聚羟基磷酸钙钠的骨细胞相容性体外研究
作者：唐昭 陈治清 刘卫军
单位：唐昭(暨南大学 医学院口腔系，广州 510632)；陈治清(华西医科大学 口腔医学院材料学教研室，成都 610041)；刘卫军(暨南大学 医学院口腔系，广州 510632)
关键词：成骨细胞；生物相容性；硬组织替代材料
生物医学工程学杂志000202 摘要 聚羟基磷酸钙钠(Hydroxyl polycalcium sodium phosphate, HP)是一种新的人体硬组织替代材料。本实验选用S.D乳鼠颅顶骨成骨细胞，采用体外细胞培养技术，从细胞水平评价聚羟基磷酸钙钠的骨细胞相容性体外研究。结果表明细胞在HP表面正常粘附、伸展、增殖，具有良好的细胞附着形态及细胞增殖率，其增殖速度较羟基磷灰石(HA)、生物玻璃陶瓷(BGC)快，表明HP更有利于细胞的粘附生长，容易形成早期骨性结合，是一种骨细胞相容性良好的人体硬组织替代材料。
, 百拇医药
Study on Osteocompatibility of Hydroxyl Polycalcium Sodium Phosphate in vitro
Tang Zhao Liu Weijun
(Department of Stomatology,Medical College,Jinan University,Guangzhou 510632)
Chen Zhiqing
(College of Stomatology,West China University of Medical Sciences,Chengdu 610041)
Abstract Hydroxyl polycalcium sodium phosphate(HP) is a new substitute material for human hard tissues.The isolated rat osteoblasts from the parietal and frontal bones of 1-3d SpragueDawley rats were used to estimate the osteocompatibility of HP in this study.The effects of the materials on cell morphology,growth and proliferation were determined.The result showed that rat osteoblasts could attach,spread and proliferate on HP as normal cells.The proliferation of cells on HP was more favour able to the adhesion and proliferation of rat osteoblasts and could form osteointergration early.
, 百拇医药
Key words Osteoblasts Biocompatibility Subsititute materials for hard tissues
1 引 言
人体硬组织替代材料用于修复各种原因所致的骨缺损、畸形等，恢复或重建其生理功能。目前常用的有金属、陶瓷、高分子三大类。按其生物学特性可分为生物惰性和生物活性两大类[1]。具有生物活性的人体硬组织替代材料除应具有行使替代部位生理功能如支撑作用或骨引导作用外，还应能模拟人体骨的生长与吸收，参与植入部位的新陈代谢，与组织进行物质交换[2]。因而具有生物活性的人体硬组织替代材料一直是国内外学者共同研究的课题。本实验选用S.D乳鼠颅顶骨成骨细胞，采用细胞体外培养方法，从细胞形态及增殖等方面评价新的人体硬组织替代材料——聚羟基磷酸钙钠(HP)的骨细胞相容性。
2 材料和方法
, 百拇医药
2.1 材料
HA(华西医科大学口腔医学院材料教研室提供)
BGC(华西医科大学口腔生物医学重点实验室提供)
HP(中国科学院成都有机化学研究所提供)
2.1.1 圆片型材料 所有材料均制备成直径7 mm、厚1 mm的圆片状，75%乙醇超声震荡清洗后，双蒸水超声震荡数遍，烘干，高压灭菌备用。
2.1.2 材料浸提液 200目以下的材料经高温灭菌处理后，分别加入199培养液(日本株式会社提供，20%小牛血清，青霉素，链霉素，VitC等)配制成20 mg/ml,37 ℃静置浸提120 h，4 ℃保存备用。
2.1.3 细胞 选用原代分离培养的来源于S.D乳鼠的颅顶骨成骨细胞(第三代)用于实验[3]。
, 百拇医药
2.2 方法
2.2.1 材料表面附着细胞形态观察 在4只25 ml培养瓶中分别放入HA、BGC、HP圆片型材料各4片，将细胞浓度为3×105/ml的鼠成骨细胞分别接种于材料的表面，静置片刻，缓慢从材料边缘加入199培养液，密闭后置于37 ℃恒温培养箱中密闭培养，逐日在Nikon倒置相差显微镜下观察，并摄像记录。同时取出1、5 d标本，3%戊二醛固定，梯度酒精逐级脱水，CO2干燥后表面喷镀金，AMRAY—1000B扫描电镜(美国)25KV条件观察材料表面附着细胞形态。
2.2.2 材料对细胞培养的影响 将成骨细胞、成纤维细胞以浓度为2×104/w接种于96孔培养板中，加入250 μl 199培养液，37 ℃恒温密闭培养24 h，待细胞贴壁成活后分别于每孔中加入材料浸提液100 μl，199培养液150 μl。空白对照组加入199培养液250 μl。每组材料重复5孔，37 ℃恒温密闭培养，分别于1、3、5 d取样。PBS缓冲液反复清洗，0.05%结晶紫染色20 min，弃去染料。PBS反复清洗后烘干，抽提液(含柠檬酸钠，酒精)抽提，酶标仪EL312e(美国)比色，波长490 nm,参考波长630 nm，测定每孔光吸收值(0.D)，取其均值，绘制增殖曲线。
, 百拇医药
3 结 果
3.1 材料表面附着细胞形态学观察
光镜下显示，接种24 h后，材料边缘仅少量细胞附着，瓶壁上有散在的单个或多个细胞群，细胞呈三角形、短梭形或圆形。随着培养时间的延长，材料边缘及瓶壁上附着细胞量逐渐增加，显示出良好的细胞生长趋势。三种材料中以HP和HA附着细胞密度增加相对明显.未见细胞变形或坏死(见图1、2)。
图1 HP与成骨细胞共同培养3 d，10×10
材料边缘附着细胞较少，细胞呈三角形、短梭形，未见细胞变性或坏死
Fig 1 Osteoblasts cultured for 3 days on HP,10×10
, 百拇医药
Few cells attached to the edge of material,the morphology of cells were triangle or short spindle
图2 HP与成骨细胞共同培养7 d，10×10
材料边缘附着细胞明显增多，细胞形态未见改变
Fig 2 Osteoblasts cultured for 7 days on HP,10×10
Attached cells on the edge of material obviously increased.No cell morphology was observed
, 百拇医药
SEM观察表明，接种24 h后，细胞在材料表面以细长突起伸入到HP颗粒之间，形成一种锚状结构，牢固的粘附于材料表面，并在材料表面伸展。此时细胞外基质较少，随着培养时间的不断延长，细胞在材料表面分裂增殖，并分泌较多的细胞外基质，包裹材料颗粒各种材料表面附着细胞形态未见明显差异(见图3、4)。
3.2 材料对细胞增殖的影响
结果表明：(1)对同一种材料，成纤维细胞生长速度快于成骨细胞(P<0.05)；(2)HP、HA、BGC三种材料生长速度与对照组相比无显著差异(P>0.05)，但HP成骨细胞增殖速度快于HA、BGC(P<0.05)，表明HP同HA、BGC一样不影响成骨细胞生长，同时优于其他两种常用的替代材料，具有优良的骨细胞相容性，易形成早期骨性结合(见图5)。
图3 HP与成骨细胞共同培养1 d
, 百拇医药
HP颗粒间有成骨细胞突起，形成锚状结构
Fig 3 Osteoblasts cultured for 1 day on HP
Osteoblasts towered from the HP granules,and interlock structure was formed
图4 成骨细胞增殖曲线
Fig 4 Curves for the proliferation of osteoblasts
图5 成纤维细胞增殖曲线
, http://www.100md.com
Fig 5 Curves for the proliferation of fibroblasts
4 讨 论
随着生物医学和材料科学的不断发展，各种各样的人体替代材料应运而生，尤其是硬组织替代材料。理想的硬组织替代材料应该具有良好的生物相容性。所谓生物相容性应该包含两个方面的含义，即材料对组织的影响以及组织对材料的反应。目前临床上所用的人体硬组织替代材料很多，按其生物学特性分为生物惰性与生物活性两大类。所谓惰性材料即要求材料不引起宿主反应，不被机体分解，化学性能稳定，无致畸、致敏、致突变、无毒性等。如碳和三氧化二铝。随着医学的发展，惰性材料已不能满足临床要求，因而提出了生物活性材料。理想的生物活性材料不仅能替代缺损部位行使功能，更重要的是能参与机体新陈代谢，具有骨形成或骨诱导作用[2]。
聚羟基磷酸钙钠(HP)是一种新研制的人体硬组织替代材料，本实验选用S.D乳鼠颅顶骨成骨细胞评价HP的骨细胞相容性.结果表明HP能与细胞牢固粘附，分泌胞外基质，并分裂增殖，其增殖速度较HA、BGC快，显示出良好的骨细胞相容性，预示着其诱骨能力可能优于HA、BGC，易早期形成骨性结合。HP这种良好的成骨性能与其组成和结构特性有关。
, 百拇医药
HP含有Ca、P、Na等无机成分，与骨的组成成分基本一致，因而其分解产物对机体无毒，不影响细胞的生长增殖。pH值7.0～8.0，呈弱硷性，与骨的pH值接近，在硷性环境中成骨细胞的生长，胞内酶的活性均更为活跃，新陈代谢加快。
HP在体液环境中的溶解性大于HA，从扫描电镜观察，HP、HA、BGC植入体内3个月后，表面均有不同程度的降解，降解最为明显的为HP[4]。这种较大的溶解性有利于材料与机体进行物质交换。据研究报道，将HA、HP植入狗牙槽骨中，埋植3个月后，HP钙含量高于HA13.8个百分点，3个月后，Ca2+增量高于HA17.9个百分点。表明HP捕捉和结合钙的能力均大于HA。局部钙离子浓度增加，有利于细胞的粘附，促进新骨的形成及钙化，形成早期的骨性结合。HA是目前较为理想的替代材料，由于晶体结构完好，因而化学性能稳定，溶解性较低，捕捉及交换Ca2+能力相对较低[5]。
, 百拇医药
材料表面吸附蛋白质会影响骨细胞中主要无机盐——羟基磷灰石晶体的形成，而在吸附蛋白质的材料表面成骨细胞生长明显加快。据报道，在一定条件下HP能和白蛋白形成共价键结合，而HA、BGC则难以形成结合。这种结合与HP结构中活化羟基有关[6]。由此可知，HP优于HA、BGC的成骨性能可能还与材料结合蛋白质能力有关。
总之，人体硬组织替代材料的研究日新月异，具有骨诱导潜能的生物材料将成为材料研究发展的趋势。作为一种新型的人体硬组织替代材料，HP具有优良的骨细胞相容性。但对其其它生物学性能还有待于进一步研究。
国家自然科学基金资助项目(39330090)
参考文献
1，Oliva A,Ragione FD,Slerno A et al.Bicompatibility studies on glass innomer cements by primary cultures of human osteoblasts.Biomaterials.1996;17(13)∶1351
, 百拇医药
2，陈治清.具有生物活性的人体硬组织替代材料的研究.(715-29601-02)内部文件
3，唐 昭，陈治清.大鼠成骨细胞体外培养的研究.华西口腔医学杂志，1997；15(1)∶70
4，陈建治.人体硬组织替代材料——骨界面的元素和酶活性分析的实验研究.华西医科大学研究生学位论文.1996∶18
5，欧国敏.人体硬组织替代材料对骨源性IGF-Ⅰ的表达水平影响的研究.华西医科大学研究生学位论文.1996∶52
6，喻 凯，陈治清.人体硬组织替代材料表面键合蛋白方法的研究.生物医学工程学杂志，1998；15(1)∶32
(收稿：1998-10-30 修回：1999-06-07), 百拇医药
单位：唐昭(暨南大学 医学院口腔系，广州 510632)；陈治清(华西医科大学 口腔医学院材料学教研室，成都 610041)；刘卫军(暨南大学 医学院口腔系，广州 510632)
关键词：成骨细胞；生物相容性；硬组织替代材料
生物医学工程学杂志000202 摘要 聚羟基磷酸钙钠(Hydroxyl polycalcium sodium phosphate, HP)是一种新的人体硬组织替代材料。本实验选用S.D乳鼠颅顶骨成骨细胞，采用体外细胞培养技术，从细胞水平评价聚羟基磷酸钙钠的骨细胞相容性体外研究。结果表明细胞在HP表面正常粘附、伸展、增殖，具有良好的细胞附着形态及细胞增殖率，其增殖速度较羟基磷灰石(HA)、生物玻璃陶瓷(BGC)快，表明HP更有利于细胞的粘附生长，容易形成早期骨性结合，是一种骨细胞相容性良好的人体硬组织替代材料。
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Study on Osteocompatibility of Hydroxyl Polycalcium Sodium Phosphate in vitro
Tang Zhao Liu Weijun
(Department of Stomatology,Medical College,Jinan University,Guangzhou 510632)
Chen Zhiqing
(College of Stomatology,West China University of Medical Sciences,Chengdu 610041)
Abstract Hydroxyl polycalcium sodium phosphate(HP) is a new substitute material for human hard tissues.The isolated rat osteoblasts from the parietal and frontal bones of 1-3d SpragueDawley rats were used to estimate the osteocompatibility of HP in this study.The effects of the materials on cell morphology,growth and proliferation were determined.The result showed that rat osteoblasts could attach,spread and proliferate on HP as normal cells.The proliferation of cells on HP was more favour able to the adhesion and proliferation of rat osteoblasts and could form osteointergration early.
, 百拇医药
Key words Osteoblasts Biocompatibility Subsititute materials for hard tissues
1 引 言
人体硬组织替代材料用于修复各种原因所致的骨缺损、畸形等，恢复或重建其生理功能。目前常用的有金属、陶瓷、高分子三大类。按其生物学特性可分为生物惰性和生物活性两大类[1]。具有生物活性的人体硬组织替代材料除应具有行使替代部位生理功能如支撑作用或骨引导作用外，还应能模拟人体骨的生长与吸收，参与植入部位的新陈代谢，与组织进行物质交换[2]。因而具有生物活性的人体硬组织替代材料一直是国内外学者共同研究的课题。本实验选用S.D乳鼠颅顶骨成骨细胞，采用细胞体外培养方法，从细胞形态及增殖等方面评价新的人体硬组织替代材料——聚羟基磷酸钙钠(HP)的骨细胞相容性。
2 材料和方法
, 百拇医药
2.1 材料
HA(华西医科大学口腔医学院材料教研室提供)
BGC(华西医科大学口腔生物医学重点实验室提供)
HP(中国科学院成都有机化学研究所提供)
2.1.1 圆片型材料 所有材料均制备成直径7 mm、厚1 mm的圆片状，75%乙醇超声震荡清洗后，双蒸水超声震荡数遍，烘干，高压灭菌备用。
2.1.2 材料浸提液 200目以下的材料经高温灭菌处理后，分别加入199培养液(日本株式会社提供，20%小牛血清，青霉素，链霉素，VitC等)配制成20 mg/ml,37 ℃静置浸提120 h，4 ℃保存备用。
2.1.3 细胞 选用原代分离培养的来源于S.D乳鼠的颅顶骨成骨细胞(第三代)用于实验[3]。
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2.2 方法
2.2.1 材料表面附着细胞形态观察 在4只25 ml培养瓶中分别放入HA、BGC、HP圆片型材料各4片，将细胞浓度为3×105/ml的鼠成骨细胞分别接种于材料的表面，静置片刻，缓慢从材料边缘加入199培养液，密闭后置于37 ℃恒温培养箱中密闭培养，逐日在Nikon倒置相差显微镜下观察，并摄像记录。同时取出1、5 d标本，3%戊二醛固定，梯度酒精逐级脱水，CO2干燥后表面喷镀金，AMRAY—1000B扫描电镜(美国)25KV条件观察材料表面附着细胞形态。
2.2.2 材料对细胞培养的影响 将成骨细胞、成纤维细胞以浓度为2×104/w接种于96孔培养板中，加入250 μl 199培养液，37 ℃恒温密闭培养24 h，待细胞贴壁成活后分别于每孔中加入材料浸提液100 μl，199培养液150 μl。空白对照组加入199培养液250 μl。每组材料重复5孔，37 ℃恒温密闭培养，分别于1、3、5 d取样。PBS缓冲液反复清洗，0.05%结晶紫染色20 min，弃去染料。PBS反复清洗后烘干，抽提液(含柠檬酸钠，酒精)抽提，酶标仪EL312e(美国)比色，波长490 nm,参考波长630 nm，测定每孔光吸收值(0.D)，取其均值，绘制增殖曲线。
, 百拇医药
3 结 果
3.1 材料表面附着细胞形态学观察
光镜下显示，接种24 h后，材料边缘仅少量细胞附着，瓶壁上有散在的单个或多个细胞群，细胞呈三角形、短梭形或圆形。随着培养时间的延长，材料边缘及瓶壁上附着细胞量逐渐增加，显示出良好的细胞生长趋势。三种材料中以HP和HA附着细胞密度增加相对明显.未见细胞变形或坏死(见图1、2)。
图1 HP与成骨细胞共同培养3 d，10×10
材料边缘附着细胞较少，细胞呈三角形、短梭形，未见细胞变性或坏死
Fig 1 Osteoblasts cultured for 3 days on HP,10×10
, 百拇医药
Few cells attached to the edge of material,the morphology of cells were triangle or short spindle
图2 HP与成骨细胞共同培养7 d，10×10
材料边缘附着细胞明显增多，细胞形态未见改变
Fig 2 Osteoblasts cultured for 7 days on HP,10×10
Attached cells on the edge of material obviously increased.No cell morphology was observed
, 百拇医药
SEM观察表明，接种24 h后，细胞在材料表面以细长突起伸入到HP颗粒之间，形成一种锚状结构，牢固的粘附于材料表面，并在材料表面伸展。此时细胞外基质较少，随着培养时间的不断延长，细胞在材料表面分裂增殖，并分泌较多的细胞外基质，包裹材料颗粒各种材料表面附着细胞形态未见明显差异(见图3、4)。
3.2 材料对细胞增殖的影响
结果表明：(1)对同一种材料，成纤维细胞生长速度快于成骨细胞(P<0.05)；(2)HP、HA、BGC三种材料生长速度与对照组相比无显著差异(P>0.05)，但HP成骨细胞增殖速度快于HA、BGC(P<0.05)，表明HP同HA、BGC一样不影响成骨细胞生长，同时优于其他两种常用的替代材料，具有优良的骨细胞相容性，易形成早期骨性结合(见图5)。
图3 HP与成骨细胞共同培养1 d
, 百拇医药
HP颗粒间有成骨细胞突起，形成锚状结构
Fig 3 Osteoblasts cultured for 1 day on HP
Osteoblasts towered from the HP granules,and interlock structure was formed
图4 成骨细胞增殖曲线
Fig 4 Curves for the proliferation of osteoblasts
图5 成纤维细胞增殖曲线
, http://www.100md.com
Fig 5 Curves for the proliferation of fibroblasts
4 讨 论
随着生物医学和材料科学的不断发展，各种各样的人体替代材料应运而生，尤其是硬组织替代材料。理想的硬组织替代材料应该具有良好的生物相容性。所谓生物相容性应该包含两个方面的含义，即材料对组织的影响以及组织对材料的反应。目前临床上所用的人体硬组织替代材料很多，按其生物学特性分为生物惰性与生物活性两大类。所谓惰性材料即要求材料不引起宿主反应，不被机体分解，化学性能稳定，无致畸、致敏、致突变、无毒性等。如碳和三氧化二铝。随着医学的发展，惰性材料已不能满足临床要求，因而提出了生物活性材料。理想的生物活性材料不仅能替代缺损部位行使功能，更重要的是能参与机体新陈代谢，具有骨形成或骨诱导作用[2]。
聚羟基磷酸钙钠(HP)是一种新研制的人体硬组织替代材料，本实验选用S.D乳鼠颅顶骨成骨细胞评价HP的骨细胞相容性.结果表明HP能与细胞牢固粘附，分泌胞外基质，并分裂增殖，其增殖速度较HA、BGC快，显示出良好的骨细胞相容性，预示着其诱骨能力可能优于HA、BGC，易早期形成骨性结合。HP这种良好的成骨性能与其组成和结构特性有关。
, 百拇医药
HP含有Ca、P、Na等无机成分，与骨的组成成分基本一致，因而其分解产物对机体无毒，不影响细胞的生长增殖。pH值7.0～8.0，呈弱硷性，与骨的pH值接近，在硷性环境中成骨细胞的生长，胞内酶的活性均更为活跃，新陈代谢加快。
HP在体液环境中的溶解性大于HA，从扫描电镜观察，HP、HA、BGC植入体内3个月后，表面均有不同程度的降解，降解最为明显的为HP[4]。这种较大的溶解性有利于材料与机体进行物质交换。据研究报道，将HA、HP植入狗牙槽骨中，埋植3个月后，HP钙含量高于HA13.8个百分点，3个月后，Ca2+增量高于HA17.9个百分点。表明HP捕捉和结合钙的能力均大于HA。局部钙离子浓度增加，有利于细胞的粘附，促进新骨的形成及钙化，形成早期的骨性结合。HA是目前较为理想的替代材料，由于晶体结构完好，因而化学性能稳定，溶解性较低，捕捉及交换Ca2+能力相对较低[5]。
, 百拇医药
材料表面吸附蛋白质会影响骨细胞中主要无机盐——羟基磷灰石晶体的形成，而在吸附蛋白质的材料表面成骨细胞生长明显加快。据报道，在一定条件下HP能和白蛋白形成共价键结合，而HA、BGC则难以形成结合。这种结合与HP结构中活化羟基有关[6]。由此可知，HP优于HA、BGC的成骨性能可能还与材料结合蛋白质能力有关。
总之，人体硬组织替代材料的研究日新月异，具有骨诱导潜能的生物材料将成为材料研究发展的趋势。作为一种新型的人体硬组织替代材料，HP具有优良的骨细胞相容性。但对其其它生物学性能还有待于进一步研究。
国家自然科学基金资助项目(39330090)
参考文献
1，Oliva A,Ragione FD,Slerno A et al.Bicompatibility studies on glass innomer cements by primary cultures of human osteoblasts.Biomaterials.1996;17(13)∶1351
, 百拇医药
2，陈治清.具有生物活性的人体硬组织替代材料的研究.(715-29601-02)内部文件
3，唐 昭，陈治清.大鼠成骨细胞体外培养的研究.华西口腔医学杂志，1997；15(1)∶70
4，陈建治.人体硬组织替代材料——骨界面的元素和酶活性分析的实验研究.华西医科大学研究生学位论文.1996∶18
5，欧国敏.人体硬组织替代材料对骨源性IGF-Ⅰ的表达水平影响的研究.华西医科大学研究生学位论文.1996∶52
6，喻 凯，陈治清.人体硬组织替代材料表面键合蛋白方法的研究.生物医学工程学杂志，1998；15(1)∶32
(收稿：1998-10-30 修回：1999-06-07), 百拇医药