利用可生物降解共聚膜引导骨再生
作者：黄岚峰 刘建国 徐莘香
单位：白求恩医科大学第一临床学院骨科(长春，130021)
关键词：骨缺损；引导性骨再生；膜生物降解材料
中国修复重建外科杂志990515 【摘 要】 目的 采用生物降解可吸收材料聚己内酯(PCL)和聚乳酸(PLA)共聚膜修复长骨节段性骨缺损，探讨其引导性骨再生的效果及机制。方法 采用兔桡骨中段1.2 cm节段性骨缺损(保留骨膜)动物模型24只，平均分成两组，实验组用膜包绕骨缺损区，对照组缺损区不处置，分别于术后3、6及12周处死动物，进行X线片、大体及组织学观察。结果 实验组缺损区骨生长明显优于对照组，术后3周实验组可见明显的骨痂沿膜外生长；术后6周以桥接的外骨痂形成骨性连接；术后12周膜内外均形成骨性连接，对照组从术后6周开始表现为骨不连。结论 利用可生物降解的膜性材料可引导骨组织再生，通过膜外骨痂以及形成相对迟缓的膜内骨痂共同完成骨缺损的修复；膜性材料通过屏障作用一方面有效地阻挡纤维组织长入缺损区，防止骨不连形成，另一方面在局部形成营养物质浓聚，并通过表面的微孔为骨细胞生长充当支架，促进骨缺损愈合。
, 百拇医药
GUIDED BONE REGENERATION BY USING BIODEGRADABLE CO-POLYMER MEMBRANES IN RABBITS
HUANG Lan-feng,LIU Jian-guo, XU Xin-xiang.
Department of Orthopedic Surgery, The First Clinical Hospital of Norman Bethun University of Medical Science.Changchun Jilin, P.R.China 130021.E-mail:ydyy@public.cc.jl.cn
【Abstract】 Objective To repair long bone segmental defects using biodegradable poly ε-caprolactone (PCL) and polylactic acid( PLA) co-polymer membranes, and explore its role and mechanism in guided bone regeneration (GBR).Methods Rabbit radial segmental defects (1.2cm in length, retain the periosteum) were created in this study, 24 animals were divided into 2 groups. The membranes were used to enclose the defects in experimental group, and no treatment in control group. After 3,6,and 12 weeks of operation, X-ray, gross and histological examinations were observed.Results The bone regeneration of experimental group was better than that of control group.Three weeks after operation, obvious external callus along the membrane were found in experimental group, and bony linking composed of external callus bridge were found in 6 weeks after operation. After 12 weeks of operation, callus bridge outside the membrane and bony reunion inside the membrane were achived in experimental group. While in control group, typical nonunion was observed after 6 weeks of operation.Conclusion Guided bone regeneration can be achieved by using biodegradable membrane. The defects are repaired by the means of outside membrane callus and relatively late inside membrane callus. The membrane can prevent the ingrowth of fibrous tissue into defect area, thus nonunion are avoid, and keep a high concentration of nutritive elements, also serve as a frame for osteocyte growth to enhance bone healing.
, 百拇医药
【Key words】 Bone defect Guided bone regeneration Membrane biodegradable
material
Foundation item: Major National Programme of "Nation's 9th Five Year Project"(96-120-11)
引导性骨再生(guided bone regeneration, GBR)技术是一种膜干扰技术，大量的实验研究已经证实，利用膜性材料包绕骨缺损区域可以引导骨组织再生，有效地促进骨缺损的愈合，但其中的修复模式与机制尚有争论。生物降解可吸收材料作为体内暂时性植入物可以避免第二次手术的痛苦，是当前内植物研究的发展趋势。我们的实验将生物降解可吸收的膜性材料用于引导性骨再生技术中，修复兔桡骨节段性缺损，进一步探讨引导性骨再生的修复方式及机制。
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1 材料与方法
1.1 动物模型
成年日本大耳白兔24只，平均体重2.5 kg，雌雄不限。分成两组，每组12只。采用双侧桡骨中段长1.2 cm节段性骨缺损(保留骨膜)模型，双侧处理方法相同。实验组：用膜性材料包绕骨缺损远、近断端约3 mm，将膜用可吸收线缝合成管状。对照组：缺损区不作任何处置作为空白对照，然后逐层缝合。不用固定，在同一条件下单笼喂养。
1.2 膜性材料
由我院与中国科学院长春应用化学研究所共同研制的聚己内酯(poly ε-caprolactone,PCL)/聚乳酸(polylactic acid,PLA)共聚物，厚度为200 μm，环氧乙烷熏蒸消毒48小时。
1.3 观察指标
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分别于术后3、6及12周过量静脉麻醉处死动物，取双侧前臂进行观察。
1.3.1 X线片观察 摄双侧前臂侧位X线片，条件为50 kV、50 mA、0.1 s、1.0 m。用扫描仪将X线图像输入计算机，选取骨缺损局部2.0 cm×1.0 cm进行图像分析，利用OPTIMAS 6.1软件计算骨痂面积和骨痂的平均灰度，结果进行统计学处理。
1.3.2 大体观察 不同时间观察骨缺损局部炎性反应程度及骨痂形成情况。
1.3.3 组织学观察 以骨缺损为中心截取约2.5 cm组织块，在10%中性福尔马林溶液中固定48小时后，置于复方甲酸溶液中脱钙3天，沿纵轴冠状面切取桡骨中部厚约2 mm的骨质，酒精中逐级脱水，石蜡包埋，切片，HE染色后光镜下观察。
2 结果
, 百拇医药 2.1 X线观察
2.1.1 X线片表现 术后3周实验组骨断端略膨大，可见有明显的外骨痂生长，沿膜的表面形成条形的密度增高影，断端处内外骨痂之间可见一裂隙(图1a)；对照组断端有少量骨痂生长，尺侧有骨痂长入缺损区(图2a)。术后6周实验组断端膨大，外骨痂在骨缺损的上方形成连续的条形高密度影，缺损区密度增高，缺损减小(图1b)；对照组骨断端细小，与尺骨形成骨性连接，缺损区明显(图2b)。术后12周实验组膜内、外均见连续性高密度影，内、外骨痂之间可见条形低密度区，骨缺损桥接愈合(图1c)；对照组与6周时改善不明显，已形成骨不连(图2c)。
图1 术后不同时间实验组X线片
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a 3周 b 6周 c 12周
Fig. 1 X-ray of experimental group in different time of postoperation a 3 weeks b 6 weeks c 12 weeks
图2 术后不同时间对照组X线片
a 3周 b 6周 c 12周
Fig. 2 X-ray of control group in different time of postoperation
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a 3 weeks b 6 weeks c 12 weeks
2.1.2 X线图像分析 图像分析结果进行t检验，骨痂面积：术后3、6及12周实验组骨痂形成面积均明显优于对照组(P<0.05)，实验组术后6周与12周相比无明显差异(P>0.05)。骨痂灰度：术后3周实验组骨痂灰度优于对照组(P<0.05)，术后6周及12周对照组骨痂灰度均明显超过实验组(P<0.05)，结果见附表。
附表 X线图像分析-骨痂面积与骨痂灰度(
±s)
Tab. X-ray image analysis of callus area and gray(±s) 检测项目
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Detection item
组别
Groups
3周
3 weeks
6周
6 weeks
12周
12 weeks
骨痂面积(象素)
Callus area(dpi)
实验组
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Experimental group
3.61±0.36
7.60±0.46
7.58±0.38
对照组
Control group
2.93±0.17
3.75±0.21
3.99±0.19
骨痂灰度(灰阶)
Callus gray(gray scale)
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实验组
Experimental group
118.84±4.86
133.20±3.96
144.28±4.76
对照组
Control group
113.95±4.40
140.29±3.57
157.92±5.76
2.2 大体观察
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术后3周实验组骨缺损断端略膨大，骨痂从骨断端沿膜外生长，膜所在的空间形成狭窄的间隙。在膜内可见新骨从骨断端向缺损中心生长，膜内未见软组织；材料未见明显降解；对照组骨缺损区被大量的软组织充填，骨端有细小骨痂生长，无外骨痂形成。术后6周实验组桡骨增粗，外表已见不到骨缺损，沿膜生长的新骨形成骨性连接，膜的脆性增加，出现裂纹，不能完整取出，与周围组织无粘连。膜内骨断端尚未形成骨性连接，之间未见软组织；对照组骨断端呈锥形，与尺骨形成骨性连接，断端之间夹有软组织。术后12周实验组连续性的桥接外骨痂质地变硬。膜已降解成1.0 mm×1.0 mm×1.0 mm左右的颗粒状。膜内骨断端已形成骨性连接；在内、外骨痂之间形成环形腔隙；对照组断端封闭，缺损区见大量软组织，形成典型的骨不连。
2.3 组织学观察
实验组膜材料在制片中脱落，表现为空白裂隙。术后3周实验组见新骨从两端沿膜生长并将膜包在其中，膜内新骨相对少于膜外，骨缺损区中央未见纤维细胞成分；对照组未见外骨痂形成，断端见有少量新骨形成，缺损中央有大量的纤维组织包绕骨断端。术后6周实验组膜外形成连续的网状骨痂，膜内新骨生长仍落后于膜外，骨痂形成已超过缺损区的1/2。对照组骨缺损的断端被致密的结缔组织封闭。术后12周实验组膜外及膜内均形成骨性连接，膜内骨痂少于膜外，可见不成熟的骨小梁，内、外骨痂之间未见融合，空白裂隙明显(图3)；对照组断端纤细，皮质骨将髓腔封闭，形成骨不连。实验组在术后各个阶段均未见大量炎性细胞的聚集。
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图3 实验组术后12周缺损区组织学检查(HE×4)
Fig. 3 Histological section of bone defect area in experimental group at 12 weeks after operation (HE×4)
3 讨论
3.1 引导性骨再生的现象
80年代初引导组织再生(guided tissue regeneration,GTR)技术首先在修复牙周组织缺损中使用，以后大量的研究证实了利用膜性材料的屏障作用可以引导组织再生，证明了它可以修复牙周组织以及扁平骨缺损[1]。Nielsen等[2] 利用可吸收的聚氨基甲酸乙酯膜修复兔桡骨中段1.0 cm节段性骨缺损，术后5周时发现在膜的外表面形成了一层连续的骨痂，使骨缺损坚固地愈合，而在膜内形成的新骨很少。我们的实验采用1.2 cm骨缺损模型，应用可降解吸收的PCL/PLA共聚膜，术后6周膜外有连续性的外骨痂形成，使骨缺损桥接；12周时通过外骨痂及形成相对迟缓的内骨痂使骨缺损愈合。结果表明：膜性材料在引导性骨再生中可以明显的促进膜外及膜内骨痂的形成。与Nielsen的结果不完全一致。尽管膜内骨痂的形成相对滞后，但也是引导性骨再生的关键。张子军等[3]利用硅胶膜修复兔桡骨1.0 cm节段性骨缺损，发现新骨形成均在膜内进行，考虑由于缺损区骨膜处理方法的不同，而导致膜外骨痂形成的不同。倪斌等[4] 利用壳多糖修复0.8 cm兔桡骨节段性缺损，6周时在膜外见到特殊的、薄层且连续性较好的外骨痂，形成较清晰的骨痂桥，骨断端有相对少量骨痂生长，与我们的实验结果类似。因此，我们认为引导性骨再生对膜内和膜外骨痂形成均有引导和促进作用。
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3.2 引导性骨再生中骨缺损愈合机制探讨
3.2.1 原始骨痂的形成 骨缺损愈合与骨折愈合过程的区别主要在于原始骨痂形成期，也是骨愈合最关键的时期。我们的实验观察表明，原始骨痂的形成在整个愈合过程中占有重要地位。X线图像分析骨痂面积结果显示实验组骨痂面积在各个阶段均优于对照组。骨愈合首先表现为原始骨痂形成，然后在足够量原始骨痂的基础上进行矿化、钙盐沉积。X线上表现出骨痂灰度升高。术后3周两组均处于原始骨痂形成期，实验组骨痂灰度高于对照组，术后6周对照组骨痂灰度增加较快，说明对照组此时已基本结束了原始骨痂的形成，开始加速局部的矿化、钙盐沉积，但由于骨痂面积较小，在骨性连接以前使断端钙化、封闭，组织学显示术后12周断端已被皮质骨封闭；形成骨不连，而实验组术后6周及12周表现为骨缺损区密度普遍增高，平均骨痂灰度低于对照组，X线表现无骨不连趋势，说明与对照组相比仍有原始骨痂形成，以达到缺损区的骨性连接。实验证明膜性材料对骨缺损愈合过程中原始骨痂的形成有明显促进作用，进一步证实了引导性骨再生在修复节段性骨缺损中的作用。由于膜外血运及间充质细胞来源丰富，膜的屏障作用可能也限制了血管及有成骨作用的细胞和生长因子进入缺损区，这可能是膜内骨痂形成相对迟缓的原因之一。
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3.2.2 引导性骨再生中的膜外及膜内骨痂 我们的实验组中大量外骨痂的形成是由于膜性材料促进了外骨膜的成骨作用。由于未去除缺损区外骨膜，故有成骨作用的骨膜生发层细胞在外骨痂形成的过程中起了重要作用，而膜性材料则起细胞支架作用，使细胞可以沿着表面具有微孔的膜性材料向前爬行，微孔有利于细胞的粘附；对照组由于缺乏细胞支架作用，使生发层细胞的成骨活性无方向性，只能形成局部有限的骨膜反应。张浩等[5]在去除外骨膜的引导性骨再生实验中，在膜外见到少量骨痂，认为与外骨膜无关。Pineda等[6]采用三种不同孔径的膜进行相同的实验，证明膜对局部营养物质有浓聚作用。张子军等[3]采用免疫组织化学染色见膜内BMP染色阳性，认为是由于膜的屏蔽及收集作用使膜内BMP浓度增高并均匀分布，促进膜内新骨形成。我们的实验将生物降解可吸收膜在骨缺损局部缝制成管形，虽然不是完全封闭的空间，但在一定程度上阻碍了BMP等活性物质扩散，使局部生长因子等物质浓聚，促进膜内骨痂形成，其中也有材料对膜内细胞生长的依附作用，以上可能是膜引导再生最基本的作用。
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3.3 生物降解可吸收材料
PCL/PLA是通过共聚的方式调节PCL和PLA组分的含量，进而控制聚合物的降解速度以满足实际应用的要求[7]。组织学及大体观察结果显示材料具有良好的生物相容性和降解性，在我们的实验中，术后12周未吸收的材料在局部阻碍内、外骨痂融合，对骨缺损愈合后的骨改建产生不利影响，所以尚需进一步改进工艺，调控材料在骨愈合后的吸收速度和过程，同时可以设想结合一些促进骨愈合的细胞或生长因子制成组织工程人工骨。
基金项目：国家计划委员会“九五”重点科技攻关资助项目(96-120-11)
参考文献
1 郭现辉，郭洪刚，刘建丰.膜引导组织再生技术在骨缺损治疗中的应用.中国修复重建外科杂志，1998；12(5)：301
, 百拇医药 2 Nielsen FF, Karring T, Gogolewski S. Biodegradable guided for bone regeneration, polyuerthane membrane tested in rabbit radius defects. Acta Orthop Scand, 1992;63：66
3 张子军，卢世璧，王继芳.引导性骨再生的初步研究.中华实验外科杂志，1995；12：59
4 倪 斌，戈俊国，侯春林，等.壳多糖膜管修复兔桡骨缺损的实验研究.解放军医学杂志，1995；20：171
5 张 浩，卢世璧，王继芳.去除外骨膜对引导性骨再生模型成骨过程的影响.中华外科杂志，1998；36：278
6 Pineda LM, Busing M, Meinig RP, et al. Bone regeneration with resorbable polymeric membranes. Effect of poly(L-lactide) membrane pore size on the healing process in large defects. Journal of Biomedical Materials Research, 1996;31：385
7 崔秀敏.医用合成可降解生物材料的新进展.国外医学 生物医学工程分册，1995；18：324
(收稿：1998-12-14 修回：1999-06-03), 百拇医药
单位：白求恩医科大学第一临床学院骨科(长春，130021)
关键词：骨缺损；引导性骨再生；膜生物降解材料
中国修复重建外科杂志990515 【摘 要】 目的 采用生物降解可吸收材料聚己内酯(PCL)和聚乳酸(PLA)共聚膜修复长骨节段性骨缺损，探讨其引导性骨再生的效果及机制。方法 采用兔桡骨中段1.2 cm节段性骨缺损(保留骨膜)动物模型24只，平均分成两组，实验组用膜包绕骨缺损区，对照组缺损区不处置，分别于术后3、6及12周处死动物，进行X线片、大体及组织学观察。结果 实验组缺损区骨生长明显优于对照组，术后3周实验组可见明显的骨痂沿膜外生长；术后6周以桥接的外骨痂形成骨性连接；术后12周膜内外均形成骨性连接，对照组从术后6周开始表现为骨不连。结论 利用可生物降解的膜性材料可引导骨组织再生，通过膜外骨痂以及形成相对迟缓的膜内骨痂共同完成骨缺损的修复；膜性材料通过屏障作用一方面有效地阻挡纤维组织长入缺损区，防止骨不连形成，另一方面在局部形成营养物质浓聚，并通过表面的微孔为骨细胞生长充当支架，促进骨缺损愈合。
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GUIDED BONE REGENERATION BY USING BIODEGRADABLE CO-POLYMER MEMBRANES IN RABBITS
HUANG Lan-feng,LIU Jian-guo, XU Xin-xiang.
Department of Orthopedic Surgery, The First Clinical Hospital of Norman Bethun University of Medical Science.Changchun Jilin, P.R.China 130021.E-mail:ydyy@public.cc.jl.cn
【Abstract】 Objective To repair long bone segmental defects using biodegradable poly ε-caprolactone (PCL) and polylactic acid( PLA) co-polymer membranes, and explore its role and mechanism in guided bone regeneration (GBR).Methods Rabbit radial segmental defects (1.2cm in length, retain the periosteum) were created in this study, 24 animals were divided into 2 groups. The membranes were used to enclose the defects in experimental group, and no treatment in control group. After 3,6,and 12 weeks of operation, X-ray, gross and histological examinations were observed.Results The bone regeneration of experimental group was better than that of control group.Three weeks after operation, obvious external callus along the membrane were found in experimental group, and bony linking composed of external callus bridge were found in 6 weeks after operation. After 12 weeks of operation, callus bridge outside the membrane and bony reunion inside the membrane were achived in experimental group. While in control group, typical nonunion was observed after 6 weeks of operation.Conclusion Guided bone regeneration can be achieved by using biodegradable membrane. The defects are repaired by the means of outside membrane callus and relatively late inside membrane callus. The membrane can prevent the ingrowth of fibrous tissue into defect area, thus nonunion are avoid, and keep a high concentration of nutritive elements, also serve as a frame for osteocyte growth to enhance bone healing.
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【Key words】 Bone defect Guided bone regeneration Membrane biodegradable
material
Foundation item: Major National Programme of "Nation's 9th Five Year Project"(96-120-11)
引导性骨再生(guided bone regeneration, GBR)技术是一种膜干扰技术，大量的实验研究已经证实，利用膜性材料包绕骨缺损区域可以引导骨组织再生，有效地促进骨缺损的愈合，但其中的修复模式与机制尚有争论。生物降解可吸收材料作为体内暂时性植入物可以避免第二次手术的痛苦，是当前内植物研究的发展趋势。我们的实验将生物降解可吸收的膜性材料用于引导性骨再生技术中，修复兔桡骨节段性缺损，进一步探讨引导性骨再生的修复方式及机制。
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1 材料与方法
1.1 动物模型
成年日本大耳白兔24只，平均体重2.5 kg，雌雄不限。分成两组，每组12只。采用双侧桡骨中段长1.2 cm节段性骨缺损(保留骨膜)模型，双侧处理方法相同。实验组：用膜性材料包绕骨缺损远、近断端约3 mm，将膜用可吸收线缝合成管状。对照组：缺损区不作任何处置作为空白对照，然后逐层缝合。不用固定，在同一条件下单笼喂养。
1.2 膜性材料
由我院与中国科学院长春应用化学研究所共同研制的聚己内酯(poly ε-caprolactone,PCL)/聚乳酸(polylactic acid,PLA)共聚物，厚度为200 μm，环氧乙烷熏蒸消毒48小时。
1.3 观察指标
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分别于术后3、6及12周过量静脉麻醉处死动物，取双侧前臂进行观察。
1.3.1 X线片观察 摄双侧前臂侧位X线片，条件为50 kV、50 mA、0.1 s、1.0 m。用扫描仪将X线图像输入计算机，选取骨缺损局部2.0 cm×1.0 cm进行图像分析，利用OPTIMAS 6.1软件计算骨痂面积和骨痂的平均灰度，结果进行统计学处理。
1.3.2 大体观察 不同时间观察骨缺损局部炎性反应程度及骨痂形成情况。
1.3.3 组织学观察 以骨缺损为中心截取约2.5 cm组织块，在10%中性福尔马林溶液中固定48小时后，置于复方甲酸溶液中脱钙3天，沿纵轴冠状面切取桡骨中部厚约2 mm的骨质，酒精中逐级脱水，石蜡包埋，切片，HE染色后光镜下观察。
2 结果
, 百拇医药 2.1 X线观察
2.1.1 X线片表现 术后3周实验组骨断端略膨大，可见有明显的外骨痂生长，沿膜的表面形成条形的密度增高影，断端处内外骨痂之间可见一裂隙(图1a)；对照组断端有少量骨痂生长，尺侧有骨痂长入缺损区(图2a)。术后6周实验组断端膨大，外骨痂在骨缺损的上方形成连续的条形高密度影，缺损区密度增高，缺损减小(图1b)；对照组骨断端细小，与尺骨形成骨性连接，缺损区明显(图2b)。术后12周实验组膜内、外均见连续性高密度影，内、外骨痂之间可见条形低密度区，骨缺损桥接愈合(图1c)；对照组与6周时改善不明显，已形成骨不连(图2c)。
图1 术后不同时间实验组X线片
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a 3周 b 6周 c 12周
Fig. 1 X-ray of experimental group in different time of postoperation a 3 weeks b 6 weeks c 12 weeks
图2 术后不同时间对照组X线片
a 3周 b 6周 c 12周
Fig. 2 X-ray of control group in different time of postoperation
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a 3 weeks b 6 weeks c 12 weeks
2.1.2 X线图像分析 图像分析结果进行t检验，骨痂面积：术后3、6及12周实验组骨痂形成面积均明显优于对照组(P<0.05)，实验组术后6周与12周相比无明显差异(P>0.05)。骨痂灰度：术后3周实验组骨痂灰度优于对照组(P<0.05)，术后6周及12周对照组骨痂灰度均明显超过实验组(P<0.05)，结果见附表。
附表 X线图像分析-骨痂面积与骨痂灰度(
±s)Tab. X-ray image analysis of callus area and gray(
±s) 检测项目, http://www.100md.com
Detection item
组别
Groups
3周
3 weeks
6周
6 weeks
12周
12 weeks
骨痂面积(象素)
Callus area(dpi)
实验组
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Experimental group
3.61±0.36
7.60±0.46
7.58±0.38
对照组
Control group
2.93±0.17
3.75±0.21
3.99±0.19
骨痂灰度(灰阶)
Callus gray(gray scale)
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实验组
Experimental group
118.84±4.86
133.20±3.96
144.28±4.76
对照组
Control group
113.95±4.40
140.29±3.57
157.92±5.76
2.2 大体观察
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术后3周实验组骨缺损断端略膨大，骨痂从骨断端沿膜外生长，膜所在的空间形成狭窄的间隙。在膜内可见新骨从骨断端向缺损中心生长，膜内未见软组织；材料未见明显降解；对照组骨缺损区被大量的软组织充填，骨端有细小骨痂生长，无外骨痂形成。术后6周实验组桡骨增粗，外表已见不到骨缺损，沿膜生长的新骨形成骨性连接，膜的脆性增加，出现裂纹，不能完整取出，与周围组织无粘连。膜内骨断端尚未形成骨性连接，之间未见软组织；对照组骨断端呈锥形，与尺骨形成骨性连接，断端之间夹有软组织。术后12周实验组连续性的桥接外骨痂质地变硬。膜已降解成1.0 mm×1.0 mm×1.0 mm左右的颗粒状。膜内骨断端已形成骨性连接；在内、外骨痂之间形成环形腔隙；对照组断端封闭，缺损区见大量软组织，形成典型的骨不连。
2.3 组织学观察
实验组膜材料在制片中脱落，表现为空白裂隙。术后3周实验组见新骨从两端沿膜生长并将膜包在其中，膜内新骨相对少于膜外，骨缺损区中央未见纤维细胞成分；对照组未见外骨痂形成，断端见有少量新骨形成，缺损中央有大量的纤维组织包绕骨断端。术后6周实验组膜外形成连续的网状骨痂，膜内新骨生长仍落后于膜外，骨痂形成已超过缺损区的1/2。对照组骨缺损的断端被致密的结缔组织封闭。术后12周实验组膜外及膜内均形成骨性连接，膜内骨痂少于膜外，可见不成熟的骨小梁，内、外骨痂之间未见融合，空白裂隙明显(图3)；对照组断端纤细，皮质骨将髓腔封闭，形成骨不连。实验组在术后各个阶段均未见大量炎性细胞的聚集。
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图3 实验组术后12周缺损区组织学检查(HE×4)
Fig. 3 Histological section of bone defect area in experimental group at 12 weeks after operation (HE×4)
3 讨论
3.1 引导性骨再生的现象
80年代初引导组织再生(guided tissue regeneration,GTR)技术首先在修复牙周组织缺损中使用，以后大量的研究证实了利用膜性材料的屏障作用可以引导组织再生，证明了它可以修复牙周组织以及扁平骨缺损[1]。Nielsen等[2] 利用可吸收的聚氨基甲酸乙酯膜修复兔桡骨中段1.0 cm节段性骨缺损，术后5周时发现在膜的外表面形成了一层连续的骨痂，使骨缺损坚固地愈合，而在膜内形成的新骨很少。我们的实验采用1.2 cm骨缺损模型，应用可降解吸收的PCL/PLA共聚膜，术后6周膜外有连续性的外骨痂形成，使骨缺损桥接；12周时通过外骨痂及形成相对迟缓的内骨痂使骨缺损愈合。结果表明：膜性材料在引导性骨再生中可以明显的促进膜外及膜内骨痂的形成。与Nielsen的结果不完全一致。尽管膜内骨痂的形成相对滞后，但也是引导性骨再生的关键。张子军等[3]利用硅胶膜修复兔桡骨1.0 cm节段性骨缺损，发现新骨形成均在膜内进行，考虑由于缺损区骨膜处理方法的不同，而导致膜外骨痂形成的不同。倪斌等[4] 利用壳多糖修复0.8 cm兔桡骨节段性缺损，6周时在膜外见到特殊的、薄层且连续性较好的外骨痂，形成较清晰的骨痂桥，骨断端有相对少量骨痂生长，与我们的实验结果类似。因此，我们认为引导性骨再生对膜内和膜外骨痂形成均有引导和促进作用。
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3.2 引导性骨再生中骨缺损愈合机制探讨
3.2.1 原始骨痂的形成 骨缺损愈合与骨折愈合过程的区别主要在于原始骨痂形成期，也是骨愈合最关键的时期。我们的实验观察表明，原始骨痂的形成在整个愈合过程中占有重要地位。X线图像分析骨痂面积结果显示实验组骨痂面积在各个阶段均优于对照组。骨愈合首先表现为原始骨痂形成，然后在足够量原始骨痂的基础上进行矿化、钙盐沉积。X线上表现出骨痂灰度升高。术后3周两组均处于原始骨痂形成期，实验组骨痂灰度高于对照组，术后6周对照组骨痂灰度增加较快，说明对照组此时已基本结束了原始骨痂的形成，开始加速局部的矿化、钙盐沉积，但由于骨痂面积较小，在骨性连接以前使断端钙化、封闭，组织学显示术后12周断端已被皮质骨封闭；形成骨不连，而实验组术后6周及12周表现为骨缺损区密度普遍增高，平均骨痂灰度低于对照组，X线表现无骨不连趋势，说明与对照组相比仍有原始骨痂形成，以达到缺损区的骨性连接。实验证明膜性材料对骨缺损愈合过程中原始骨痂的形成有明显促进作用，进一步证实了引导性骨再生在修复节段性骨缺损中的作用。由于膜外血运及间充质细胞来源丰富，膜的屏障作用可能也限制了血管及有成骨作用的细胞和生长因子进入缺损区，这可能是膜内骨痂形成相对迟缓的原因之一。
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3.2.2 引导性骨再生中的膜外及膜内骨痂 我们的实验组中大量外骨痂的形成是由于膜性材料促进了外骨膜的成骨作用。由于未去除缺损区外骨膜，故有成骨作用的骨膜生发层细胞在外骨痂形成的过程中起了重要作用，而膜性材料则起细胞支架作用，使细胞可以沿着表面具有微孔的膜性材料向前爬行，微孔有利于细胞的粘附；对照组由于缺乏细胞支架作用，使生发层细胞的成骨活性无方向性，只能形成局部有限的骨膜反应。张浩等[5]在去除外骨膜的引导性骨再生实验中，在膜外见到少量骨痂，认为与外骨膜无关。Pineda等[6]采用三种不同孔径的膜进行相同的实验，证明膜对局部营养物质有浓聚作用。张子军等[3]采用免疫组织化学染色见膜内BMP染色阳性，认为是由于膜的屏蔽及收集作用使膜内BMP浓度增高并均匀分布，促进膜内新骨形成。我们的实验将生物降解可吸收膜在骨缺损局部缝制成管形，虽然不是完全封闭的空间，但在一定程度上阻碍了BMP等活性物质扩散，使局部生长因子等物质浓聚，促进膜内骨痂形成，其中也有材料对膜内细胞生长的依附作用，以上可能是膜引导再生最基本的作用。
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3.3 生物降解可吸收材料
PCL/PLA是通过共聚的方式调节PCL和PLA组分的含量，进而控制聚合物的降解速度以满足实际应用的要求[7]。组织学及大体观察结果显示材料具有良好的生物相容性和降解性，在我们的实验中，术后12周未吸收的材料在局部阻碍内、外骨痂融合，对骨缺损愈合后的骨改建产生不利影响，所以尚需进一步改进工艺，调控材料在骨愈合后的吸收速度和过程，同时可以设想结合一些促进骨愈合的细胞或生长因子制成组织工程人工骨。
基金项目：国家计划委员会“九五”重点科技攻关资助项目(96-120-11)
参考文献
1 郭现辉，郭洪刚，刘建丰.膜引导组织再生技术在骨缺损治疗中的应用.中国修复重建外科杂志，1998；12(5)：301
, 百拇医药 2 Nielsen FF, Karring T, Gogolewski S. Biodegradable guided for bone regeneration, polyuerthane membrane tested in rabbit radius defects. Acta Orthop Scand, 1992;63：66
3 张子军，卢世璧，王继芳.引导性骨再生的初步研究.中华实验外科杂志，1995；12：59
4 倪 斌，戈俊国，侯春林，等.壳多糖膜管修复兔桡骨缺损的实验研究.解放军医学杂志，1995；20：171
5 张 浩，卢世璧，王继芳.去除外骨膜对引导性骨再生模型成骨过程的影响.中华外科杂志，1998；36：278
6 Pineda LM, Busing M, Meinig RP, et al. Bone regeneration with resorbable polymeric membranes. Effect of poly(L-lactide) membrane pore size on the healing process in large defects. Journal of Biomedical Materials Research, 1996;31：385
7 崔秀敏.医用合成可降解生物材料的新进展.国外医学 生物医学工程分册，1995；18：324
(收稿：1998-12-14 修回：1999-06-03), 百拇医药