解大为减少，核内胰岛素聚集量明显增加，而未改变细胞结合胰岛素总量及细胞内胰岛素量。说明IDE的抑制增加了胰岛素从胞浆至胞核的转移[9]。
, 百拇医药
Robert M Smith等用H35肝癌细胞与125I标记的胰岛素共同孵育，并分别加入亲酸制剂、单价离子载体、ATP抑制剂等，观察细胞总结合胰岛素量、胞内胰岛素量及核内胰岛素量。结果表明，胰岛素进入细胞与孵育的时间和温度相关。在胰岛素浓度为5～50 ng/ml时，进入细胞核的胰岛素量与胰岛素浓度成正比，并不依赖于ATP，即不需要能量。亲酸剂氯奎及溶酶体酶抑制剂亮肽素不能影响胰岛素降解，而单价离子载体莫能菌素在低浓度下抑制胰岛素进入细胞核，但最大抑制率不超过50%。因为莫能菌素在低浓度下(0.01～1.00 uM)能抑制高尔基氏器的分泌，故提示胰岛素进入细胞核是经过高尔基氏器分泌途径，并存在其他胰岛素至核的转运途径[10]。
Shuko harada等用胰蛋白酶处理H35鼠肝癌细胞以阻止其细胞膜上的胰岛素受体与胰岛素结合。将处理过的细胞与胰岛素共同孵育后，比较实验组与对照组的胰岛素的总结合量、胞内胰岛素量及核内胰岛素量。结果表明在胰岛素的浓度较低时(2.8ng/ml)，实验组细胞的总结合胰岛素量、胞内胰岛素量及核内胰岛素量较对照组明显减少。而在胰岛素浓度较高时(100 ng/ml)，在90分钟以内，实验组细胞胞膜上的胰岛素结合完全被阻断；而60分钟时细胞内胰岛素量只比对照组减少50%，核内胰岛素量与对照组无明显差异。这说明在低的胰岛素浓度下受体介导的内吞对胰岛素入核起着重要作用，而在高的胰岛素浓度下，非受体介导的摄入途径对胰岛素入核的作用占优势[11]。
, 百拇医药
4 胰岛素作用机理
长期以来胰岛素的作用机制被认为是当胰岛素与细胞膜上受体的α-亚基结合后，通过β-亚基的自身磷酸化引发一系列蛋白质酪氨酸磷酸化过程，从而对生物体的代谢和生长 进行调节。而胰岛素与其受体的复合物被内吞入细胞，受特异性的降解酶所降解，从而停止其生理效应。近年来的研究表明，受体-胰岛素复合物被内吞入细胞后，胰岛素能进入细胞核发挥作用。Miller曾将胰岛素直接注入xenqous细胞浆，引起RNA及蛋白质的合成[12]。Androlewicz等发现PG19鼠的黑色素细胞表面胰岛素受体不能被内吞，但保留有酪氨酸激酶活性，胰岛素不能刺激此处细胞生长[13]。与此相反Debant等发现CHO细胞上的变异胰岛素受体酪氨酸激酶功能缺陷，但能被内吞入细胞，胰岛素可刺激其分裂[14]。另有文献报导，在分离的细胞核中加入胰岛素可影响跨核膜大分子的运输、蛋白质磷酸化酶的活性；导致mRNA由核释放、胞浆内mRNA升高。以上研究表明胰岛素的内吞及其与细胞核的直接作用可能起着调节细胞生长分化等重要功能。
, 百拇医药
关于细胞核膜或核内胰岛素受体的研究尚未十分明确。Kim SJ等人用胰岛素处理脂细胞后进行蔗糖密度梯度离心，所提取细胞核用免疫沉淀法处理，结果发现，核胰岛素受体快速增加，并且与细胞膜上受体不同(在1%的三硝基苯x-100中的溶解度)[15]。另有报道胰岛素核受体存在于内层核膜上[16]。
总之，胰岛素通过胞膜上受体介导或胞饮作用进入细胞核后，在内小体中低pH值下与受体分离，然后进入细胞浆。部分胰岛素与微粒体特异性结合，部分胰岛素从细胞浆中通过某种途径经核孔进入细胞核，与核基质或异染色质结合，从而调节细胞的生长分化或基因的表达。
胰岛素与核作用的机理尚未十分明确，目前的研究表明可能有核内蛋白质的磷酸化与脱磷酸化；mRNA的转录和转运的调节等。
5 胰岛素在靶向治疗中的载体作用
, 百拇医药 近年来对胰岛素受体及胰岛素研究表明，利用胰岛素为载体，用于靶向治疗具有极大的可行性。首先，多种肿瘤细胞异常过度表达胰岛素受体，如肝细胞癌、乳腺癌等。其次，胰岛素为51肽，比许多小分子配体大(如生长抑素为14肽，血管活性肠肽为28肽)易于标记，A链14位及19位酪氨酸易于标上125I
或211At等放射性核素，可供偶联部位较多，利于与多种化合物偶联，Poznasky等将其与牛血清白蛋白偶联[17]，Andrey A将其与聚赖氨酸偶联[20]。
目前，利用胰岛素受体识别胰岛素的特异性及有效性，展开了多种胰岛素受体介导靶向治疗的研究，如将目标酶或目的基因选择性导入细胞，以纠正酶或基因缺陷，Poznasky等将a-1,4-葡萄糖苷酶与清蛋白-胰岛素共价结合，利用 胰岛素的靶向载体作用，将其导入肌细胞和肝细胞中[17]；Wu-GY等利用胰岛素作为载体，将外源性基因成功转染入大鼠肝内的HepG2肝癌细胞内[18]。这些研究中以基因转移最为成功，即用胰岛素作载体，通过受体介导内吞作用，将外源性基因导向插入靶细胞特定的DNA链中，并获得稳定表达，这一技术已被成功地用于细胞DNA转染方面的研究。在此着重叙述这一方面研究。
, 百拇医药
精确地将某种功能基因插入并整合到哺乳动物细胞DNA中这一技术，近年来获得多方面应用，如研究蛋白质的功能域；分析基因表达调节的机制；研究细胞分化的阶段性；分析癌基因及致癌基因在肿瘤发生中的作用；制造基因变异的动物模型及纠正各种基因缺陷性疾病。目前用于基因转移的方法有多种，其中最直接和常用的方法是磷酸钙共沉淀法。然而最近的研究表明，经磷酸钙处理后，基因的表达受到影响。向细胞核内直接微注射DNA的方法需对每个待注射的细胞做特殊处理，故适用范围较窄。电穿孔的方法对细胞有损伤且转染效率较低。这些方法只适用于体外转染。近年来发展的经膜结合载体介导的DNA转染方法，如利用原生质体、重组病毒外壳及脂质体可用于体内或体外转染。利用重组病毒作为载体，将目的基因转移至靶细胞，特别是逆转录病毒作为基因转移的载体，具有感染效率高和外源性基因整合到细胞基因组中等优点，因而成为基因治疗研究中最为有用的基因转移载体。但构建重组逆转录病毒的技术过于复杂，对于许多直接应用来说存在很大难度。
目前发展的利用受体介导的内吞作用转移DNA的方法，即将裸露DNA连接至蛋白配体上，利用受体识别配体的特异性和有效性，将DNA内吞入细胞。其中用胰岛素作为配体的研究得到普遍重视。研究表明，利用配体将DNA导入细胞的途径中，DNA穿过细胞膜的效率较高，但进入细胞内后去向不易控制，易被酶所降解或受到各种质膜的阻挡，不能进入细胞核，而且胰岛素做配体在这一方面具有独特优势，因为胰岛素的降解不同于其它配体，主要在内小体或胞浆中进行，而非在溶酶体中。所以与胰岛素偶联的DNA不会立即受到溶酶体中核酸酶的作用。胰岛素能进入细胞核，有利于将DNA导入核内。实验证明胰岛素与多种化合物共价连结后，仍具有与胰岛素受体结合的活性，并能被内吞入细胞，出现于细胞核中。
, http://www.100md.com
目前所用的方法主要是利用裸露DNA磷酸二酯键骨架带大量负电荷这一特性，将胰岛素与带有大量正电荷的蛋白质或多肽共价结合后，与DNA形成牢固的盐键，从而由胰岛素受体结合并将其内吞入细胞，进而转运至细胞核与核酸结合，整合入细胞DNA，得到稳定表达。
Barbara Huckett等用可溶性碳化二亚胺处理血清白蛋白，使其天冬氨酸及谷氨酸残基的羧基乙酰化，从而带有大量正电荷，再用戊二醛将其与胰岛素偶联，经硝化纤维滤过、结合及凝胶结合变化分析检测，这种化合物与DNA结合率较高。竞争结合实验表明，胰岛素-清蛋白-DNA化合物能与[125I]-胰岛素竞争与胰岛素受体结合。当表达型质粒载体ptkNEO和pAL-8与这种化合物结合后，在体外细胞系中获得稳定表达[19]。
Andrey A将含有SV40大T抗原的质粒与胰岛素和多降赖氨酸的共价化合物通过静电引力连接后，选择性转染具有胰岛素受体的PLC/PRF/5人类肝癌细胞，并获得表达[20]。
, 百拇医药
目前胰岛素受体介导的靶向治疗还处于体外试验阶段，并存在着多种缺陷，例如胰岛素作为基因转移的载体，其进入细胞核的比率较低，因此基因稳定表达的概率较低。随着胰岛素作用机制的进一步明确，必将探索出多种更有效、更简便易行的靶向治疗方法。
用胰岛素作载体除可以进行基因转移外，还可以用各种放射性核素标记胰岛素做内照射治疗。如利用186Re发射β射线或125I发射的俄歇电子，借胰岛素受体介导的靶向性达到杀死肿瘤细胞的作用。此外，胰岛素尚可与某些化疗药物偶联，将这些化疗药物靶向导入肿瘤细胞，达到增加病变细胞内药物浓度，减少毒副作用的目的，提高其疗效。还可将胰岛素与某些阻碍细胞蛋白合成的毒素偶联，如与植物毒素皂甙或细胞毒素单孢菌外毒素的偶联，通过胰岛素受体介导可达到靶向治疗肿瘤的目的。
6 小结
多种肿瘤细胞表面胰岛素受体密度及其亲和力增高，利用胰岛素作为载体能特异性将多种化合物导向进入肿瘤细胞，并能作用于细胞核，杀伤或抑制肿瘤细胞，达到靶向治疗目的。胰岛素是一种较为理想的载体，加强其在靶向治疗中的应用很有必要。
, 百拇医药
参考文献：
[1]Kurtaran A, Li SR, Raderer M et al. Technetium-99m-galactocyl-neoglycoalyco-albumin combined with iodine-123 Tyr(A14) insulin visualized human hepatocellular carcinomas. J Nucl Med, 1995; 36(10)∶1875
[2]Frittiltta L, vigneri R, Stampfer MR et al. Insulin receptor overexpression in 184B5 human mamary epithelial cells induces a ligand-dependent transformed Phenotype. J cell Biochem, 1995; 57(4)∶666
, 百拇医药
[3]Freund GG, Kulas DT, Way BA et al. Functional insulin and insulin-like growth factor-1 receptors are preferentially expressed in multiple myeloma cell lines as compared to lymphoblastoid cell lines. Cancer Res, 1994; 54(12)∶3179
[4]Najjar SM, Choice CV, Soni P. Effect of PP120 on receptor-mediated insulin endocytosis regulated by the juxtamembrane domain of the insulin receptor. J Biol Chem, 1998; 273(21)∶12923
[5]Smith RM, Zhang S, WHite MF et al. The role of receptor kinase activity and the NPEY 960 motif in insulin-accelerated receptor-mediated insulin internalization. J Recept Signal Transduct Res, 1996; 16(5-6)∶339
, http://www.100md.com
[6]Shah N, Zhang S, Harada S et al. Electron Microscopic Visulization of insulin translocation into the cytoplasm and nuclei of intact H35 Hepatoma cells using covalently linked Nanogold-Insulin. Endocrinology, 1995; 136(7)∶2825
[7] Soler AP, Smith RM, Jarett L. Insulin stimulates Accumulation and Efflux of Maromolecules in isolated nuclei from H35 Hepatoma cells. Diabetes, 1992; 41∶194
[8] Soler AP, Thompson KA, Smith RM et al. immunological demonstration of the accumlation of insulin, but not insulin receptors, in nuclei of insulin-treated cells. Proc Natl Acad Sci USA, 1989; 86∶6640
, 百拇医药
[9]Harada S, Smith RM, Smith JA et al. Inhibition of insulin Degrading Enzyme Increases Translocation of Insulin to the Nucleus in H35 Rat Hepatoma cells: Evidence of a cytosolic Pathway. Endocrinology, 1993; 132(6)∶2293
[10]Smith RM, Jarett L. Partial characterization of mechanism of insulin accumulation in H35 hepatoma cell nuclei. Dlabetas, 1990; 39∶683
[11]Harada S, Loten EG, Smith RM et al. Non-receptor mediated nuclear accumulation of insulin in H35 hepatoma cells. J cell physiol, 1992; 153∶607
, 百拇医药
[12]Miller DS. Stimulation of RNA protein synthesis by intracellubr insulin. Science, 1988; 240∶506
[13]Androlewicz MJ, Brandenburg DF, Straus DS. Insulin receptor internalization defect in an insulin-resistant mouse melanoma cell line. Biochemistry, 1989; 28∶9750
[14]Debant A, Clauser E, Ponzio G et al. Replacement of insulin receptor tyrosine residues 1162 and 1163 does not alter the mitogenic effect of the hormone. Proc Natl Acad Sci USA, 1988; 85∶8032
, http://www.100md.com
[15]Kim SJ, Kahn CR. Insulin indues rapid accmulation of insulin receptors and increases tyrosine kinase activity in the nucleus of cultured adipocytes. Journal of cellular physiology, 1993; 157∶217
[16]Wong KY, Hawley D, Vigneri R et al. Comparison of solubilized and purified plasma membrane and nuclear insulin receptors. Biochemistry, 1988; 253∶2098
[17]Poznasky MJ, Singh R, Singh B et al. Insulin carrier potential for enzyme and durg therapy. Science, 1984; 137∶266
, 百拇医药
[18]Wu GY, Wu CH. Receptor-medicated gene delivery and expression in vivo. J Biol Chem, 1988; 263∶14261
[19]Huchett B, Ariatti M, Hawtrey AO. Evidence for targeted gene transfer by receptor mediated endocytosis. Biochemical pharmacology, 1990; 40(2)∶253
[20]Rosenkranz AA, Yachmenev SV, Jans DA et al. Receptor mediated endocytosis and nuclear transport of a transfecting DNA consturct. Experimental cell research, 1992; 189∶323
收稿日期：1999-02-05, 百拇医药
单位：欧晓红(华西医科大学 附属第一医院 核医学科，成都 610041)；匡安仁(华西医科大学 附属第一医院 核医学科，成都 610041)
关键词：胰岛素；胰岛素受体；靶向治疗；细胞核
生物医学工程学杂志000124 摘 要：胰岛素与细胞膜上的胰岛素受体结合后，配体-受体复合物能被内吞入细胞，部分胰岛素与受体分离并进入细胞核。某些化合物可与胰岛素偶连，通过胰岛素受体介导的内吞作用进入细胞，达到靶向治疗疾病的目的。
The Use of Insulin as Carrier In Targeted Therapy
Ou Xiaohong Kuang Anren
, 百拇医药 (Department of Nuclear Medicine, The First Affiliated Hospital, West China University of Medicine Sciences, Chengdu 610041)
Abstract：Upon insulin binding to its receptor, the receptor-ligand complexes will be internalized into the target cell. The internalized insulin will leave the endosome and associate with the nuclear matrix. This process might be useful for targeted therapy. Some complex can link with the insulin be internalized into the target cell by insulin receptor-mediated endocytosis and enter the cell nuclei to cure some diseases.
, 百拇医药
Key words：Insulin Insulin receptor Targeted therapy Cell nuclei▲
受体和其配体的结合具有特异性、选择性、饱和性、亲合力强和生物效应明显等特点。利用配体为药物或放射性核素的载体，通过受体介导作用，增加病灶局部药物浓度、提高疗效，降低毒副作用，达到靶向治疗目的，是目前研究最活跃的领域之一。近年来关于以胰岛素为载体，通过受体介导作用靶向治疗的研究受到重视，本文就此方面研究进行综述。
1 胰岛素受体
近年来的研究表明，多种肿瘤细胞膜上的胰岛素受体密度和亲合力增加，如Amir Rurtaran等的研究显示，人肝细胞癌的胰岛素受体密度为正常肝细胞的1000倍。其胰岛素受体与123I-Try(A14)-胰岛素结合的亲和力为正常肝细胞膜胰岛素受体的1.24倍[1]。另有研究显示，乳腺癌中胰岛素受体密度增高[2]；多发性骨髓瘤细胞表达胰岛素受体及其结合活性较正常B淋巴细胞增高[3]。这些肿瘤细胞上胰岛素受体的异常过度表达及其亲和力的明显增高，为利用受体介导靶向作用进行诊断和治疗肿瘤提供了结构和功能的基础。
, 百拇医药
细胞膜上胰岛素受体由两个α亚基和两个β亚基构成，α亚基与β亚基通过二硫键相连。α亚基在细胞外，分子量13.5KD，由719个氨基酸残基构成，具有与胰岛素特异结合的部位。β亚基跨膜存在于胞浆，跨膜部分只有一个α螺旋，分子量9.5KD，由820个氨基酸残基构成，其中跨膜结构域由23个疏水氨基酸残基构成α螺旋。β亚基在胞浆的C末端具有酪氨酸蛋白激酶(TPK)活性。
2 胰岛素进入细胞的机制
胰岛素与细胞膜上胰岛素受体结合后，引起自身酪氨酸的磷酸化，进而引起胞浆内多种含SH2结构的蛋白质磷酸化。其中PP120磷酸化与β亚基近膜区域相互作用，从而引起受体-胰岛素复合物在细胞膜上移动、聚集成簇，进而内陷入细胞[4]。有研究表明激酶功能缺陷的受体不能在细胞膜表面移动和聚集，也不能内陷入细胞。另有研究表明β亚基上NPEY motif及其周围氨基酸残基对受体-胰岛素复合物的内陷起决定性作用[5]。但胰岛素进入细胞还可通过非受体介导途径进行，如胞饮。
, 百拇医药
胰岛素被内吞后的去向及其进入细胞核的机理尚未十分明确。有人将H35肝癌细胞与胰岛素-微金粒结合物共同孵育后，经银加强，在电镜下观察，发现胰岛素内吞达到高锋后，胰岛素—微金粒结合物出现于胞浆、核及微粒体。这一结果提示胰岛素可能从内吞小体释放入胞浆，再由胞浆进入细胞核或微粒体[6]。
3 胰岛素进入细胞核的机制
有人报告，将从H35肝癌细胞中分离的细胞核与胰岛素-BSA-微金粒共价结合物共同孵育后，在电镜下观察发现胰岛素穿过核孔进入细胞核，并与异染色质结合，或与核基质结合[7]。Peralta soler A等用H35肝癌细胞和转染并表达了人胰岛素受体基因的NIH/3T3成纤维细胞研究胰岛素在细胞核中的聚集，发现胰岛素-受体复合物被内吞后，胰岛素从受体上解离下来，部分胰岛素在细胞核中聚集，而胰岛素受体并不进入细胞核[8]。胰岛素的降解主要是由特异性胰岛素降解酶(IDE)引起，而IDE主要存在于细胞浆中。一般来说胰岛素一旦进入细胞浆就会立即被降解，然而目前的研究发现从核内提取的胰岛素基本上是完整的，IDE的调节对胰岛素在核内的聚集有重要作用，Shuko Harada等用1，10-邻二氮杂菲阻断IDE作用，使胰岛素降解大为减少，核内胰岛素聚集量明显增加，而未改变细胞结合胰岛素总量及细胞内胰岛素量。说明IDE的抑制增加了胰岛素从胞浆至胞核的转移[9]。
, 百拇医药
Robert M Smith等用H35肝癌细胞与125I标记的胰岛素共同孵育，并分别加入亲酸制剂、单价离子载体、ATP抑制剂等，观察细胞总结合胰岛素量、胞内胰岛素量及核内胰岛素量。结果表明，胰岛素进入细胞与孵育的时间和温度相关。在胰岛素浓度为5～50 ng/ml时，进入细胞核的胰岛素量与胰岛素浓度成正比，并不依赖于ATP，即不需要能量。亲酸剂氯奎及溶酶体酶抑制剂亮肽素不能影响胰岛素降解，而单价离子载体莫能菌素在低浓度下抑制胰岛素进入细胞核，但最大抑制率不超过50%。因为莫能菌素在低浓度下(0.01～1.00 uM)能抑制高尔基氏器的分泌，故提示胰岛素进入细胞核是经过高尔基氏器分泌途径，并存在其他胰岛素至核的转运途径[10]。
Shuko harada等用胰蛋白酶处理H35鼠肝癌细胞以阻止其细胞膜上的胰岛素受体与胰岛素结合。将处理过的细胞与胰岛素共同孵育后，比较实验组与对照组的胰岛素的总结合量、胞内胰岛素量及核内胰岛素量。结果表明在胰岛素的浓度较低时(2.8ng/ml)，实验组细胞的总结合胰岛素量、胞内胰岛素量及核内胰岛素量较对照组明显减少。而在胰岛素浓度较高时(100 ng/ml)，在90分钟以内，实验组细胞胞膜上的胰岛素结合完全被阻断；而60分钟时细胞内胰岛素量只比对照组减少50%，核内胰岛素量与对照组无明显差异。这说明在低的胰岛素浓度下受体介导的内吞对胰岛素入核起着重要作用，而在高的胰岛素浓度下，非受体介导的摄入途径对胰岛素入核的作用占优势[11]。
, 百拇医药
4 胰岛素作用机理
长期以来胰岛素的作用机制被认为是当胰岛素与细胞膜上受体的α-亚基结合后，通过β-亚基的自身磷酸化引发一系列蛋白质酪氨酸磷酸化过程，从而对生物体的代谢和生长 进行调节。而胰岛素与其受体的复合物被内吞入细胞，受特异性的降解酶所降解，从而停止其生理效应。近年来的研究表明，受体-胰岛素复合物被内吞入细胞后，胰岛素能进入细胞核发挥作用。Miller曾将胰岛素直接注入xenqous细胞浆，引起RNA及蛋白质的合成[12]。Androlewicz等发现PG19鼠的黑色素细胞表面胰岛素受体不能被内吞，但保留有酪氨酸激酶活性，胰岛素不能刺激此处细胞生长[13]。与此相反Debant等发现CHO细胞上的变异胰岛素受体酪氨酸激酶功能缺陷，但能被内吞入细胞，胰岛素可刺激其分裂[14]。另有文献报导，在分离的细胞核中加入胰岛素可影响跨核膜大分子的运输、蛋白质磷酸化酶的活性；导致mRNA由核释放、胞浆内mRNA升高。以上研究表明胰岛素的内吞及其与细胞核的直接作用可能起着调节细胞生长分化等重要功能。
, 百拇医药
关于细胞核膜或核内胰岛素受体的研究尚未十分明确。Kim SJ等人用胰岛素处理脂细胞后进行蔗糖密度梯度离心，所提取细胞核用免疫沉淀法处理，结果发现，核胰岛素受体快速增加，并且与细胞膜上受体不同(在1%的三硝基苯x-100中的溶解度)[15]。另有报道胰岛素核受体存在于内层核膜上[16]。
总之，胰岛素通过胞膜上受体介导或胞饮作用进入细胞核后，在内小体中低pH值下与受体分离，然后进入细胞浆。部分胰岛素与微粒体特异性结合，部分胰岛素从细胞浆中通过某种途径经核孔进入细胞核，与核基质或异染色质结合，从而调节细胞的生长分化或基因的表达。
胰岛素与核作用的机理尚未十分明确，目前的研究表明可能有核内蛋白质的磷酸化与脱磷酸化；mRNA的转录和转运的调节等。
5 胰岛素在靶向治疗中的载体作用
, 百拇医药 近年来对胰岛素受体及胰岛素研究表明，利用胰岛素为载体，用于靶向治疗具有极大的可行性。首先，多种肿瘤细胞异常过度表达胰岛素受体，如肝细胞癌、乳腺癌等。其次，胰岛素为51肽，比许多小分子配体大(如生长抑素为14肽，血管活性肠肽为28肽)易于标记，A链14位及19位酪氨酸易于标上125I
或211At等放射性核素，可供偶联部位较多，利于与多种化合物偶联，Poznasky等将其与牛血清白蛋白偶联[17]，Andrey A将其与聚赖氨酸偶联[20]。
目前，利用胰岛素受体识别胰岛素的特异性及有效性，展开了多种胰岛素受体介导靶向治疗的研究，如将目标酶或目的基因选择性导入细胞，以纠正酶或基因缺陷，Poznasky等将a-1,4-葡萄糖苷酶与清蛋白-胰岛素共价结合，利用 胰岛素的靶向载体作用，将其导入肌细胞和肝细胞中[17]；Wu-GY等利用胰岛素作为载体，将外源性基因成功转染入大鼠肝内的HepG2肝癌细胞内[18]。这些研究中以基因转移最为成功，即用胰岛素作载体，通过受体介导内吞作用，将外源性基因导向插入靶细胞特定的DNA链中，并获得稳定表达，这一技术已被成功地用于细胞DNA转染方面的研究。在此着重叙述这一方面研究。
, 百拇医药
精确地将某种功能基因插入并整合到哺乳动物细胞DNA中这一技术，近年来获得多方面应用，如研究蛋白质的功能域；分析基因表达调节的机制；研究细胞分化的阶段性；分析癌基因及致癌基因在肿瘤发生中的作用；制造基因变异的动物模型及纠正各种基因缺陷性疾病。目前用于基因转移的方法有多种，其中最直接和常用的方法是磷酸钙共沉淀法。然而最近的研究表明，经磷酸钙处理后，基因的表达受到影响。向细胞核内直接微注射DNA的方法需对每个待注射的细胞做特殊处理，故适用范围较窄。电穿孔的方法对细胞有损伤且转染效率较低。这些方法只适用于体外转染。近年来发展的经膜结合载体介导的DNA转染方法，如利用原生质体、重组病毒外壳及脂质体可用于体内或体外转染。利用重组病毒作为载体，将目的基因转移至靶细胞，特别是逆转录病毒作为基因转移的载体，具有感染效率高和外源性基因整合到细胞基因组中等优点，因而成为基因治疗研究中最为有用的基因转移载体。但构建重组逆转录病毒的技术过于复杂，对于许多直接应用来说存在很大难度。
目前发展的利用受体介导的内吞作用转移DNA的方法，即将裸露DNA连接至蛋白配体上，利用受体识别配体的特异性和有效性，将DNA内吞入细胞。其中用胰岛素作为配体的研究得到普遍重视。研究表明，利用配体将DNA导入细胞的途径中，DNA穿过细胞膜的效率较高，但进入细胞内后去向不易控制，易被酶所降解或受到各种质膜的阻挡，不能进入细胞核，而且胰岛素做配体在这一方面具有独特优势，因为胰岛素的降解不同于其它配体，主要在内小体或胞浆中进行，而非在溶酶体中。所以与胰岛素偶联的DNA不会立即受到溶酶体中核酸酶的作用。胰岛素能进入细胞核，有利于将DNA导入核内。实验证明胰岛素与多种化合物共价连结后，仍具有与胰岛素受体结合的活性，并能被内吞入细胞，出现于细胞核中。
, http://www.100md.com
目前所用的方法主要是利用裸露DNA磷酸二酯键骨架带大量负电荷这一特性，将胰岛素与带有大量正电荷的蛋白质或多肽共价结合后，与DNA形成牢固的盐键，从而由胰岛素受体结合并将其内吞入细胞，进而转运至细胞核与核酸结合，整合入细胞DNA，得到稳定表达。
Barbara Huckett等用可溶性碳化二亚胺处理血清白蛋白，使其天冬氨酸及谷氨酸残基的羧基乙酰化，从而带有大量正电荷，再用戊二醛将其与胰岛素偶联，经硝化纤维滤过、结合及凝胶结合变化分析检测，这种化合物与DNA结合率较高。竞争结合实验表明，胰岛素-清蛋白-DNA化合物能与[125I]-胰岛素竞争与胰岛素受体结合。当表达型质粒载体ptkNEO和pAL-8与这种化合物结合后，在体外细胞系中获得稳定表达[19]。
Andrey A将含有SV40大T抗原的质粒与胰岛素和多降赖氨酸的共价化合物通过静电引力连接后，选择性转染具有胰岛素受体的PLC/PRF/5人类肝癌细胞，并获得表达[20]。
, 百拇医药
目前胰岛素受体介导的靶向治疗还处于体外试验阶段，并存在着多种缺陷，例如胰岛素作为基因转移的载体，其进入细胞核的比率较低，因此基因稳定表达的概率较低。随着胰岛素作用机制的进一步明确，必将探索出多种更有效、更简便易行的靶向治疗方法。
用胰岛素作载体除可以进行基因转移外，还可以用各种放射性核素标记胰岛素做内照射治疗。如利用186Re发射β射线或125I发射的俄歇电子，借胰岛素受体介导的靶向性达到杀死肿瘤细胞的作用。此外，胰岛素尚可与某些化疗药物偶联，将这些化疗药物靶向导入肿瘤细胞，达到增加病变细胞内药物浓度，减少毒副作用的目的，提高其疗效。还可将胰岛素与某些阻碍细胞蛋白合成的毒素偶联，如与植物毒素皂甙或细胞毒素单孢菌外毒素的偶联，通过胰岛素受体介导可达到靶向治疗肿瘤的目的。
6 小结
多种肿瘤细胞表面胰岛素受体密度及其亲和力增高，利用胰岛素作为载体能特异性将多种化合物导向进入肿瘤细胞，并能作用于细胞核，杀伤或抑制肿瘤细胞，达到靶向治疗目的。胰岛素是一种较为理想的载体，加强其在靶向治疗中的应用很有必要。
, 百拇医药
参考文献：
[1]Kurtaran A, Li SR, Raderer M et al. Technetium-99m-galactocyl-neoglycoalyco-albumin combined with iodine-123 Tyr(A14) insulin visualized human hepatocellular carcinomas. J Nucl Med, 1995; 36(10)∶1875
[2]Frittiltta L, vigneri R, Stampfer MR et al. Insulin receptor overexpression in 184B5 human mamary epithelial cells induces a ligand-dependent transformed Phenotype. J cell Biochem, 1995; 57(4)∶666
, 百拇医药
[3]Freund GG, Kulas DT, Way BA et al. Functional insulin and insulin-like growth factor-1 receptors are preferentially expressed in multiple myeloma cell lines as compared to lymphoblastoid cell lines. Cancer Res, 1994; 54(12)∶3179
[4]Najjar SM, Choice CV, Soni P. Effect of PP120 on receptor-mediated insulin endocytosis regulated by the juxtamembrane domain of the insulin receptor. J Biol Chem, 1998; 273(21)∶12923
[5]Smith RM, Zhang S, WHite MF et al. The role of receptor kinase activity and the NPEY 960 motif in insulin-accelerated receptor-mediated insulin internalization. J Recept Signal Transduct Res, 1996; 16(5-6)∶339
, http://www.100md.com
[6]Shah N, Zhang S, Harada S et al. Electron Microscopic Visulization of insulin translocation into the cytoplasm and nuclei of intact H35 Hepatoma cells using covalently linked Nanogold-Insulin. Endocrinology, 1995; 136(7)∶2825
[7] Soler AP, Smith RM, Jarett L. Insulin stimulates Accumulation and Efflux of Maromolecules in isolated nuclei from H35 Hepatoma cells. Diabetes, 1992; 41∶194
[8] Soler AP, Thompson KA, Smith RM et al. immunological demonstration of the accumlation of insulin, but not insulin receptors, in nuclei of insulin-treated cells. Proc Natl Acad Sci USA, 1989; 86∶6640
, 百拇医药
[9]Harada S, Smith RM, Smith JA et al. Inhibition of insulin Degrading Enzyme Increases Translocation of Insulin to the Nucleus in H35 Rat Hepatoma cells: Evidence of a cytosolic Pathway. Endocrinology, 1993; 132(6)∶2293
[10]Smith RM, Jarett L. Partial characterization of mechanism of insulin accumulation in H35 hepatoma cell nuclei. Dlabetas, 1990; 39∶683
[11]Harada S, Loten EG, Smith RM et al. Non-receptor mediated nuclear accumulation of insulin in H35 hepatoma cells. J cell physiol, 1992; 153∶607
, 百拇医药
[12]Miller DS. Stimulation of RNA protein synthesis by intracellubr insulin. Science, 1988; 240∶506
[13]Androlewicz MJ, Brandenburg DF, Straus DS. Insulin receptor internalization defect in an insulin-resistant mouse melanoma cell line. Biochemistry, 1989; 28∶9750
[14]Debant A, Clauser E, Ponzio G et al. Replacement of insulin receptor tyrosine residues 1162 and 1163 does not alter the mitogenic effect of the hormone. Proc Natl Acad Sci USA, 1988; 85∶8032
, http://www.100md.com
[15]Kim SJ, Kahn CR. Insulin indues rapid accmulation of insulin receptors and increases tyrosine kinase activity in the nucleus of cultured adipocytes. Journal of cellular physiology, 1993; 157∶217
[16]Wong KY, Hawley D, Vigneri R et al. Comparison of solubilized and purified plasma membrane and nuclear insulin receptors. Biochemistry, 1988; 253∶2098
[17]Poznasky MJ, Singh R, Singh B et al. Insulin carrier potential for enzyme and durg therapy. Science, 1984; 137∶266
, 百拇医药
[18]Wu GY, Wu CH. Receptor-medicated gene delivery and expression in vivo. J Biol Chem, 1988; 263∶14261
[19]Huchett B, Ariatti M, Hawtrey AO. Evidence for targeted gene transfer by receptor mediated endocytosis. Biochemical pharmacology, 1990; 40(2)∶253
[20]Rosenkranz AA, Yachmenev SV, Jans DA et al. Receptor mediated endocytosis and nuclear transport of a transfecting DNA consturct. Experimental cell research, 1992; 189∶323
收稿日期：1999-02-05, 百拇医药