多部位出血伴血小板聚集缺陷患者血小板纤维蛋白原的研究
作者：杨林花 沈迪 张玉金 王爱莲 魏文宁 刘仲萍 杨锐 杨焰
单位：030001 太原，山西医科大学第二医院血液科(杨林花)；同济医科大学附属协和医院(沈迪、张玉金、王爱莲、魏文宁、刘仲萍、杨锐、杨焰)
关键词：
中华内科杂志980613 多部位出血伴血小板聚集缺陷，特征为临床轻重不等的皮肤黏膜出血和(或)月经过多，血小板计数和凝血象正常；血小板形态无异常。血小板对二磷酸腺苷(ADP)、血小板活化因子(PAF)、胶原和肾上腺素等诱导的聚集反应出现不等程度的缺陷。我们对这些患者的血小板纤维蛋白原作了初步研究，现报道如下。
一、资料与方法
1.病例：选择未明原因有2个部位出血患者8例，男2例，女6例，年龄19～60岁(平均38.5岁)。每例患者至少有2种诱聚剂反应缺陷，复查仍异常者列为研究对象。正常对照者9例均为实验室工作人员。
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2.血小板预处理和标记：取新鲜离心血小板，经无钙Tyrode液洗涤2次，悬浮于Tyrode液。实验管标本加终浓度10 μmol/L ADP(Chrono-Log公司)，室温下作用10分钟；对照管加生理盐水，各管均按时加2%多聚甲醛固定30分钟。最终用TES悬浮血小板，调整至(1～2)×107/ml。取固定后血小板悬液10 μl，加一硫氰酸荧光素(FITC)标记的兔抗人纤维蛋白原多克隆抗体(Dake公司)10 μl，避光作用30分钟，以TES补至终体积1 ml，冰浴。
3.流式细胞仪检测：所有样品均用FACS 420流式细胞仪(BD公司)检测，光源2 W氩离子激光，激发波长488 nm，每个样品测10 000个血小板，数据由微机处理。
4.免疫印迹试验：血小板纤维蛋白原采用5%～15%梯度胶测定；血小板蛋白质为还原样品，抗纤维蛋白原单克隆抗体SZ-65(购自苏州医学院)。
, 百拇医药
二、结果
1.血小板表面纤维蛋白原结合位点：应用流式细胞技术检测结果：患者血小板表面的百分(F 111)标记率(%，Tot)在ADP活化组与正常对照组对比，相应为73.18±4.90与69.48±6.27；其荧光道数(mode)相应为65.25±5.78与66.67±6.88，其间均无明显的统计学差异(P>0.05)。
2.免疫印迹试验结果：血小板蛋白质全谱经SDS-PAGE技术，Coomasie亮蓝染色可显示40多条蛋白条带；然与特异性抗纤维蛋白原单抗杂交，再与辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗鼠IgG二抗反应后，结果在8例患者所显示的特异性条带与正常对照者相比，发现部分患者血小板蛋白质在97 000～100 000之间有异常纤维蛋白原条带，提示患者血小板纤维蛋白原在质与量方面有异常表达。
讨论 多部位出血和血小板聚集缺陷是客观存在的临床症状和实验室指征。由于我们对该病的了解不多，认识不一，至今仍缺乏明确诊断。Lages和Weiss[1]曾报道1例自幼即有多部位出血伴低浓度诱聚剂反应缺陷者，本组诱聚剂均为常规浓度的反应缺陷，且其缺陷程度并不一致，故有所区别。我们鉴于患者反复出血的临床症状，试用益气祛瘀药治疗[2]，结果可获得止血和恢复血小板聚集的效果；提示本病的出血和聚集缺陷是可以治疗的，推测并非先天性疾病。我们采用流式细胞技术检测患者血小板纤维蛋白原及膜糖蛋白Ⅱb/Ⅲa、Ⅱb及Ⅲa[3]，其荧光表达均未见差异，而免疫印迹技术则见血小板纤维蛋白原有质和(或)量的异常，可能与本病的出血及聚集缺陷有关，有待研究。
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本课题为国家自然科学基金资助项目(No.39370322)
参考文献
1 Lages B, Weiss HJ. Heterogeneous defects of platelet secretion and responses to weak agonists in patients with bleeding disorders. Br J Haematol, 1988,68：53-62.
2 沈迪，沈霖，王爱莲，等.消瘀止血片治疗未明原因多部位出血伴血小板聚集缺陷104例临床观察.中国中西医结合杂志，1997，17：280-282.
3 杨林花，沈迪，王爱莲，等.应用流式细胞仪检测原因未明“血小板病”患者血小板膜糖蛋白的改变.中华物理医学杂志，1997，19：165-167.
(收稿：1997-09-18 修回：1997-12-15), 百拇医药
单位：030001 太原，山西医科大学第二医院血液科(杨林花)；同济医科大学附属协和医院(沈迪、张玉金、王爱莲、魏文宁、刘仲萍、杨锐、杨焰)
关键词：
中华内科杂志980613 多部位出血伴血小板聚集缺陷，特征为临床轻重不等的皮肤黏膜出血和(或)月经过多，血小板计数和凝血象正常；血小板形态无异常。血小板对二磷酸腺苷(ADP)、血小板活化因子(PAF)、胶原和肾上腺素等诱导的聚集反应出现不等程度的缺陷。我们对这些患者的血小板纤维蛋白原作了初步研究，现报道如下。
一、资料与方法
1.病例：选择未明原因有2个部位出血患者8例，男2例，女6例，年龄19～60岁(平均38.5岁)。每例患者至少有2种诱聚剂反应缺陷，复查仍异常者列为研究对象。正常对照者9例均为实验室工作人员。
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2.血小板预处理和标记：取新鲜离心血小板，经无钙Tyrode液洗涤2次，悬浮于Tyrode液。实验管标本加终浓度10 μmol/L ADP(Chrono-Log公司)，室温下作用10分钟；对照管加生理盐水，各管均按时加2%多聚甲醛固定30分钟。最终用TES悬浮血小板，调整至(1～2)×107/ml。取固定后血小板悬液10 μl，加一硫氰酸荧光素(FITC)标记的兔抗人纤维蛋白原多克隆抗体(Dake公司)10 μl，避光作用30分钟，以TES补至终体积1 ml，冰浴。
3.流式细胞仪检测：所有样品均用FACS 420流式细胞仪(BD公司)检测，光源2 W氩离子激光，激发波长488 nm，每个样品测10 000个血小板，数据由微机处理。
4.免疫印迹试验：血小板纤维蛋白原采用5%～15%梯度胶测定；血小板蛋白质为还原样品，抗纤维蛋白原单克隆抗体SZ-65(购自苏州医学院)。
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二、结果
1.血小板表面纤维蛋白原结合位点：应用流式细胞技术检测结果：患者血小板表面的百分(F 111)标记率(%，Tot)在ADP活化组与正常对照组对比，相应为73.18±4.90与69.48±6.27；其荧光道数(mode)相应为65.25±5.78与66.67±6.88，其间均无明显的统计学差异(P>0.05)。
2.免疫印迹试验结果：血小板蛋白质全谱经SDS-PAGE技术，Coomasie亮蓝染色可显示40多条蛋白条带；然与特异性抗纤维蛋白原单抗杂交，再与辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗鼠IgG二抗反应后，结果在8例患者所显示的特异性条带与正常对照者相比，发现部分患者血小板蛋白质在97 000～100 000之间有异常纤维蛋白原条带，提示患者血小板纤维蛋白原在质与量方面有异常表达。
讨论 多部位出血和血小板聚集缺陷是客观存在的临床症状和实验室指征。由于我们对该病的了解不多，认识不一，至今仍缺乏明确诊断。Lages和Weiss[1]曾报道1例自幼即有多部位出血伴低浓度诱聚剂反应缺陷者，本组诱聚剂均为常规浓度的反应缺陷，且其缺陷程度并不一致，故有所区别。我们鉴于患者反复出血的临床症状，试用益气祛瘀药治疗[2]，结果可获得止血和恢复血小板聚集的效果；提示本病的出血和聚集缺陷是可以治疗的，推测并非先天性疾病。我们采用流式细胞技术检测患者血小板纤维蛋白原及膜糖蛋白Ⅱb/Ⅲa、Ⅱb及Ⅲa[3]，其荧光表达均未见差异，而免疫印迹技术则见血小板纤维蛋白原有质和(或)量的异常，可能与本病的出血及聚集缺陷有关，有待研究。
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本课题为国家自然科学基金资助项目(No.39370322)
参考文献
1 Lages B, Weiss HJ. Heterogeneous defects of platelet secretion and responses to weak agonists in patients with bleeding disorders. Br J Haematol, 1988,68：53-62.
2 沈迪，沈霖，王爱莲，等.消瘀止血片治疗未明原因多部位出血伴血小板聚集缺陷104例临床观察.中国中西医结合杂志，1997，17：280-282.
3 杨林花，沈迪，王爱莲，等.应用流式细胞仪检测原因未明“血小板病”患者血小板膜糖蛋白的改变.中华物理医学杂志，1997，19：165-167.
(收稿：1997-09-18 修回：1997-12-15), 百拇医药