重组人造血生长因子对抗白血病药物作用的影响
作者：张晓晖 王椿 乔振华 左连富
单位：030001 太原，山西医科大学第二医院血液内科(张晓晖、王椿、乔振华)；石家庄，河北省肿瘤研究所(左连富)
关键词：
中华内科杂志980522 在急性白血病治疗中，耐药细胞的出现使治疗陷入困境，这是临床治疗白血病所面临的一个棘手问题。如何克服急性白血病化疗对药物不敏感，寻找克服耐药的有效手段，是当前治疗急性白血病的当务之急。
一、资料与方法
1.病例：根据FAB协作组确诊的急性髓细胞性白血病(AML)23例，其中初治者21例，复发者2例；年龄16～71岁(中位年龄37岁)，男10例，女13例。FAB分型：M15例，M24例，M36例，M45例，M53例；对照组为正常人11例。
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2.方法：培养体系及对碘硝基四唑盐(INT)药敏检测，粒-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)，粒细胞集落刺激因子(G-CSF)均为100 mg/L，白细胞介素-3(IL-3)20 mg/L，VP16 40mg/L，三尖杉酯碱(H)1mg/L，柔红霉素(DNR)25 mg/L，单个核细胞制备后，将单个核细胞悬液加入96孔平底培养板中，100 μl/孔，每组做4个平行孔，按设计分组分别加入不同的药物。造血生长因子(HGF)，等量的1640及含20%的胎牛血清培养液，5%CO2，37℃培养48小时后，加40 μl的INT溶液(1g/L)，继续孵育12小时，加入1 mol/L的盐酸20 μl，用DG 3022型酶联免疫检测仪，检测在490 nm波长的吸光度A值，4孔取平均值计算细胞毒性指数(CI)。用FACS 420型流式细胞仪随机对23例AML病人中的8例进行细胞检测，AML细胞分别与培养基G-CSF、GM-CSF、IL-3共同孵育(5%CO2，37℃，48小时培养)，分析其DNA含量，增殖细胞核抗原(PCNA)和转铁蛋白受体(TFR或CD71)[1，2]。统计处理采用两因素方差分析。
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二、结果
在GM-CSF，IL-3分别作用下，DNR对AML细胞的杀伤率由27.32%±4.98%增至47.21%±3.69%；49.77%±6.21%(P值均<0.05)；GM-CSF或IL-3的作用下，VP16对AML细胞的杀伤率从20.86%±4.49%增加到38.32%±4.84%(P<0.05)和43.62%±4.97%(P<0.01)，不同AML病例之间对H的敏感性差异明显。在GM-CSF的作用下，VP16对H的细胞毒由20.68%±5.41%增至50.87%±6.20%(P<0.01)，在G-CSF、GM-CSF、IL-3分别作用下，DNR、H、VP16等3种化疗药物均不能增加对11例正常骨髓的细胞毒性。在G-CSF、GM-CSF或IL-3的作用下，白血病细胞在S期百分率显著增高，G0/G1期的百分率显著下降；同样，在细胞因子的分别作用下，TFR、PCNA的阳性率明显升高。
讨论 近年来大量实验表明，造血生长因子(HGF)能够在体外促进AML细胞的增殖和分化，使静止期的AML细胞进入细胞周期，我们同时研究了上述3种重组人造血生长因子(rhHGFs)对AML细胞动力学及对PCNA和CD71表达的影响。PCNA是一种DNA多聚酶的辅助蛋白[3]，与细胞周期相关，它能提高增殖细胞在G1期和S期的比率[4]。TFR表达率的增加促进AML细胞从晚G1到早S期的增殖，表明其与DNA的合成有密切关联。转铁蛋白(TF)与TFR之间的相互作用在细胞生长和代谢中起关键性的作用。采用INT法，根据对碘硝基四唑盐(INT)在活细胞线粒体内，经脱氢酶的作用下转化成一定波长下可检测的甲结晶。这一过程反映了细胞的呼吸能力，而甲的形成量可间接反映活细胞的数量和总体细胞增殖能力。该方法准确、简便，时间短，可以指导临床用药。本组研究结果显示3种rhHGFs分别增加了AML细胞的S期比率，PCNA阳性率和TFR阳性率。可能是由于化疗药物靶细胞数目的增加，所以提高上述药物对AML细胞的杀伤。同时实验发现3种细胞因子的作用均有很大的异质性，不仅表现在患者之间，而且表现在相同病人的不同因子之间，可能由于AML细胞的HGF受体的差异[5]，继而导致AML细胞对HGF反应的程度不同。rhHGFs加上述化疗药物对正常骨髓细胞杀伤作用无明显影响，这可能在治疗AML中更具有重要意义。因为，对AML细胞选择性杀伤不会使骨髓抑制期延长，从而产生较好的疗效。应用HGF增加上述化疗药物对AML细胞的敏感性，克服其细胞动力学耐药，有望提高AML缓解率延长生存期，具有令人鼓舞的广阔前景。
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本课题受山西省自然科学基金资助
参考文献
1 Landberg G, Tan EM, Roos G, et al. Flow cytometric multiparameter analysis of proliferating cell nuclear antigen/cyclin and Ki-67 antigen: a new view of the cell cycle. Exp Cell Res, 1990, 187: 111-118.
2 Takahashi S, Esserman L, Levy R. An epitope on the transferrin receptor preferentially exposed during tumor progression in human lymphoma is close to the ligand binding site. Blood, 1991, 77: 826-832.
, 百拇医药
3 Bravo R, Frank R, Blundell PA, et al. Cyclin/PCNA is the auxiliary protein of DNA polymerase-delta. Nature, 1987, 326: 515-517.
4 Takasaki Y, Deng JS, Tan EM. A nuclear antigen associated with cell proliferation and blast transformation. J Exp Med, 1981, 154: 1899-1909.
5 Konbo S. Human granulocyte colony-stimulating factor receptors in Acute myelogenous leukemia. Eur J Haematol, 1991, 46: 223.
(收稿：1997-08-11 修回：1997-11-26), http://www.100md.com
单位：030001 太原，山西医科大学第二医院血液内科(张晓晖、王椿、乔振华)；石家庄，河北省肿瘤研究所(左连富)
关键词：
中华内科杂志980522 在急性白血病治疗中，耐药细胞的出现使治疗陷入困境，这是临床治疗白血病所面临的一个棘手问题。如何克服急性白血病化疗对药物不敏感，寻找克服耐药的有效手段，是当前治疗急性白血病的当务之急。
一、资料与方法
1.病例：根据FAB协作组确诊的急性髓细胞性白血病(AML)23例，其中初治者21例，复发者2例；年龄16～71岁(中位年龄37岁)，男10例，女13例。FAB分型：M15例，M24例，M36例，M45例，M53例；对照组为正常人11例。
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2.方法：培养体系及对碘硝基四唑盐(INT)药敏检测，粒-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)，粒细胞集落刺激因子(G-CSF)均为100 mg/L，白细胞介素-3(IL-3)20 mg/L，VP16 40mg/L，三尖杉酯碱(H)1mg/L，柔红霉素(DNR)25 mg/L，单个核细胞制备后，将单个核细胞悬液加入96孔平底培养板中，100 μl/孔，每组做4个平行孔，按设计分组分别加入不同的药物。造血生长因子(HGF)，等量的1640及含20%的胎牛血清培养液，5%CO2，37℃培养48小时后，加40 μl的INT溶液(1g/L)，继续孵育12小时，加入1 mol/L的盐酸20 μl，用DG 3022型酶联免疫检测仪，检测在490 nm波长的吸光度A值，4孔取平均值计算细胞毒性指数(CI)。用FACS 420型流式细胞仪随机对23例AML病人中的8例进行细胞检测，AML细胞分别与培养基G-CSF、GM-CSF、IL-3共同孵育(5%CO2，37℃，48小时培养)，分析其DNA含量，增殖细胞核抗原(PCNA)和转铁蛋白受体(TFR或CD71)[1，2]。统计处理采用两因素方差分析。
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二、结果
在GM-CSF，IL-3分别作用下，DNR对AML细胞的杀伤率由27.32%±4.98%增至47.21%±3.69%；49.77%±6.21%(P值均<0.05)；GM-CSF或IL-3的作用下，VP16对AML细胞的杀伤率从20.86%±4.49%增加到38.32%±4.84%(P<0.05)和43.62%±4.97%(P<0.01)，不同AML病例之间对H的敏感性差异明显。在GM-CSF的作用下，VP16对H的细胞毒由20.68%±5.41%增至50.87%±6.20%(P<0.01)，在G-CSF、GM-CSF、IL-3分别作用下，DNR、H、VP16等3种化疗药物均不能增加对11例正常骨髓的细胞毒性。在G-CSF、GM-CSF或IL-3的作用下，白血病细胞在S期百分率显著增高，G0/G1期的百分率显著下降；同样，在细胞因子的分别作用下，TFR、PCNA的阳性率明显升高。
讨论 近年来大量实验表明，造血生长因子(HGF)能够在体外促进AML细胞的增殖和分化，使静止期的AML细胞进入细胞周期，我们同时研究了上述3种重组人造血生长因子(rhHGFs)对AML细胞动力学及对PCNA和CD71表达的影响。PCNA是一种DNA多聚酶的辅助蛋白[3]，与细胞周期相关，它能提高增殖细胞在G1期和S期的比率[4]。TFR表达率的增加促进AML细胞从晚G1到早S期的增殖，表明其与DNA的合成有密切关联。转铁蛋白(TF)与TFR之间的相互作用在细胞生长和代谢中起关键性的作用。采用INT法，根据对碘硝基四唑盐(INT)在活细胞线粒体内，经脱氢酶的作用下转化成一定波长下可检测的甲结晶。这一过程反映了细胞的呼吸能力，而甲的形成量可间接反映活细胞的数量和总体细胞增殖能力。该方法准确、简便，时间短，可以指导临床用药。本组研究结果显示3种rhHGFs分别增加了AML细胞的S期比率，PCNA阳性率和TFR阳性率。可能是由于化疗药物靶细胞数目的增加，所以提高上述药物对AML细胞的杀伤。同时实验发现3种细胞因子的作用均有很大的异质性，不仅表现在患者之间，而且表现在相同病人的不同因子之间，可能由于AML细胞的HGF受体的差异[5]，继而导致AML细胞对HGF反应的程度不同。rhHGFs加上述化疗药物对正常骨髓细胞杀伤作用无明显影响，这可能在治疗AML中更具有重要意义。因为，对AML细胞选择性杀伤不会使骨髓抑制期延长，从而产生较好的疗效。应用HGF增加上述化疗药物对AML细胞的敏感性，克服其细胞动力学耐药，有望提高AML缓解率延长生存期，具有令人鼓舞的广阔前景。
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本课题受山西省自然科学基金资助
参考文献
1 Landberg G, Tan EM, Roos G, et al. Flow cytometric multiparameter analysis of proliferating cell nuclear antigen/cyclin and Ki-67 antigen: a new view of the cell cycle. Exp Cell Res, 1990, 187: 111-118.
2 Takahashi S, Esserman L, Levy R. An epitope on the transferrin receptor preferentially exposed during tumor progression in human lymphoma is close to the ligand binding site. Blood, 1991, 77: 826-832.
, 百拇医药
3 Bravo R, Frank R, Blundell PA, et al. Cyclin/PCNA is the auxiliary protein of DNA polymerase-delta. Nature, 1987, 326: 515-517.
4 Takasaki Y, Deng JS, Tan EM. A nuclear antigen associated with cell proliferation and blast transformation. J Exp Med, 1981, 154: 1899-1909.
5 Konbo S. Human granulocyte colony-stimulating factor receptors in Acute myelogenous leukemia. Eur J Haematol, 1991, 46: 223.
(收稿：1997-08-11 修回：1997-11-26), http://www.100md.com