基于Disector技术的突触数密度计算机辅助分析系统
作者：沈丽 张琳 黄浩 刘贺飞 南燕 尚俊杰 廖洪恩
单位：沈丽 张琳 南燕(北京医科大学 解剖学系，北京 100083)；黄浩 刘贺飞 尚俊杰 廖洪恩(北京大学 力学与工程科学系，北京 100871)
关键词：突触；数密度；Disector技术；计算机软件
生物医学工程学杂志000213 摘要 突触数目的改变在神经系统的各种生理病理过程中具有重要的意义。数密度是形态计量学中衡量空间中某种粒子数目多少的结构参数。作为新兴的体视学技术Disector技术已广泛应用于生物组织中粒子数目的计数，它是利用已知距离的相邻平行切片计数三维空间中任意粒子数目的体视学方法。我们探讨在Window95平台上，采用Visual Basic4.0为开发工具，实现基于Physical Disector技术的突触数密度的计算机辅助分析。
A Computer-aided Analysis System for Counting the Synaptic Numerical Density Based on Disector Technique
, 百拇医药
Shen Li Zhang Lin Nan Yan
(Department of Anatomy, Beijing Medical University, Beijing 100083)
Huang Hao Liu Hefei Shang Junjie Liao Hongen
(Department of Mechanics and Engineering Science, Peking University, Beijing 100871)
Abstract The change in the numbers of synapse is of importance in various kinds of physiological and pathological processes. The numerical density is the structural parameter measuring up the numbers of the particles in the space. A new stereological technique, the disector technique, has been described to count the number of particles in a given volume of tissue. It is a technique for counting the number of arbitrary particles in 3-dimensional space using adjacent parallel sections at known distance apart. In this article also discussed is the software for computer assisted count of the synaptic numerical density based on the physical disector technique with Visual Basic 4.0.
, 百拇医药
Key words Synapse Numerical density Disector technique Computer software
1 引 言
突触的数目在神经系统的发育与衰老、损伤与修复、可塑性与学习记忆等生理病理过程中具有明显变化，准确计数神经组织中突触的数目是神经生物学研究方法有待解决的难题[1～3]。体视学是形态计量学的1个分支，其原理萌发于十九世纪中叶Deless对矿床剖面的研究，完整概念于1961年由Elias首先创立。体视学技术的实质是首先测量一定数量随机二维剖面(切片)中的体视学参数，然后根据二维结构与三维结构空间定量的数学关系，利用几何学和概率论原理建立数学公式，从而推算出待测结构的三维结构参数[4]。因此，体视学测量法是一种应用数学方法对固体组织的剖面进行空间解释和估算的方法。数密度是体视学中衡量空间中某种粒子数目多少的结构参数，它可有效的衡量神经组织中突触数目的变化。Disector技术是一种利用若干组织相邻平行二维剖面计数三维空间中任意形状粒子数目的体视学方法，具有计数效率高、无偏差等优点，是80年代以来空间粒子计数技术领域的重大突破[5，8，9]。计算机辅助生物图像分析技术是在生物学、计算数学和计算机数值分析技术等学科基础上形成的交叉学科，已广泛应用于生物图像的定量分析[6，7]。我们探讨应用计算机图像处理与分析技术，实现基于Disector技术的突触数密度的计算机辅助分析的原理和过程。
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2 Disector法测量突触数密度的基本原理
2.1 数密度的概念
在电镜切片中，突触的截面数与空间中突触的数目以及突触的尺寸、形状和空间取向有关，可利用体视学方法由切片中突触的截面数推算空间突触的数目。数密度(Numerical density)：在选定参照系中，单位体积内某种粒子的数目，即：Nv=Nt/Vr(其中Nv:数密度；Nt:空间中粒子数；Vr:选定参照系的体积)，它是体视学中衡量空间某种粒子数目多少的结构参数[4]。
2.2 Disector的构成与应用
Disector(可译为剖析器或双截面器)是由2个间距为h的平行平面构成的三维测试系统，其中1个平面称为计数平面(Reference plane)，上覆Gundersen测试系统，用于确定测试范围和计数待测粒子的截面数；另1个平面称为核查平面(Look-up plane)用于核查2个平面间待测粒子截面数的差别[4，8]。其中粒子截面数的计数应遵循Gundersen法则：(1)落在测试系统内的粒子为有效粒子；(2)仅与包容线相交的粒子为有效粒子；(3)凡与排斥线相交，无论是否与包容线相交均为无效粒子[11]。在测量突触数目时，可利用相邻两张电镜切片代替Disector的2个平行平面，分别称为计数切片和核查切片，既Physical Disector技术。若切片厚度为t，则h=t。
, 百拇医药
应用Physical Disector法测量突触数目时，首先在计数切片(两张切片中的任何一张)中计数突触的截面数；然后在核查切片中计数同时出现于计数切片和核查切片的突触的截面数；两者之差为计数切片上出现而核查切片上不出现的突触的截面数Q-，也就是相应计数空间(测试面的面积A乘以两测试面的间距)内突触的数目，因此：
(1)
其中：Q-为计数切片上出现而核查切片不出现的突触的截面数；t为超薄切片的厚度；A为测试面的面积。
本系统采用的Disector技术体现了80年代以来新兴的设计技术(Design-techniques)的体视学思路，即不是基于任何假设或模型而是采用两张相邻二维切片作为三维探针，相当于直接计数三维空间中突触数目，与突触的形状、大小和空间分布无关，可实现真正意义上的突触数目的无偏差测量，是目前最具前途的突触数目无偏差计数方法[4，9]。
, 百拇医药
3 系统硬件构成
系统硬件由主机、扫描仪和打印机三部分构成。主机：主频200 MHz、内存32 M、硬盘6.4 G。扫描仪：ScanMakerⅡSP(MICROTEK公司产品)。打印机：6 P激光打印机(HP公司产品)。
4 系统软件设计
4.1 开发平台与工具
系统开发的操作系统采用Windows 95(MICROSOFT公司产品)[12]，开发工具采用Visual Basic 4.0(MICROSOFT公司产品)[13]。
4.2 功能模块设计
4.2.1 切片预览模块 该模块可同时打开一组最多6张电镜连续切片的照片，并按顺序依次排列在屏幕上，使操作者可在分析切片前预览该组切片。同时，在分析过程中可随时调用该模块，使操作者可从整体上观察该组切片，以便对复杂结构全面分析。
, 百拇医药
4.2.2 测试框添加模块 该模块可在电镜切片的照片上添加预设面积的Gundersen无偏差测试框，并以TIF格式存盘，以备调用。
4.2.3 Disector计数模块 该模块可同时并行打打开两张相邻电镜切片的照片，并且可同时放大、缩小以及利用水平和垂直滑块移动，以便使用者对比观察两张相邻切片。使用者利用鼠标首先在计数切片点击标记突触结构，同时观察在核查切片中该突触是否出现，如果出现也利用鼠标点击标记，该模块可自动根据标记点数计算计数切片上出现而核查切片上不出现的突触的截面数Q-。如果使用者标记突触时出错，可利用撤消命令取消标记。
4.2.4 数据计算分析模块 超薄切片的厚度和测试面积利用对话框输入后。该模块可根据公式(1)计算每两张相邻电镜切片中突触的数密度，并可计算一组电镜切片的突触数密度的均值和标准差。
5 应用实例
, 百拇医药
5.1 材料与方法
5.1.1 组织包埋块的制备 30日龄Wistar大鼠3只。常规电镜灌注、取材、固定，平板包埋。
5.1.2 连续超薄切片的制备 每只动物从平板包埋的厚片中随机抽取1片，定位修块。超薄切片机连续超薄切片，每一厚片选取2～3条由6～10片连续超薄切片构成的切片带，分别裱于独眼铜网。醋酸铀-枸橼酸铅双重染色。
5.1.3 电镜摄片的方法 每只动物从切片带中随机选取1条，透射电镜下观察摄片。选取切片带的第1张切片，1 400倍下，确定海马辐射层的位置和范围，在该范围内随机选取1个仅由1个内皮细胞构成的毛细血管，记录该毛细血管的位置，以此作为定位的标志。在该毛细血管周围随机选取神经毡，7 000倍下摄片。选取第2张切片，1 400倍下，寻找定位的毛细血管，并以此确定与上一拍摄视野在同一纵轴上的视野(即相邻视野)，7 200倍下摄片。同样方法依次观察并拍摄剩余切片，每条切片带摄片5～9张。
, 百拇医药
5.1.4 突触数密度的测量 超薄切片的照片依次利用扫描仪输入计算机，按照3.3系统工作过程所介绍的步骤测量突触数密度。
5.1.5 超薄切片厚度的测量 利用微皱褶法[13](Small fold methods)测量超薄切片的厚度。48 000倍下，拍摄若干微皱折，测量它们的宽度，计算超薄切片的厚度为：42±5 nm。
5.2 结果
生后30 d大鼠海马CA1区辐射层，突触的数密度为(2.31±0.22)×1010个/mm3。
6 结束语
我们研制的基于Disector技术的突触数密度计算机辅助分析系统(Disector Countor1.0)是在Windows95平台上，利用CISUAL BASIC4.0开发研制的。Windows95为用户直观的图形操作环境和用户界面，人机交互方便、利于掌握和使用[12]。VISUAL BASIC4.0运用可视化设计工具，具备复杂的界面处理动作和事件驱动的编程机制[13]。因此，Disector Countor1.0获得了开发平台和开发工具赋予的良好的人机界面和图像处理功能，具备客观、高效等优点，是粒子数目定量分析发展的方向。
, 百拇医药
国家自然科学基金资助项目(39470309)
参考文献
1，Mayhew TM. A review of recent advances in sterology for quantifying neural structure. J Neurcoytol, 1992; 21(5)∶313
2，Coggeshall RE. A consideration of neural countng methods. TINS, 1994; 15(1)∶9
3，Coggeshall RE, Lekan HA. Methods for determining the numbers of cells and synapses: a case for more uniform standards of review. J Comp Neurol, 1996∶364(1)∶6
, http://www.100md.com
4，沈 丽，张 琳，南 燕.体视学在突触超微结构定量研究中的应用.中国体视学与图像分析杂志，1998；3(1)∶37
5，张 琳，买鸿宴，南 燕等.Disector法测量突触的数密度.神经解剖学杂志，1998(待发)
6，BuravkoV SV. Simple PC-based system for morphometric analysis of synapse. J Neurosci Methods, 1995; 61(1)∶1
7，Dahlhaus R, Eichler M, Sandkuhler J. Identification of synaptic connections in neural ensembles by graphical models. J Neurosci Methods, 1997; 77(1)∶93
, 百拇医药
8，Sterio DC. The unbiased estimation of number and sizes of arbitrary particles using the disector. J Microsc, 1984; 134(2)∶127
9，Gundersen HJ, Bagger P, Bendtsen TF et al. The new sterological tools:disector, fractionator, nucleator and point sampled intercepts and their use in pathological research and diagnosis. APMIS, 1988; 96(10)∶857
10，Mayhew TM, Gundersen HJG. If you assume, you can make an ass out of u and me:a decade of the disector for sterological counting of particles in 3D space. J Anat, 1996; 183(1)∶1
, 百拇医药
11，Gundersen HJG. Notes on estimation of the numberical density of arbitrary profiles: the edge effect. J Microsc, 1977; 111(2)∶219
12，Simpson A. Windows 95 UNCUT. California: IDG Books Worldwide Inc, 1995
13，Rahmel D, Rahel R. Developing Client/Server Application with Visual Basic 4.0 SAMS Publishing, 1995
14，Small JV. Measurement of section thickness. In: Bocciarelli DS. Proceeding of the Fourth European Congress on Electronic Microscopy, Roma:Tipografia poliglotta vaticana, 1968；1:609
(收稿：1998-11-10), 百拇医药
单位：沈丽 张琳 南燕(北京医科大学 解剖学系，北京 100083)；黄浩 刘贺飞 尚俊杰 廖洪恩(北京大学 力学与工程科学系，北京 100871)
关键词：突触；数密度；Disector技术；计算机软件
生物医学工程学杂志000213 摘要 突触数目的改变在神经系统的各种生理病理过程中具有重要的意义。数密度是形态计量学中衡量空间中某种粒子数目多少的结构参数。作为新兴的体视学技术Disector技术已广泛应用于生物组织中粒子数目的计数，它是利用已知距离的相邻平行切片计数三维空间中任意粒子数目的体视学方法。我们探讨在Window95平台上，采用Visual Basic4.0为开发工具，实现基于Physical Disector技术的突触数密度的计算机辅助分析。
A Computer-aided Analysis System for Counting the Synaptic Numerical Density Based on Disector Technique
, 百拇医药
Shen Li Zhang Lin Nan Yan
(Department of Anatomy, Beijing Medical University, Beijing 100083)
Huang Hao Liu Hefei Shang Junjie Liao Hongen
(Department of Mechanics and Engineering Science, Peking University, Beijing 100871)
Abstract The change in the numbers of synapse is of importance in various kinds of physiological and pathological processes. The numerical density is the structural parameter measuring up the numbers of the particles in the space. A new stereological technique, the disector technique, has been described to count the number of particles in a given volume of tissue. It is a technique for counting the number of arbitrary particles in 3-dimensional space using adjacent parallel sections at known distance apart. In this article also discussed is the software for computer assisted count of the synaptic numerical density based on the physical disector technique with Visual Basic 4.0.
, 百拇医药
Key words Synapse Numerical density Disector technique Computer software
1 引 言
突触的数目在神经系统的发育与衰老、损伤与修复、可塑性与学习记忆等生理病理过程中具有明显变化，准确计数神经组织中突触的数目是神经生物学研究方法有待解决的难题[1～3]。体视学是形态计量学的1个分支，其原理萌发于十九世纪中叶Deless对矿床剖面的研究，完整概念于1961年由Elias首先创立。体视学技术的实质是首先测量一定数量随机二维剖面(切片)中的体视学参数，然后根据二维结构与三维结构空间定量的数学关系，利用几何学和概率论原理建立数学公式，从而推算出待测结构的三维结构参数[4]。因此，体视学测量法是一种应用数学方法对固体组织的剖面进行空间解释和估算的方法。数密度是体视学中衡量空间中某种粒子数目多少的结构参数，它可有效的衡量神经组织中突触数目的变化。Disector技术是一种利用若干组织相邻平行二维剖面计数三维空间中任意形状粒子数目的体视学方法，具有计数效率高、无偏差等优点，是80年代以来空间粒子计数技术领域的重大突破[5，8，9]。计算机辅助生物图像分析技术是在生物学、计算数学和计算机数值分析技术等学科基础上形成的交叉学科，已广泛应用于生物图像的定量分析[6，7]。我们探讨应用计算机图像处理与分析技术，实现基于Disector技术的突触数密度的计算机辅助分析的原理和过程。
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2 Disector法测量突触数密度的基本原理
2.1 数密度的概念
在电镜切片中，突触的截面数与空间中突触的数目以及突触的尺寸、形状和空间取向有关，可利用体视学方法由切片中突触的截面数推算空间突触的数目。数密度(Numerical density)：在选定参照系中，单位体积内某种粒子的数目，即：Nv=Nt/Vr(其中Nv:数密度；Nt:空间中粒子数；Vr:选定参照系的体积)，它是体视学中衡量空间某种粒子数目多少的结构参数[4]。
2.2 Disector的构成与应用
Disector(可译为剖析器或双截面器)是由2个间距为h的平行平面构成的三维测试系统，其中1个平面称为计数平面(Reference plane)，上覆Gundersen测试系统，用于确定测试范围和计数待测粒子的截面数；另1个平面称为核查平面(Look-up plane)用于核查2个平面间待测粒子截面数的差别[4，8]。其中粒子截面数的计数应遵循Gundersen法则：(1)落在测试系统内的粒子为有效粒子；(2)仅与包容线相交的粒子为有效粒子；(3)凡与排斥线相交，无论是否与包容线相交均为无效粒子[11]。在测量突触数目时，可利用相邻两张电镜切片代替Disector的2个平行平面，分别称为计数切片和核查切片，既Physical Disector技术。若切片厚度为t，则h=t。
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应用Physical Disector法测量突触数目时，首先在计数切片(两张切片中的任何一张)中计数突触的截面数；然后在核查切片中计数同时出现于计数切片和核查切片的突触的截面数；两者之差为计数切片上出现而核查切片上不出现的突触的截面数Q-，也就是相应计数空间(测试面的面积A乘以两测试面的间距)内突触的数目，因此：
(1)其中：Q-为计数切片上出现而核查切片不出现的突触的截面数；t为超薄切片的厚度；A为测试面的面积。
本系统采用的Disector技术体现了80年代以来新兴的设计技术(Design-techniques)的体视学思路，即不是基于任何假设或模型而是采用两张相邻二维切片作为三维探针，相当于直接计数三维空间中突触数目，与突触的形状、大小和空间分布无关，可实现真正意义上的突触数目的无偏差测量，是目前最具前途的突触数目无偏差计数方法[4，9]。
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3 系统硬件构成
系统硬件由主机、扫描仪和打印机三部分构成。主机：主频200 MHz、内存32 M、硬盘6.4 G。扫描仪：ScanMakerⅡSP(MICROTEK公司产品)。打印机：6 P激光打印机(HP公司产品)。
4 系统软件设计
4.1 开发平台与工具
系统开发的操作系统采用Windows 95(MICROSOFT公司产品)[12]，开发工具采用Visual Basic 4.0(MICROSOFT公司产品)[13]。
4.2 功能模块设计
4.2.1 切片预览模块 该模块可同时打开一组最多6张电镜连续切片的照片，并按顺序依次排列在屏幕上，使操作者可在分析切片前预览该组切片。同时，在分析过程中可随时调用该模块，使操作者可从整体上观察该组切片，以便对复杂结构全面分析。
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4.2.2 测试框添加模块 该模块可在电镜切片的照片上添加预设面积的Gundersen无偏差测试框，并以TIF格式存盘，以备调用。
4.2.3 Disector计数模块 该模块可同时并行打打开两张相邻电镜切片的照片，并且可同时放大、缩小以及利用水平和垂直滑块移动，以便使用者对比观察两张相邻切片。使用者利用鼠标首先在计数切片点击标记突触结构，同时观察在核查切片中该突触是否出现，如果出现也利用鼠标点击标记，该模块可自动根据标记点数计算计数切片上出现而核查切片上不出现的突触的截面数Q-。如果使用者标记突触时出错，可利用撤消命令取消标记。
4.2.4 数据计算分析模块 超薄切片的厚度和测试面积利用对话框输入后。该模块可根据公式(1)计算每两张相邻电镜切片中突触的数密度，并可计算一组电镜切片的突触数密度的均值和标准差。
5 应用实例
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5.1 材料与方法
5.1.1 组织包埋块的制备 30日龄Wistar大鼠3只。常规电镜灌注、取材、固定，平板包埋。
5.1.2 连续超薄切片的制备 每只动物从平板包埋的厚片中随机抽取1片，定位修块。超薄切片机连续超薄切片，每一厚片选取2～3条由6～10片连续超薄切片构成的切片带，分别裱于独眼铜网。醋酸铀-枸橼酸铅双重染色。
5.1.3 电镜摄片的方法 每只动物从切片带中随机选取1条，透射电镜下观察摄片。选取切片带的第1张切片，1 400倍下，确定海马辐射层的位置和范围，在该范围内随机选取1个仅由1个内皮细胞构成的毛细血管，记录该毛细血管的位置，以此作为定位的标志。在该毛细血管周围随机选取神经毡，7 000倍下摄片。选取第2张切片，1 400倍下，寻找定位的毛细血管，并以此确定与上一拍摄视野在同一纵轴上的视野(即相邻视野)，7 200倍下摄片。同样方法依次观察并拍摄剩余切片，每条切片带摄片5～9张。
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5.1.4 突触数密度的测量 超薄切片的照片依次利用扫描仪输入计算机，按照3.3系统工作过程所介绍的步骤测量突触数密度。
5.1.5 超薄切片厚度的测量 利用微皱褶法[13](Small fold methods)测量超薄切片的厚度。48 000倍下，拍摄若干微皱折，测量它们的宽度，计算超薄切片的厚度为：42±5 nm。
5.2 结果
生后30 d大鼠海马CA1区辐射层，突触的数密度为(2.31±0.22)×1010个/mm3。
6 结束语
我们研制的基于Disector技术的突触数密度计算机辅助分析系统(Disector Countor1.0)是在Windows95平台上，利用CISUAL BASIC4.0开发研制的。Windows95为用户直观的图形操作环境和用户界面，人机交互方便、利于掌握和使用[12]。VISUAL BASIC4.0运用可视化设计工具，具备复杂的界面处理动作和事件驱动的编程机制[13]。因此，Disector Countor1.0获得了开发平台和开发工具赋予的良好的人机界面和图像处理功能，具备客观、高效等优点，是粒子数目定量分析发展的方向。
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国家自然科学基金资助项目(39470309)
参考文献
1，Mayhew TM. A review of recent advances in sterology for quantifying neural structure. J Neurcoytol, 1992; 21(5)∶313
2，Coggeshall RE. A consideration of neural countng methods. TINS, 1994; 15(1)∶9
3，Coggeshall RE, Lekan HA. Methods for determining the numbers of cells and synapses: a case for more uniform standards of review. J Comp Neurol, 1996∶364(1)∶6
, http://www.100md.com
4，沈 丽，张 琳，南 燕.体视学在突触超微结构定量研究中的应用.中国体视学与图像分析杂志，1998；3(1)∶37
5，张 琳，买鸿宴，南 燕等.Disector法测量突触的数密度.神经解剖学杂志，1998(待发)
6，BuravkoV SV. Simple PC-based system for morphometric analysis of synapse. J Neurosci Methods, 1995; 61(1)∶1
7，Dahlhaus R, Eichler M, Sandkuhler J. Identification of synaptic connections in neural ensembles by graphical models. J Neurosci Methods, 1997; 77(1)∶93
, 百拇医药
8，Sterio DC. The unbiased estimation of number and sizes of arbitrary particles using the disector. J Microsc, 1984; 134(2)∶127
9，Gundersen HJ, Bagger P, Bendtsen TF et al. The new sterological tools:disector, fractionator, nucleator and point sampled intercepts and their use in pathological research and diagnosis. APMIS, 1988; 96(10)∶857
10，Mayhew TM, Gundersen HJG. If you assume, you can make an ass out of u and me:a decade of the disector for sterological counting of particles in 3D space. J Anat, 1996; 183(1)∶1
, 百拇医药
11，Gundersen HJG. Notes on estimation of the numberical density of arbitrary profiles: the edge effect. J Microsc, 1977; 111(2)∶219
12，Simpson A. Windows 95 UNCUT. California: IDG Books Worldwide Inc, 1995
13，Rahmel D, Rahel R. Developing Client/Server Application with Visual Basic 4.0 SAMS Publishing, 1995
14，Small JV. Measurement of section thickness. In: Bocciarelli DS. Proceeding of the Fourth European Congress on Electronic Microscopy, Roma:Tipografia poliglotta vaticana, 1968；1:609
(收稿：1998-11-10), 百拇医药