人类白细胞抗原-DQβ链第57位非门冬氨酸与华南地区汉族人胰岛素依赖型糖尿病的易感性
作者：张少玲 程桦 傅祖植 钟光恕 严棠
单位：510120 广州，中山医科大学孙逸仙纪念医院内分泌科
关键词：
中华内科杂志/980219 人类白细胞抗原(HLA)复合体是迄今发现的与胰岛素依赖型糖尿病(IDDM)遗传易感性关联最强的基因位点。已明确世界多数民族IDDM易感性与HLA-DQβ链第57位非门冬氨酸(NA)呈正相关，与HLA-DQβ链第57位门冬氨酸(A)呈负相关。这一关联状态同样在华北和华东地区汉族人中得到证实。但是已往研究称华南地区IDDM易感性与NA无关联，是否该地区IDDM病人HLA相关的遗传背景确实有别于其他地区，值得进一步研究。我们采用一步法序列特异性聚合酶链反应(ssPCR)技术，即根据Taq酶缺乏3′→5′外切酶活性，引物与DNA模板3′端碱基不互补时使Taq酶延伸受阻的原理，在较大组的病人中探讨NA与华南地区汉族人IDDM易感性的关系。
, http://www.100md.com
一、材料与方法
1.研究对象：IDDM病人69例(男35例，女34例)，平均起病年龄24.8岁。IDDM诊断依据1985年WHO标准。健康对照组47例(男25例，女22例)，年龄匹配。两组均系无亲缘关系的华南籍(广东、广西讲粤语地区的)汉族人。
2.实验方法：(1)取静脉血3 ml，肝素或ACD-SolB溶液抗凝，酚/氯仿法提取基因组DNA。(2)ssPCR：引物(表1)按参考文献[1]设计，根据标本与表2所列哪对引物对扩增成功，来确定其DQβ链57位密码子类型。等位基因命名和序列按1991年WHO方案[2]。PCR采用25 μl体积，含100～300 ng DNA模板，1.5 U Taq酶，0.1～0.4 μmol/L引物，200μmol/L dNTP，1.5 mmol/L Mg2+。循环条件：94℃预变性3分钟后，94℃变性30秒，57℃或59℃退火30秒，72℃延伸45秒，共35个循环，最后置72℃延伸7分钟，再冷却至4℃终止反应。取扩增产物10～15 μl加载样缓冲液2 μl，在1.5%的普通琼脂糖凝胶(含0.3 μg/ml的溴化乙锭)上电泳(50～100 V)30～45分钟，紫外检测仪观察结果。
, 百拇医药
表1 引物的序列 引物
序列(5′～3′)
长度
(mer)
Tm
(℃)
位置
(aa)
DB130
AGGGATCCCCGCAGAGGATTTCGTGTACC
29
92
, http://www.100md.com
-1～10
PSAsp
TTCCTTCTGGCTGTTCCAGTACTCGGCCT
29
90
57～66
PNAsp1
TCCTTCTGGCTGTTCCAGTACTCGCCGG
28
90
57～66
PNAsp2
, 百拇医药
TCCTTCTGGCTGTTCCAGTACTCGGAAA
28
84
57～66
PNAsp3
TCCTTCTGGCTGTTCCAGTACTCGGAGC
28
88
57～66
LING
CACCAACGGGACAGAGCGCGTGCGTCT
, 百拇医药
27
90
17～26
注：有下划线的碱基为人为错配；Tm=4×(G+C)+2×(A+T) 表2 各引物对及其对应的等位基因和产物大小 引物对
上游引物
下游引物
产物(bp)
所扩增的等位基因
DQβ链57位氨基酸种类
外对照
DQB-PL
, http://www.100md.com
DQB-PR
271
所有DQB1基因的第二外显子
所有类型
A
DB130
PSAsp
199
DQB1*0301，0303，0401，0402，0503，0601，0602，0603
门冬氨酸
(GAC，GAT)
NA1
, 百拇医药
LING
PNAsp1
147
DQB1*0201，0302
丙氨酸(GCC)
NA2
DB130
PNAsp2
199
DQB1*0501，0604，0605
缬氨酸(GTT)
NA3
, http://www.100md.com
DB130
PNAsp3
199
DQB1*0502，0504
丝氨酸(AGC)
3.统计学处理：χ2检验，计算相对危险度(RR)及95%可信区间(CI)。
二、结果
HLA-DQβ链第57位基因类型NA、A在IDDM组中分别为89个(64.5%)和49个(35.5%)，在对照组中分别为38个(40.4%)和56个(59.6%)，分布差异有显著性(NA的RR=2.68；CI：0.90～3.63；P<0.01)。表现型NA/NA、NA/A、A/A在IDDM组中分别为33例(47.8%)、23例(33.3%)、13例(18.8%)，在对照组中分别为15例(31.9%)、8例(17.0%)及24例(51.1%)，分布差异有显著性(P<0.01)。其中NA/NA、NA/A均在IDDM组中的分布呈增高的趋势，但未达到统计学意义；A/A在对照组中的分布明显升高(RR=0.22，P<0.01)。
, 百拇医药
讨论 Penny等[3]对48例香港IDDM病人和高茜等[4]对20例广东籍IDDM病人的研究均指出，NA与IDDM的易感性无关联。本组资料为国内同类研究中IDDM病人样本量较大的一组，显示与对照组比较，IDDM组的NA频率升高，A频率降低。表现型NA/NA和NA/A在IDDM组中有增高的趋势，而对照组A/A表现型较IDDM组高。本组资料与华北地区的天津、北京，华东地区的上海及台湾的报道结论一致，表明NA与IDDM易感性呈正相关，A与IDDM易感性呈负相关。综合不同国家和地区、不同民族的研究结果表明，NA与IDDM的关联状态在人类可能是一种较普遍的情况。结合其他有关中国人的研究，NA/NA在IDDM组中的频率比白种人低，本组仅为47.8%，而芬兰人75%，意大利人70%，英国高加索人93%，希腊人82%，也即中国人IDDM中有相当一部分为A/A(本组是18.8%)和NA/A(本组是33.3%)，对照组中NA/NA亦达31.9%，说明中国汉族人NA与IDDM易感性的关联强度不如白种人，显然这种差异可能是由于NA以外的遗传因素或环境因素的作用不同所致。各民族中均有IDDM病人并不携带NA，最为突出的是，日本人群中高达71%的IDDM病人为A/A纯合子。另一方面，NA在中国人群中的频率相对较低，也可能是中国人IDDM发病率低的原因之一。因此，NA作为中国人IDDM的遗传学预测指标，其可靠性不如欧美白种人。
, 百拇医药
本课题受1995年广东省科委重点攻关项目基金资助
参考文献
1 Patel P, Lo YM, Bell JI, et al. Rapid HLA typing by multiplex amplification refractory mutation system. J Clin Pathol, 1993,46：1105-1108.
2 Marsh SG, Bodmer JG. HLA class Ⅱ nucleotide sequences, 1991. Immunogenetics, 1991,33：321-324.
3 Penny MA, Jenkins D, Mijovic CH, et al. Susceptibility to IDDM in a Chinese population. Role of HLA class Ⅱ alleles. Diabetes, 1992,41：914-919.
4 高茜，王昌才，徐钤.广东地区胰岛素依赖型糖尿病人免疫遗传易感性研究.第一军医大学学报，1995，15：15-18.
(收稿：1996-07-22 修回：1997-03-20), 百拇医药
单位：510120 广州，中山医科大学孙逸仙纪念医院内分泌科
关键词：
中华内科杂志/980219 人类白细胞抗原(HLA)复合体是迄今发现的与胰岛素依赖型糖尿病(IDDM)遗传易感性关联最强的基因位点。已明确世界多数民族IDDM易感性与HLA-DQβ链第57位非门冬氨酸(NA)呈正相关，与HLA-DQβ链第57位门冬氨酸(A)呈负相关。这一关联状态同样在华北和华东地区汉族人中得到证实。但是已往研究称华南地区IDDM易感性与NA无关联，是否该地区IDDM病人HLA相关的遗传背景确实有别于其他地区，值得进一步研究。我们采用一步法序列特异性聚合酶链反应(ssPCR)技术，即根据Taq酶缺乏3′→5′外切酶活性，引物与DNA模板3′端碱基不互补时使Taq酶延伸受阻的原理，在较大组的病人中探讨NA与华南地区汉族人IDDM易感性的关系。
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一、材料与方法
1.研究对象：IDDM病人69例(男35例，女34例)，平均起病年龄24.8岁。IDDM诊断依据1985年WHO标准。健康对照组47例(男25例，女22例)，年龄匹配。两组均系无亲缘关系的华南籍(广东、广西讲粤语地区的)汉族人。
2.实验方法：(1)取静脉血3 ml，肝素或ACD-SolB溶液抗凝，酚/氯仿法提取基因组DNA。(2)ssPCR：引物(表1)按参考文献[1]设计，根据标本与表2所列哪对引物对扩增成功，来确定其DQβ链57位密码子类型。等位基因命名和序列按1991年WHO方案[2]。PCR采用25 μl体积，含100～300 ng DNA模板，1.5 U Taq酶，0.1～0.4 μmol/L引物，200μmol/L dNTP，1.5 mmol/L Mg2+。循环条件：94℃预变性3分钟后，94℃变性30秒，57℃或59℃退火30秒，72℃延伸45秒，共35个循环，最后置72℃延伸7分钟，再冷却至4℃终止反应。取扩增产物10～15 μl加载样缓冲液2 μl，在1.5%的普通琼脂糖凝胶(含0.3 μg/ml的溴化乙锭)上电泳(50～100 V)30～45分钟，紫外检测仪观察结果。
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表1 引物的序列 引物
序列(5′～3′)
长度
(mer)
Tm
(℃)
位置
(aa)
DB130
AGGGATCCCCGCAGAGGATTTCGTGTACC
29
92
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-1～10
PSAsp
TTCCTTCTGGCTGTTCCAGTACTCGGCCT
29
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PNAsp1
TCCTTCTGGCTGTTCCAGTACTCGCCGG
28
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PNAsp2
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TCCTTCTGGCTGTTCCAGTACTCGGAAA
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PNAsp3
TCCTTCTGGCTGTTCCAGTACTCGGAGC
28
88
57～66
LING
CACCAACGGGACAGAGCGCGTGCGTCT
, 百拇医药
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90
17～26
注：有下划线的碱基为人为错配；Tm=4×(G+C)+2×(A+T) 表2 各引物对及其对应的等位基因和产物大小 引物对
上游引物
下游引物
产物(bp)
所扩增的等位基因
DQβ链57位氨基酸种类
外对照
DQB-PL
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DQB-PR
271
所有DQB1基因的第二外显子
所有类型
A
DB130
PSAsp
199
DQB1*0301，0303，0401，0402，0503，0601，0602，0603
门冬氨酸
(GAC，GAT)
NA1
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LING
PNAsp1
147
DQB1*0201，0302
丙氨酸(GCC)
NA2
DB130
PNAsp2
199
DQB1*0501，0604，0605
缬氨酸(GTT)
NA3
, http://www.100md.com
DB130
PNAsp3
199
DQB1*0502，0504
丝氨酸(AGC)
3.统计学处理：χ2检验，计算相对危险度(RR)及95%可信区间(CI)。
二、结果
HLA-DQβ链第57位基因类型NA、A在IDDM组中分别为89个(64.5%)和49个(35.5%)，在对照组中分别为38个(40.4%)和56个(59.6%)，分布差异有显著性(NA的RR=2.68；CI：0.90～3.63；P<0.01)。表现型NA/NA、NA/A、A/A在IDDM组中分别为33例(47.8%)、23例(33.3%)、13例(18.8%)，在对照组中分别为15例(31.9%)、8例(17.0%)及24例(51.1%)，分布差异有显著性(P<0.01)。其中NA/NA、NA/A均在IDDM组中的分布呈增高的趋势，但未达到统计学意义；A/A在对照组中的分布明显升高(RR=0.22，P<0.01)。
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讨论 Penny等[3]对48例香港IDDM病人和高茜等[4]对20例广东籍IDDM病人的研究均指出，NA与IDDM的易感性无关联。本组资料为国内同类研究中IDDM病人样本量较大的一组，显示与对照组比较，IDDM组的NA频率升高，A频率降低。表现型NA/NA和NA/A在IDDM组中有增高的趋势，而对照组A/A表现型较IDDM组高。本组资料与华北地区的天津、北京，华东地区的上海及台湾的报道结论一致，表明NA与IDDM易感性呈正相关，A与IDDM易感性呈负相关。综合不同国家和地区、不同民族的研究结果表明，NA与IDDM的关联状态在人类可能是一种较普遍的情况。结合其他有关中国人的研究，NA/NA在IDDM组中的频率比白种人低，本组仅为47.8%，而芬兰人75%，意大利人70%，英国高加索人93%，希腊人82%，也即中国人IDDM中有相当一部分为A/A(本组是18.8%)和NA/A(本组是33.3%)，对照组中NA/NA亦达31.9%，说明中国汉族人NA与IDDM易感性的关联强度不如白种人，显然这种差异可能是由于NA以外的遗传因素或环境因素的作用不同所致。各民族中均有IDDM病人并不携带NA，最为突出的是，日本人群中高达71%的IDDM病人为A/A纯合子。另一方面，NA在中国人群中的频率相对较低，也可能是中国人IDDM发病率低的原因之一。因此，NA作为中国人IDDM的遗传学预测指标，其可靠性不如欧美白种人。
, 百拇医药
本课题受1995年广东省科委重点攻关项目基金资助
参考文献
1 Patel P, Lo YM, Bell JI, et al. Rapid HLA typing by multiplex amplification refractory mutation system. J Clin Pathol, 1993,46：1105-1108.
2 Marsh SG, Bodmer JG. HLA class Ⅱ nucleotide sequences, 1991. Immunogenetics, 1991,33：321-324.
3 Penny MA, Jenkins D, Mijovic CH, et al. Susceptibility to IDDM in a Chinese population. Role of HLA class Ⅱ alleles. Diabetes, 1992,41：914-919.
4 高茜，王昌才，徐钤.广东地区胰岛素依赖型糖尿病人免疫遗传易感性研究.第一军医大学学报，1995，15：15-18.
(收稿：1996-07-22 修回：1997-03-20), 百拇医药