聚丙交酯(PL)／丙交酯-聚乙二醇共聚物(PLEG)共混微球的制备、表征及释药行为
作者：蒋宏亮 朱康杰
单位：蒋宏亮(浙江大学 高分子科学与工程系，杭州 310027)；朱康杰(浙江大学 高分子科学与工程系，杭州 310027)
关键词：PL；PLEG；共混；微球；蛋白质的包埋率
生物医学工程学杂志000102 摘 要：PL与PLEG是生物降解、生物相容的高分子材料，利用它们作为药物控释载体已引起人们广泛的重视。我们合成了含不同PEG链段长度的PLEG共聚物，并利用PL与PLEG这两种材料各自的优点制备载有人绒毛促性腺激素(hCG)的共混微球以提高hCG在微球中的包埋率，结果表明采用P(L-co-PEG6000)(90∶10)与PL共混制备得到的微球中，hCG的包埋率高于单独用PL或PLEG制得的微球。hCG的体外释放为突破-缓释过程，符合抗原释放要求。
Preparation, Characterization and Drug Release Characteristics of
, 百拇医药
Poly(lactide)(PL)/Poly(lactide-co-polyethylene glycol)(PLEG) Blend Microspheres
Jiang Hongliang Zhu Kangjie
(Department of Polymer Science and Engineering, Zhejiang University, Hangzhou 310027)
Abstract：PL and PLEG are biodegradable, biocompatible polymers. They have been widely used for controlled release of drugs. We synthesized PLEG copolymers containing PEG segments with various molecular weight and prepared hCG-loaded PL/PLEG blend microspheres to improve hCG entrapment efficiency. It was shown that the hCG entrapment effciency of PL/PLEG microspheres was higher than that of PL or PLEG microspheres when P(L-co-PEG6000)(90∶10) was used. In vitro release test showed that the release of hCG was a burst-slow process, which was thought to be good for antigens to produce antibodies.
, 百拇医药
Key words：Polylactide Poly(lactide-co-polyethylene glycol) Blend Microspheres Entrapment efficiency of protein▲
随着基因工程及化学合成技术的发展，越来越多的多肽、蛋白质药物被研制出来并在临床应用中表现出许多独特的疗效。与传统的小分子药物相比，这类药物存在体内易降解、易失活以及难以在胃肠道内被体内吸收等缺点，阻碍了在临床上方便、广泛和有效地使用。以生物降解性高分子材料为载体材料制成微球，可以实现多肽、蛋白质药物在体内的持续释放，从而避免通常所需的频繁注射的弊端，同时还可制成多途径给药，例如鼻腔给药、直肠给药和口服给药等制剂。目前多肽或蛋白质药物的聚合物微球最常用的制备方法有凝聚-相分离法[1，2]、溶剂挥发法[3～8]和水/油/水乳状液-溶剂挥发法(w/o/w)。Ogawa等人[5，6]通过在乳化前于内水相中加入明胶，将Leuprolide Acetate包埋入PL或聚(丙交酯-共乙交酯)(PLGA)微球中以提高药物包埋率；Jeffery等人[7]考察了卵清蛋白(OVA)/PLGA体系中药物与辅料的比例、乳化剂的浓度、外水相的体积等因素对微球粒径的影响；Yan等人[8]则研究了乳状液制备时搅拌方式对微球的影响如微球粒径、药物包埋率以及微球结构等。尽管采用他们的方法可以在一定程度上提高药物的包埋率，但一般来说微球的粒径也会相应增加，这将限制微球的应用范围；另外由于在微球制备过程中，多肽、蛋白质药物不可避免地要接触到有机溶剂，这有可能导致药物的变性失活。PLEG是一种嵌段型共聚物，具有较长的亲水性PEG链段及疏水性的PL链段[9]，因而具有一定的表面活性作用，在制备微球的过程中，PLEG有可能富集于W/O相界面，从而提高乳状液的稳定性，增加蛋白质的包埋率；另外也可以阻止蛋白质与有机溶剂的接触，避免可能的变性失活。与PLEG相比，PL具有较好的机械强度及适宜的玻璃化转变温度。本文报道PL/PLEG共混微球的制备、表征，并以hCG为模型药物，考察了一系列提高蛋白质包埋率的因素，并对微球进行了表征和初步的释药试验结果。
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1 实验部分
1.1 试剂与原料
乳酸为杭州双林化学试剂厂产品。PEG为上海合成洗涤剂二厂生产。hCG由上海计划生育研究所提供。辛酸亚锡购自Sigma公司。Folin-酚、Folin试剂本实验配制。
1.2 丙交酯的合成
在装有蒸馏装置的250 ml三颈瓶中加入一定量氧化锌，用少许水调成糊状，边搅拌边加入乳酸使氧化锌均匀分散。升温至体系沸腾，蒸出反应生成水，减压下继续蒸馏至无出水为止。在高真空度下(1 mmHg)，提高温度至240 ℃蒸出浅黄色粘稠馏分，用乙酸乙酯反复重结晶得白色结晶物。熔点127 ℃，得率为60%。
1.3 PLEG的合成[9]
聚合管经铬酸洗液浸泡后，用10%三甲基氯硅烷甲苯溶液处理，丙酮洗涤，干燥后备用。精制和干燥后的PEG与L以一定比例置于聚合管中，加0.06%(W/W)的辛酸亚锡石油醚溶液；脱溶剂后封管在160 ℃下聚合36 h，得到浅黄色透明固体产物。丙酮溶解，水沉淀以除去未聚合的PEG，沉淀物干燥后再用二氯甲烷溶解，甲醇沉淀，真空干燥后得白色块状固体，得率在80%以上。
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1.4 聚合物特性粘度及分子量测定
聚合物的氯仿溶液(0.1 g/25 ml)，用内径为0.55 mm的乌氏粘度计于25 ℃恒温水浴中测定粘度。一点法公式计算聚合物的特性粘度。
聚合物分子量由GPC(WATERS 208)在25 ℃、1.5 ml/min流速下测得，溶剂采用四氢呋喃。
1.5 微球制备
将5 ml适当浓度的hCG水溶液乳化于25 ml聚合物的二氯甲烷溶液中，中速搅拌制得W/O乳状液。将该乳状液倾入到100 ml PVA水溶液中，以低速搅拌制得W/O/W乳状液，室温下将有机溶剂蒸发，微球固化后离心收集，双蒸水洗涤三次，真空干燥，收率大于70%。
1.6 微球粒径测定
, http://www.100md.com 微球经超声波分散于蒸馏水中，取一滴置于载玻片上，用粒径分布仪(partizle analyzer luzex 450)测定其粒径，每个样品至少统计1000个微球。
1.7 蛋白质含量的测定[10]
真空干燥的微球称一定量，用含5%SDS 0.1 mol/L氢氧化钠溶液溶解3天以上；离心后吸取1 ml上清液，加入5 ml Folin-酚试剂，混匀后于20 ℃～25 ℃保温10 min；加入0.5 ml Folin试剂，立即振荡，20 ℃～25 ℃下继续保温30 min，在500 nm处测定吸光度。
蛋白质的包埋率=蛋白质的实际包埋量/蛋白质的理论包埋量
1.8 微球的表面形态
真空干燥过的微球置于试样平台上，经喷金后用扫描电镜(HITACA-520型)观察表面形态。
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1.9 hCG体外释放
称取一定量含hCG微球加入到渗透膜套管中(spectra/POR,molecular porous dialysis membranes, M.W.Cut off=30,000)，套管两端封闭后浸没于5 ml双蒸水中于37 ℃恒温振荡器中振荡释放。每天移去双蒸水测定其中hCG含量(Lowry法)，并加入5 ml新鲜双蒸水。
2 结果与讨论
2.1 PLEG共聚物的合成
我们合成了不同PEG链段长度及不同共聚组成的PLEG，结果如表1所示。在同一合成条件下，PLEG的分子量随所用PEG分子量增大而增大；随L/PEG加料比减少而减小。这与邓先模等人[11]用SnCl2催化L与PEG聚合的结果一致。Kissel等人[12]提出了有醇存在时L开环聚合机理，可认为PEG端羟基与催化剂协同进攻L羰基，加速L开环，使得链增长中心增多，聚合物分子量降低。
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表1 PLEG特点
Table 1 PLEG characteristics Polymer
Mn
Mw
[η]
Tg(℃)
P(L-PEG600)(95∶5)
12476
20584
0.196
37
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P(L-PEG1000)(95∶5)
13452
22728
0.227
26
P(L-PEG6000)(95∶5)
33429
84569
0.659
12
P(L-PEG600)(90∶10)
5676
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9024
0.115
25
P(L-PEG1000)(90∶10)
8064
14422
0.149
11
P(L-PEG6000)(90∶10)
17310
40312
0.339
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3
2.2 微球的制备
2.2.1 PL/PLEG共混组成比对hCG包埋率的影响 PL(Mn=12600)/PLEG共混组成比对hCG包埋率影响如表2、3所示，可见同一共混组成比，PLEG中PEG链段越短，hCG包埋率越低。这可能是由于短链段PEG合成得到的PLEG分子量较低，与PL共混制备微球时，油相粘度较小，这使得内水相易与外水相融合，导致hCG包埋率降低。对于不同PL/PLEG共混组成比，hCG包埋率随共混比增加而增加，但当共混比为50∶50时都有一最低值，此现象目前尚无法解释。
表2 PL/PLEG(95∶5)共混组成比对hCG包埋率的影响
Table 2 The effect of PL/PLEG(95∶5) blend composition (w/w) on hCG entrapment efficiency(%) PL/PLEG ratio
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20∶80
50∶50
60∶40
80∶20
P(L-PEG6000)
48.04
39.30
57.69
67.04
P(L-PEG1000)
27.13
10.58
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30.0
35.68
P(L-PEG600)
10.73
9.3
22.5
33.51
表3 PL/PLEG(90∶10)共混组成比对hCG包埋率的影响
Table 3 The effect of PL/PLEG(90∶10) blend composition(w/w) on hCG entrapment efficiency(%) PL/PLEG ratio
20∶80
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50∶50
60∶40
80∶20
P(L-PEG6000)
61.20
58.29
65.69
74.34
P(L-PEG1000)
36.11
31.10
38.87
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47.57
P(L-PEG600)
32.35
21.31
36.90
42.71
2.2.2 PLEG共聚组成比对hCG包埋率的影响 比较PL/PLEG(95∶5)与PL/PLEG(90∶10)的hCG包埋率可以看出，尽管PLEG(90∶10)分子量低于PLEG(95∶5)，但前者的共混微球hCG包埋率均高于后者的共混微球。这可能是由于PLEG(90∶10)具有较丰富的PEG链段，亲水与亲油性比PLEG(95∶5)更接近平衡，更易在W/O界面形成界面膜[13]，因而尽管内水相液滴粘度前者小于后者，但由于有较稳定的界面膜隔离，使内水相液滴不易与外水相融合，导致hCG包埋率增大。含PEG大于10%的PLEG，由于Tg较低在室温下难以成球未作考察。
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2.2.3 共混作用对hCG包埋率的影响 共混作用对hCG包埋率的影响如图1、2所示。图1可以看出PL/P(L-co-PEG6000)(90∶10)共混微球在所有共混组成比下hCG的包埋率均高于PL微球，图2可以看出PL/P(L-PEG6000)(90∶10)(80∶20)微球在PL分子量分别小于、接近及大于PLEG的分子量的三种情况下hCG的包埋率均高于相应PL微球。而其它的共混微球hCG的包埋率都较PL微球为低(表2、3)。蛋白质药物包埋率的高低取决于微球制备时O/W界面膜的性质，界面膜强度越大，蛋白质的包埋率越高。PL在O/W界面沉淀形成界面不溶膜，某些PLEG由于其一定的两亲性则首先较快地吸附于O/W界面，形成界面吸附膜，然后在O/W界面形成不溶膜；PLEG形成吸附膜的速度较PL形成不溶膜的速度快，但由于亲水性较PL大，在O/W界面沉淀形成不溶膜速度慢。PL/PLEG共混微球中蛋白质的包埋应是这两种效应共同作用的结果。P(L-co-PEG600)及P(L-co-PEG1000)由于PEG链段较短、两亲性弱，不能有效地形成界面吸附膜，另外由于PLEG分子量低，形成界面不溶膜的速度慢，这使得与PL共混微球中hCG包埋率低。P(L-co-PEG6000)(90∶10)具有相对较长、较丰富的PEG链段，较其它的PLEG有较强的两亲性，可以在W/O界面形成更强界面膜，另外由于分子量较高也可以较快的形成界面不溶膜，这两种效应的共同作用使得共混微球中hCG包埋率高于相应其它共混微球，也高于单组分PL微球。
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图1 PL/P(L-co-PEG6000)(90∶10)共混微球中PL含量对hCG包埋率的影响
Fig 1 The dependence of hCG entrapment efficiency on PL content in PL/P(L-co-PEG6000)(90∶10) blend microspheres
图2 共混效应对hCG包埋率的影响。PL∶PLEG=80∶20(用P(L-co-PEG6000)(90∶10)制备微球)
Fig 2 The effect of blending on hCG entrapment efficiency(PL∶PLEG=80∶20,P(L-co-PEG6000)(90∶10) was used)
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2.3 微球表征
2.3.1 微球的粒径 PL/PLEG不同共混组成比下，微球粒径如表4所示。可见，PL/PLEG共混组成比在20∶80～80∶20之间对微球粒径影响不大，而PLE微球粒径较大。这可能是由于PLEG的Tg较低(室温左右或低于室温)，微球接近硬化时，由于表面粘度大，碰撞后发生聚集所致。将PL/PLEG共混后可提高Tg，阻止聚集的发生，故粒径减小，对PL/PLEG(80∶20)微球所做的粒径分布分析结果表明，大部分微球粒径在1～5 μm之间，粒径分布较窄(图略)。
表4 PL/PLEG(95∶5)微球粒径
Table 4 PL/PLEG(95∶5) microsphere diameter(μm) PL/PLEG(W/W)
20∶80
, 百拇医药 50∶50
60∶40
80∶20
0∶100
P(L-PEG6000)
5.29
4.98
5.17
4.37
12.9
P(L-PEG1000)
5.63
5.49
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5.21
4.10
/
P(L-PEG600)
4.31
5.27
5.20
4.39
/
2.3.2 微球的形态观察 微球的表面形态影响水化速度，从而影响蛋白质药物的释放速度；在作为药物栓塞剂时，还与栓塞作用有关，表面粗糙的微球易使血液中蛋白质成份在其表面吸附并形成血栓，将病灶附近血管阻塞，实现微球的栓塞作用，相反，微球以注射方式给药时，则要求表面光滑。图3为各种共混组成比的微球扫措电镜照片。PLEG微球表面孔隙度较大且聚集严重(图3左)，而PL/PLEG共混微球为具有光滑表面及表面孔隙度较大的微球(图3右)。
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2.3.3 微球的释放 典型的hCG释放曲线如图4所示。在第一天到第4天的突破效应以后，hCG能够平缓释放近3周。初始的突破可能是位于微球表面的hCG的解吸，而后来的平缓释放则是由于微球的降解所致。根据Stevens等人[14]的研究结果，抗原的释放遵循“突破-缓释”的动力学较平缓释放能够产生更高的抗体滴度，因此PL/PLEG微球很有希望成为一种有效的免疫制剂。
图3 PLEG(左)与PL/PLEG(右)微球的扫描电镜图
Fig 3 SEM photographs of PLEG(Right) and PL/PLEG(Left) microspheres
图4 PL/PLEG(90∶10)(80∶20)微球中hCG释放曲线
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Fig 4 hCG release profile from PL/PLEG(90∶10)(80∶20) microspheres
3 讨 论
选用P(L-PEG6000)与不同分子量的PL共混制备微球，可以更有效的包埋蛋白质；微球具有较小的粒径、较窄的粒径分布及较好的表面形态。hCG从共混微球中的释放遵循“突破-缓释”过程，符合抗原的释放动力学要求。
参考文献：
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收稿日期：1998-05-26
修改日期：1999-02-10, http://www.100md.com
单位：蒋宏亮(浙江大学 高分子科学与工程系，杭州 310027)；朱康杰(浙江大学 高分子科学与工程系，杭州 310027)
关键词：PL；PLEG；共混；微球；蛋白质的包埋率
生物医学工程学杂志000102 摘 要：PL与PLEG是生物降解、生物相容的高分子材料，利用它们作为药物控释载体已引起人们广泛的重视。我们合成了含不同PEG链段长度的PLEG共聚物，并利用PL与PLEG这两种材料各自的优点制备载有人绒毛促性腺激素(hCG)的共混微球以提高hCG在微球中的包埋率，结果表明采用P(L-co-PEG6000)(90∶10)与PL共混制备得到的微球中，hCG的包埋率高于单独用PL或PLEG制得的微球。hCG的体外释放为突破-缓释过程，符合抗原释放要求。
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Poly(lactide)(PL)/Poly(lactide-co-polyethylene glycol)(PLEG) Blend Microspheres
Jiang Hongliang Zhu Kangjie
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Abstract：PL and PLEG are biodegradable, biocompatible polymers. They have been widely used for controlled release of drugs. We synthesized PLEG copolymers containing PEG segments with various molecular weight and prepared hCG-loaded PL/PLEG blend microspheres to improve hCG entrapment efficiency. It was shown that the hCG entrapment effciency of PL/PLEG microspheres was higher than that of PL or PLEG microspheres when P(L-co-PEG6000)(90∶10) was used. In vitro release test showed that the release of hCG was a burst-slow process, which was thought to be good for antigens to produce antibodies.
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Key words：Polylactide Poly(lactide-co-polyethylene glycol) Blend Microspheres Entrapment efficiency of protein▲
随着基因工程及化学合成技术的发展，越来越多的多肽、蛋白质药物被研制出来并在临床应用中表现出许多独特的疗效。与传统的小分子药物相比，这类药物存在体内易降解、易失活以及难以在胃肠道内被体内吸收等缺点，阻碍了在临床上方便、广泛和有效地使用。以生物降解性高分子材料为载体材料制成微球，可以实现多肽、蛋白质药物在体内的持续释放，从而避免通常所需的频繁注射的弊端，同时还可制成多途径给药，例如鼻腔给药、直肠给药和口服给药等制剂。目前多肽或蛋白质药物的聚合物微球最常用的制备方法有凝聚-相分离法[1，2]、溶剂挥发法[3～8]和水/油/水乳状液-溶剂挥发法(w/o/w)。Ogawa等人[5，6]通过在乳化前于内水相中加入明胶，将Leuprolide Acetate包埋入PL或聚(丙交酯-共乙交酯)(PLGA)微球中以提高药物包埋率；Jeffery等人[7]考察了卵清蛋白(OVA)/PLGA体系中药物与辅料的比例、乳化剂的浓度、外水相的体积等因素对微球粒径的影响；Yan等人[8]则研究了乳状液制备时搅拌方式对微球的影响如微球粒径、药物包埋率以及微球结构等。尽管采用他们的方法可以在一定程度上提高药物的包埋率，但一般来说微球的粒径也会相应增加，这将限制微球的应用范围；另外由于在微球制备过程中，多肽、蛋白质药物不可避免地要接触到有机溶剂，这有可能导致药物的变性失活。PLEG是一种嵌段型共聚物，具有较长的亲水性PEG链段及疏水性的PL链段[9]，因而具有一定的表面活性作用，在制备微球的过程中，PLEG有可能富集于W/O相界面，从而提高乳状液的稳定性，增加蛋白质的包埋率；另外也可以阻止蛋白质与有机溶剂的接触，避免可能的变性失活。与PLEG相比，PL具有较好的机械强度及适宜的玻璃化转变温度。本文报道PL/PLEG共混微球的制备、表征，并以hCG为模型药物，考察了一系列提高蛋白质包埋率的因素，并对微球进行了表征和初步的释药试验结果。
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1 实验部分
1.1 试剂与原料
乳酸为杭州双林化学试剂厂产品。PEG为上海合成洗涤剂二厂生产。hCG由上海计划生育研究所提供。辛酸亚锡购自Sigma公司。Folin-酚、Folin试剂本实验配制。
1.2 丙交酯的合成
在装有蒸馏装置的250 ml三颈瓶中加入一定量氧化锌，用少许水调成糊状，边搅拌边加入乳酸使氧化锌均匀分散。升温至体系沸腾，蒸出反应生成水，减压下继续蒸馏至无出水为止。在高真空度下(1 mmHg)，提高温度至240 ℃蒸出浅黄色粘稠馏分，用乙酸乙酯反复重结晶得白色结晶物。熔点127 ℃，得率为60%。
1.3 PLEG的合成[9]
聚合管经铬酸洗液浸泡后，用10%三甲基氯硅烷甲苯溶液处理，丙酮洗涤，干燥后备用。精制和干燥后的PEG与L以一定比例置于聚合管中，加0.06%(W/W)的辛酸亚锡石油醚溶液；脱溶剂后封管在160 ℃下聚合36 h，得到浅黄色透明固体产物。丙酮溶解，水沉淀以除去未聚合的PEG，沉淀物干燥后再用二氯甲烷溶解，甲醇沉淀，真空干燥后得白色块状固体，得率在80%以上。
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1.4 聚合物特性粘度及分子量测定
聚合物的氯仿溶液(0.1 g/25 ml)，用内径为0.55 mm的乌氏粘度计于25 ℃恒温水浴中测定粘度。一点法公式计算聚合物的特性粘度。
聚合物分子量由GPC(WATERS 208)在25 ℃、1.5 ml/min流速下测得，溶剂采用四氢呋喃。
1.5 微球制备
将5 ml适当浓度的hCG水溶液乳化于25 ml聚合物的二氯甲烷溶液中，中速搅拌制得W/O乳状液。将该乳状液倾入到100 ml PVA水溶液中，以低速搅拌制得W/O/W乳状液，室温下将有机溶剂蒸发，微球固化后离心收集，双蒸水洗涤三次，真空干燥，收率大于70%。
1.6 微球粒径测定
, http://www.100md.com 微球经超声波分散于蒸馏水中，取一滴置于载玻片上，用粒径分布仪(partizle analyzer luzex 450)测定其粒径，每个样品至少统计1000个微球。
1.7 蛋白质含量的测定[10]
真空干燥的微球称一定量，用含5%SDS 0.1 mol/L氢氧化钠溶液溶解3天以上；离心后吸取1 ml上清液，加入5 ml Folin-酚试剂，混匀后于20 ℃～25 ℃保温10 min；加入0.5 ml Folin试剂，立即振荡，20 ℃～25 ℃下继续保温30 min，在500 nm处测定吸光度。
蛋白质的包埋率=蛋白质的实际包埋量/蛋白质的理论包埋量
1.8 微球的表面形态
真空干燥过的微球置于试样平台上，经喷金后用扫描电镜(HITACA-520型)观察表面形态。
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1.9 hCG体外释放
称取一定量含hCG微球加入到渗透膜套管中(spectra/POR,molecular porous dialysis membranes, M.W.Cut off=30,000)，套管两端封闭后浸没于5 ml双蒸水中于37 ℃恒温振荡器中振荡释放。每天移去双蒸水测定其中hCG含量(Lowry法)，并加入5 ml新鲜双蒸水。
2 结果与讨论
2.1 PLEG共聚物的合成
我们合成了不同PEG链段长度及不同共聚组成的PLEG，结果如表1所示。在同一合成条件下，PLEG的分子量随所用PEG分子量增大而增大；随L/PEG加料比减少而减小。这与邓先模等人[11]用SnCl2催化L与PEG聚合的结果一致。Kissel等人[12]提出了有醇存在时L开环聚合机理，可认为PEG端羟基与催化剂协同进攻L羰基，加速L开环，使得链增长中心增多，聚合物分子量降低。
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表1 PLEG特点
Table 1 PLEG characteristics Polymer
Mn
Mw
[η]
Tg(℃)
P(L-PEG600)(95∶5)
12476
20584
0.196
37
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P(L-PEG1000)(95∶5)
13452
22728
0.227
26
P(L-PEG6000)(95∶5)
33429
84569
0.659
12
P(L-PEG600)(90∶10)
5676
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9024
0.115
25
P(L-PEG1000)(90∶10)
8064
14422
0.149
11
P(L-PEG6000)(90∶10)
17310
40312
0.339
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3
2.2 微球的制备
2.2.1 PL/PLEG共混组成比对hCG包埋率的影响 PL(Mn=12600)/PLEG共混组成比对hCG包埋率影响如表2、3所示，可见同一共混组成比，PLEG中PEG链段越短，hCG包埋率越低。这可能是由于短链段PEG合成得到的PLEG分子量较低，与PL共混制备微球时，油相粘度较小，这使得内水相易与外水相融合，导致hCG包埋率降低。对于不同PL/PLEG共混组成比，hCG包埋率随共混比增加而增加，但当共混比为50∶50时都有一最低值，此现象目前尚无法解释。
表2 PL/PLEG(95∶5)共混组成比对hCG包埋率的影响
Table 2 The effect of PL/PLEG(95∶5) blend composition (w/w) on hCG entrapment efficiency(%) PL/PLEG ratio
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20∶80
50∶50
60∶40
80∶20
P(L-PEG6000)
48.04
39.30
57.69
67.04
P(L-PEG1000)
27.13
10.58
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30.0
35.68
P(L-PEG600)
10.73
9.3
22.5
33.51
表3 PL/PLEG(90∶10)共混组成比对hCG包埋率的影响
Table 3 The effect of PL/PLEG(90∶10) blend composition(w/w) on hCG entrapment efficiency(%) PL/PLEG ratio
20∶80
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50∶50
60∶40
80∶20
P(L-PEG6000)
61.20
58.29
65.69
74.34
P(L-PEG1000)
36.11
31.10
38.87
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47.57
P(L-PEG600)
32.35
21.31
36.90
42.71
2.2.2 PLEG共聚组成比对hCG包埋率的影响 比较PL/PLEG(95∶5)与PL/PLEG(90∶10)的hCG包埋率可以看出，尽管PLEG(90∶10)分子量低于PLEG(95∶5)，但前者的共混微球hCG包埋率均高于后者的共混微球。这可能是由于PLEG(90∶10)具有较丰富的PEG链段，亲水与亲油性比PLEG(95∶5)更接近平衡，更易在W/O界面形成界面膜[13]，因而尽管内水相液滴粘度前者小于后者，但由于有较稳定的界面膜隔离，使内水相液滴不易与外水相融合，导致hCG包埋率增大。含PEG大于10%的PLEG，由于Tg较低在室温下难以成球未作考察。
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2.2.3 共混作用对hCG包埋率的影响 共混作用对hCG包埋率的影响如图1、2所示。图1可以看出PL/P(L-co-PEG6000)(90∶10)共混微球在所有共混组成比下hCG的包埋率均高于PL微球，图2可以看出PL/P(L-PEG6000)(90∶10)(80∶20)微球在PL分子量分别小于、接近及大于PLEG的分子量的三种情况下hCG的包埋率均高于相应PL微球。而其它的共混微球hCG的包埋率都较PL微球为低(表2、3)。蛋白质药物包埋率的高低取决于微球制备时O/W界面膜的性质，界面膜强度越大，蛋白质的包埋率越高。PL在O/W界面沉淀形成界面不溶膜，某些PLEG由于其一定的两亲性则首先较快地吸附于O/W界面，形成界面吸附膜，然后在O/W界面形成不溶膜；PLEG形成吸附膜的速度较PL形成不溶膜的速度快，但由于亲水性较PL大，在O/W界面沉淀形成不溶膜速度慢。PL/PLEG共混微球中蛋白质的包埋应是这两种效应共同作用的结果。P(L-co-PEG600)及P(L-co-PEG1000)由于PEG链段较短、两亲性弱，不能有效地形成界面吸附膜，另外由于PLEG分子量低，形成界面不溶膜的速度慢，这使得与PL共混微球中hCG包埋率低。P(L-co-PEG6000)(90∶10)具有相对较长、较丰富的PEG链段，较其它的PLEG有较强的两亲性，可以在W/O界面形成更强界面膜，另外由于分子量较高也可以较快的形成界面不溶膜，这两种效应的共同作用使得共混微球中hCG包埋率高于相应其它共混微球，也高于单组分PL微球。
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图1 PL/P(L-co-PEG6000)(90∶10)共混微球中PL含量对hCG包埋率的影响
Fig 1 The dependence of hCG entrapment efficiency on PL content in PL/P(L-co-PEG6000)(90∶10) blend microspheres
图2 共混效应对hCG包埋率的影响。PL∶PLEG=80∶20(用P(L-co-PEG6000)(90∶10)制备微球)
Fig 2 The effect of blending on hCG entrapment efficiency(PL∶PLEG=80∶20,P(L-co-PEG6000)(90∶10) was used)
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2.3 微球表征
2.3.1 微球的粒径 PL/PLEG不同共混组成比下，微球粒径如表4所示。可见，PL/PLEG共混组成比在20∶80～80∶20之间对微球粒径影响不大，而PLE微球粒径较大。这可能是由于PLEG的Tg较低(室温左右或低于室温)，微球接近硬化时，由于表面粘度大，碰撞后发生聚集所致。将PL/PLEG共混后可提高Tg，阻止聚集的发生，故粒径减小，对PL/PLEG(80∶20)微球所做的粒径分布分析结果表明，大部分微球粒径在1～5 μm之间，粒径分布较窄(图略)。
表4 PL/PLEG(95∶5)微球粒径
Table 4 PL/PLEG(95∶5) microsphere diameter(μm) PL/PLEG(W/W)
20∶80
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60∶40
80∶20
0∶100
P(L-PEG6000)
5.29
4.98
5.17
4.37
12.9
P(L-PEG1000)
5.63
5.49
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5.21
4.10
/
P(L-PEG600)
4.31
5.27
5.20
4.39
/
2.3.2 微球的形态观察 微球的表面形态影响水化速度，从而影响蛋白质药物的释放速度；在作为药物栓塞剂时，还与栓塞作用有关，表面粗糙的微球易使血液中蛋白质成份在其表面吸附并形成血栓，将病灶附近血管阻塞，实现微球的栓塞作用，相反，微球以注射方式给药时，则要求表面光滑。图3为各种共混组成比的微球扫措电镜照片。PLEG微球表面孔隙度较大且聚集严重(图3左)，而PL/PLEG共混微球为具有光滑表面及表面孔隙度较大的微球(图3右)。
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2.3.3 微球的释放 典型的hCG释放曲线如图4所示。在第一天到第4天的突破效应以后，hCG能够平缓释放近3周。初始的突破可能是位于微球表面的hCG的解吸，而后来的平缓释放则是由于微球的降解所致。根据Stevens等人[14]的研究结果，抗原的释放遵循“突破-缓释”的动力学较平缓释放能够产生更高的抗体滴度，因此PL/PLEG微球很有希望成为一种有效的免疫制剂。
图3 PLEG(左)与PL/PLEG(右)微球的扫描电镜图
Fig 3 SEM photographs of PLEG(Right) and PL/PLEG(Left) microspheres
图4 PL/PLEG(90∶10)(80∶20)微球中hCG释放曲线
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Fig 4 hCG release profile from PL/PLEG(90∶10)(80∶20) microspheres
3 讨 论
选用P(L-PEG6000)与不同分子量的PL共混制备微球，可以更有效的包埋蛋白质；微球具有较小的粒径、较窄的粒径分布及较好的表面形态。hCG从共混微球中的释放遵循“突破-缓释”过程，符合抗原的释放动力学要求。
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收稿日期：1998-05-26
修改日期：1999-02-10, http://www.100md.com