支气管哮喘患者记忆性T淋巴细胞对B淋巴细胞产生IgE作用的研究
作者：韩淑华 黄瑾 安东善 李淑芳
单位：130041 长春，白求恩医科大学第二临床学院呼吸内科
关键词：
中华内科杂志990209 【摘要】 目的 探讨记忆性(CD+4CD45RO+)T淋巴细胞在支气管哮喘发病中的作用。方法 分别分离出支气管哮喘病人及健康对照的CD+4CD45RO+T淋巴细胞亚群，并将其与各自的B淋巴细胞共同培养，设定刺激组(美洲商陆有丝分裂原)及非刺激组，测定培养上清液中IgE的含量。结果 哮喘病人自然状态的CD+4CD45RO+T淋巴细胞对B淋巴细胞产生IgE有正向促进作用，但在接受美洲商陆有丝分裂原刺激后，上述现象不复存在。自然状态病人记忆性T淋巴细胞与B淋巴细胞培养IgE产生量明显高于体外活化后培养IgE产生量。结论 哮喘病人记忆性T淋巴细胞体外活化后功能状态有所恢复，达到与正常人相同水平。表明支气管哮喘病人记忆性T淋巴细胞对IgE产生影响的异常改变可能与其发病机制有关。
, http://www.100md.com
The effect of memory T lymphocytes on IgE production by B lymphocytes in patients with bronchial asthma HAN Shuhua, HUANG Jin, AN Dongshan, et al. Department of Respiratory Medicine, The Second College of Norman Bethune University of Medical Science, Changchun 130041
【Abstract】 Objective To study the role of CD+4CD45RO+ T lymphocytes in the pathogenesis of bronchial asthma. Methods CD+4CD45RO+ T lymphocyte subsets were isolated from peripheral blood of patients with bronchial asthma and healthy donors. Then they were cultured with self-B lymphocytes and designated as pokeweed mitogen (PWM)-stimulated and non-stimulated group. Secreted IgE was measured in the supernatant. Results CD+4CD45RO+ T lymphocytes had a positive role on IgE production by B lymphocytes from patients of bronchial asthma in non-stimulated group, but the positive role did not exit in the presence of PWM. The effect of activated and non-activated CD+4CD45RO+ T lymphocytes from patients with bronchial asthma on the secretion of IgE by B lymphocytes were turther investigated. Conclusion The function of activated CD+4CD45RO+ T lymphocytes returned to normal level. It is suggested that CD+4CD45RO+ T lymphocytes have adverse effects on IgE production in patients with bronchial asthma; which may be related to the pothogenesis of asthma.
, 百拇医药
【Key words】 Asthma T-lymphocytes IgE B-lymphocytes
目前，人们普遍认为支气管哮喘的病理改变以非感染性炎症为主，其机制与变态反应有关。其中特异性IgE产生所致的过敏性哮喘是典型的I型变态反应，因此探讨IgE产生的影响控制因素，对揭示哮喘的发病机制无疑十分重要。记忆性T淋巴细胞(CD+4 T淋巴细胞中的CD45RO+亚群)对B淋巴细胞产生免疫球蛋白具有明确的辅助控制作用[1]。本研究将分离得到的哮喘病人的CD+4CD45RO+ T淋巴细胞与B淋巴细胞体外培养，观察记忆性T淋巴细胞在哮喘发病机制中的作用。
对象与方法
, http://www.100md.com
1.检测对象：36例支气管哮喘急性发作期病人均来自我院呼吸内科门诊，均未经糖皮质激素治疗，诊断均符合1992年广州全国哮喘会议修订的哮喘诊断标准[2]，其中男10例，女26例，年龄17～70岁，平均年龄39.8岁。25例健康对照均为我市中心血站献血人员，男19例，女6例，年龄19～48岁，平均年龄31.5岁。
2.外周血单个核细胞(PBMC)的分离：取静脉血5 ml，肝素抗凝，用淋巴细胞分离液(上海试剂二厂)分离单个核细胞，备用。
3.T、B淋巴细胞分离：采用尼龙毛柱法，参照文献[3]，将调好的1 ml细胞悬液加入已用Hank液处理的直径3 mm、长100 mm的尼龙毛柱中。37℃ CO2培养箱放置30分钟，用Hank液轻轻洗柱，自然流出的部分为T淋巴细胞，经挤压后流出的部分为B淋巴细胞。1 000 r/min，离心10分钟，弃上清，调成细胞悬液待用。
, 百拇医药
4.T淋巴细胞亚群分离：将分离得到的T淋巴细胞调成1 ml细胞悬液置于24孔培养板中，加入抗CD8单抗(北京医科大学免疫室)，37℃反应40分钟，再加入兔血清(我室制备)反应1小时，洗涤细胞，调成1 ml细胞悬液分别加入抗CD45RA单抗(美国Phar Minen公司)和兔血清，各反应40分钟和1小时，洗涤细胞，调成细胞悬液1×106/ml，备用。
5.培养细胞：将CD+4CD45RO+ T淋巴细胞(5×105/孔)与B淋巴细胞(5×105/孔)在IMDM-培养基中培养9天，为了观察体外活化后记忆性T淋巴细胞对B淋巴细胞产生IgE的作用，设定刺激组和非刺激组，刺激组加入非特异性刺激原美洲商陆有丝分裂原(PWM)(美国Sigma公司)10 μg/ml，9天后收取上清，贮存于-30℃冰箱中待测。
, 百拇医药
6.检测：用抗人IgE单抗试剂盒(中国协和医科大学免疫室)测定IgE含量，方法参照文献[4]，用DG3022酶标仪490 nm测定吸光度值。
7.统计学方法：数值以
±s表示，各组间比较采用t检验。
结 果
1.支气管哮喘病人CD+4CD45RO+ T淋巴细胞对B淋巴细胞产生IgE的自然影响作用：哮喘病人B淋巴细胞加入自体CD+4CD45RO+ T淋巴细胞后IgE产生含量明显高于健康对照(t=1.888,P<0.05)。见图1。
, http://www.100md.com
图1 活化CD+4CD45RO+T淋巴细胞对
自体B淋巴细胞产生IgE的影响
2.用PWM刺激后记忆性T淋巴细胞对B淋巴细胞产生IgE的影响作用：经PWM刺激后，哮喘病人与健康对照的记忆性T淋巴细胞体外活化后，两者对自体B淋巴细胞产生IgE的辅助作用差异无显著性(t=0.309，P>0.05)。见图2。
图2 经美洲商陆有丝分裂原刺激后CD+4CD45RO+
T淋巴细胞对自体B淋巴细胞产生IgE的影响
, http://www.100md.com
3.哮喘病人与健康人记忆性T淋巴细胞体外活化前后对自体B淋巴细胞产生IgE的影响：自然状态病人记忆性T淋巴细胞与B淋巴细胞培养IgE产生量，明显高于体外活化后记忆性T淋巴细胞与B淋巴细胞培养IgE的产生量(t=3.048,P<0.01)。健康人记忆性T淋巴细胞活化前后对自体B淋巴细胞产生IgE水平的影响，差异无显著性(t=0.083,P>0.05)。见图3。
图3 自然状态及活化后CD+4CD45RO+ T淋巴
细胞对自体B淋巴细胞产生IgE的影响讨 论
支气管哮喘发病机制中IgE的参与十分重要，故研究IgE产生的控制因素将有益于阐明该病的发病机制。随着免疫学理论研究的不断深入，已经认识到并不是所有的辅助性T淋巴细胞(CD+4 T淋巴细胞)均对B淋巴细胞产生免疫球蛋白有辅助促进作用。CD+4CD45RO+ T淋巴细胞是辅助性T淋巴细胞中具有正向调节B淋巴细胞产生免疫球蛋白的主要部分。本研究分离出支气管哮喘病人和健康人记忆性T淋巴细胞，并观察了用PWM活化和自然状态的记忆性T淋巴细胞对自体B淋巴细胞产生IgE的影响作用。
, http://www.100md.com
经过实验，我们观察到支气管哮喘病人离体得到的自然状态的CD+4CD45RO+ T淋巴细胞对B淋巴细胞产生IgE的辅助作用明显高于健康对照。这说明，自然状态下无体外刺激的病人记忆性T淋巴细胞活性明显高于健康对照。有人认为CD+4CD45RO+ T淋巴细胞有Th2样作用，能分泌白细胞介素(IL)-4、IL-5和IL-10[1，5]，并有明确的辅助B淋巴细胞产生IgE的作用，故上述改变可以认为，在支气管哮喘发病中记忆性T淋巴细胞的活性增高可能起了主要作用。T淋巴细胞等免疫细胞在机体内经常以活化或非活化两种状态存在，不同状态下功能不尽相同。为进一步探讨体外活化后记忆性T淋巴细胞对B淋巴细胞产生IgE的作用，本研究在各组加入了PWM。结果显示，体外人为刺激后，哮喘病人记忆性T淋巴细胞对B淋巴细胞产生IgE水平的影响作用与健康对照无明显差别，这表明体外实验时，两者共同接受PWM刺激后，哮喘病人记忆性T淋巴细胞活性下降，其对IgE的辅助作用与健康对照达到同等水平。为进一步观察病人及正常人的记忆性T淋巴细胞是否处于不同的功能状态，本研究还观察了哮喘病人和正常人的记忆性T淋巴细胞体外活化前后对自体B淋巴细胞产生IgE的影响作用。哮喘病人体外活化后记忆性T淋巴细胞与B淋巴细胞共同培养IgE的产生量，明显低于自然状态记忆性T淋巴细胞。正常人活化前后记忆性T淋巴细胞对B淋巴细胞产生IgE的影响作用无明显差别。以上结果表明，PWM刺激后哮喘病人记忆性T淋巴细胞异常功能状态得以调整，而原本处于正常状态的健康人的记忆性T淋巴细胞接受PWM刺激后仍处于正常状态。王昆润[6]报道，用免疫调节剂综合治疗哮喘能矫正哮喘病人的细胞免疫缺损，治疗后免疫细胞数量有所增加，临床效果比传统疗法明显，喘憋发作次数减少，咳嗽、咳痰减轻或消失，全身情况改善。结合本研究可见免疫调节剂在哮喘治疗中有一定的地位。T淋巴细胞对B淋巴细胞产生IgE的控制作用是通过T淋巴细胞释放各种淋巴因子主要是IL-4和两者相互接触来实现的[7]，至于上述结果的确切控制机制有待于进一步研究。总之，哮喘病人的记忆性T淋巴细胞处于异常功能状态，在哮喘发病中起了主要作用，并且记忆性T淋巴细胞的异常功能状态是可以逆转的。
, http://www.100md.com
本课题受国家自然科学基金资助(39400047)
参考文献
1 Ferrer JM, Plaza A, Kreisler M, et al. Differential interleukin secretion by in vitro activated human CD45RO and CD45RO CD4+ T cell subsets. Cell Immunol, 1992,141：10-20.
2 支气管哮喘的定义、诊断、严重度分级及疗效判断标准(修正方案).中华结核和呼吸杂志，1993，16哮喘增刊：5.
3 杨景山.医学细胞化学与细胞生物技术.北京：北京医科大学、中国协和医科大学联合出版社，1990.11-12.
, http://www.100md.com
4 Brinkmann V, Kristofic C. TCR-stimulated naive human CD4+ 45RO+ T cells develop into effector cells that secrete IL-13, IL-5, and INF-gamma, but no IL-4, and help efficient IgE production by B cells. J Immunol, 1995,154：3078-3087.
5 Brinkmann V, Kristofic C. Regulation by corticosteroids of Th1 and Th2 cytokine production in human CD4+ effector T cells generated from CD45RO- and CD45RO+ subsets. J Immunol, 1995,155：3322-3328.
, 百拇医药 6 王昆润.用免疫调节剂综合治疗支气管哮喘.国外医学呼吸系统分册，1996，16：163.
7 Lederman S, Yellin MJ, Inghirami G, et al. Molecular interactions mediating T-B Iymphocyte collaboration in human lymphoid follicles. Roles of T cell-B-cell-activating molecule (5c8 antigen) and CD40 in contact-dependent help. J Immunol, 1992,149：3817-3826.
(收稿：1996-10-25 修回：1998-03-10), 百拇医药
单位：130041 长春，白求恩医科大学第二临床学院呼吸内科
关键词：
中华内科杂志990209 【摘要】 目的 探讨记忆性(CD+4CD45RO+)T淋巴细胞在支气管哮喘发病中的作用。方法 分别分离出支气管哮喘病人及健康对照的CD+4CD45RO+T淋巴细胞亚群，并将其与各自的B淋巴细胞共同培养，设定刺激组(美洲商陆有丝分裂原)及非刺激组，测定培养上清液中IgE的含量。结果 哮喘病人自然状态的CD+4CD45RO+T淋巴细胞对B淋巴细胞产生IgE有正向促进作用，但在接受美洲商陆有丝分裂原刺激后，上述现象不复存在。自然状态病人记忆性T淋巴细胞与B淋巴细胞培养IgE产生量明显高于体外活化后培养IgE产生量。结论 哮喘病人记忆性T淋巴细胞体外活化后功能状态有所恢复，达到与正常人相同水平。表明支气管哮喘病人记忆性T淋巴细胞对IgE产生影响的异常改变可能与其发病机制有关。
, http://www.100md.com
The effect of memory T lymphocytes on IgE production by B lymphocytes in patients with bronchial asthma HAN Shuhua, HUANG Jin, AN Dongshan, et al. Department of Respiratory Medicine, The Second College of Norman Bethune University of Medical Science, Changchun 130041
【Abstract】 Objective To study the role of CD+4CD45RO+ T lymphocytes in the pathogenesis of bronchial asthma. Methods CD+4CD45RO+ T lymphocyte subsets were isolated from peripheral blood of patients with bronchial asthma and healthy donors. Then they were cultured with self-B lymphocytes and designated as pokeweed mitogen (PWM)-stimulated and non-stimulated group. Secreted IgE was measured in the supernatant. Results CD+4CD45RO+ T lymphocytes had a positive role on IgE production by B lymphocytes from patients of bronchial asthma in non-stimulated group, but the positive role did not exit in the presence of PWM. The effect of activated and non-activated CD+4CD45RO+ T lymphocytes from patients with bronchial asthma on the secretion of IgE by B lymphocytes were turther investigated. Conclusion The function of activated CD+4CD45RO+ T lymphocytes returned to normal level. It is suggested that CD+4CD45RO+ T lymphocytes have adverse effects on IgE production in patients with bronchial asthma; which may be related to the pothogenesis of asthma.
, 百拇医药
【Key words】 Asthma T-lymphocytes IgE B-lymphocytes
目前，人们普遍认为支气管哮喘的病理改变以非感染性炎症为主，其机制与变态反应有关。其中特异性IgE产生所致的过敏性哮喘是典型的I型变态反应，因此探讨IgE产生的影响控制因素，对揭示哮喘的发病机制无疑十分重要。记忆性T淋巴细胞(CD+4 T淋巴细胞中的CD45RO+亚群)对B淋巴细胞产生免疫球蛋白具有明确的辅助控制作用[1]。本研究将分离得到的哮喘病人的CD+4CD45RO+ T淋巴细胞与B淋巴细胞体外培养，观察记忆性T淋巴细胞在哮喘发病机制中的作用。
对象与方法
, http://www.100md.com
1.检测对象：36例支气管哮喘急性发作期病人均来自我院呼吸内科门诊，均未经糖皮质激素治疗，诊断均符合1992年广州全国哮喘会议修订的哮喘诊断标准[2]，其中男10例，女26例，年龄17～70岁，平均年龄39.8岁。25例健康对照均为我市中心血站献血人员，男19例，女6例，年龄19～48岁，平均年龄31.5岁。
2.外周血单个核细胞(PBMC)的分离：取静脉血5 ml，肝素抗凝，用淋巴细胞分离液(上海试剂二厂)分离单个核细胞，备用。
3.T、B淋巴细胞分离：采用尼龙毛柱法，参照文献[3]，将调好的1 ml细胞悬液加入已用Hank液处理的直径3 mm、长100 mm的尼龙毛柱中。37℃ CO2培养箱放置30分钟，用Hank液轻轻洗柱，自然流出的部分为T淋巴细胞，经挤压后流出的部分为B淋巴细胞。1 000 r/min，离心10分钟，弃上清，调成细胞悬液待用。
, 百拇医药
4.T淋巴细胞亚群分离：将分离得到的T淋巴细胞调成1 ml细胞悬液置于24孔培养板中，加入抗CD8单抗(北京医科大学免疫室)，37℃反应40分钟，再加入兔血清(我室制备)反应1小时，洗涤细胞，调成1 ml细胞悬液分别加入抗CD45RA单抗(美国Phar Minen公司)和兔血清，各反应40分钟和1小时，洗涤细胞，调成细胞悬液1×106/ml，备用。
5.培养细胞：将CD+4CD45RO+ T淋巴细胞(5×105/孔)与B淋巴细胞(5×105/孔)在IMDM-培养基中培养9天，为了观察体外活化后记忆性T淋巴细胞对B淋巴细胞产生IgE的作用，设定刺激组和非刺激组，刺激组加入非特异性刺激原美洲商陆有丝分裂原(PWM)(美国Sigma公司)10 μg/ml，9天后收取上清，贮存于-30℃冰箱中待测。
, 百拇医药
6.检测：用抗人IgE单抗试剂盒(中国协和医科大学免疫室)测定IgE含量，方法参照文献[4]，用DG3022酶标仪490 nm测定吸光度值。
7.统计学方法：数值以
±s表示，各组间比较采用t检验。结 果
1.支气管哮喘病人CD+4CD45RO+ T淋巴细胞对B淋巴细胞产生IgE的自然影响作用：哮喘病人B淋巴细胞加入自体CD+4CD45RO+ T淋巴细胞后IgE产生含量明显高于健康对照(t=1.888,P<0.05)。见图1。
, http://www.100md.com
图1 活化CD+4CD45RO+T淋巴细胞对
自体B淋巴细胞产生IgE的影响
2.用PWM刺激后记忆性T淋巴细胞对B淋巴细胞产生IgE的影响作用：经PWM刺激后，哮喘病人与健康对照的记忆性T淋巴细胞体外活化后，两者对自体B淋巴细胞产生IgE的辅助作用差异无显著性(t=0.309，P>0.05)。见图2。
图2 经美洲商陆有丝分裂原刺激后CD+4CD45RO+
T淋巴细胞对自体B淋巴细胞产生IgE的影响
, http://www.100md.com
3.哮喘病人与健康人记忆性T淋巴细胞体外活化前后对自体B淋巴细胞产生IgE的影响：自然状态病人记忆性T淋巴细胞与B淋巴细胞培养IgE产生量，明显高于体外活化后记忆性T淋巴细胞与B淋巴细胞培养IgE的产生量(t=3.048,P<0.01)。健康人记忆性T淋巴细胞活化前后对自体B淋巴细胞产生IgE水平的影响，差异无显著性(t=0.083,P>0.05)。见图3。
图3 自然状态及活化后CD+4CD45RO+ T淋巴
细胞对自体B淋巴细胞产生IgE的影响讨 论
支气管哮喘发病机制中IgE的参与十分重要，故研究IgE产生的控制因素将有益于阐明该病的发病机制。随着免疫学理论研究的不断深入，已经认识到并不是所有的辅助性T淋巴细胞(CD+4 T淋巴细胞)均对B淋巴细胞产生免疫球蛋白有辅助促进作用。CD+4CD45RO+ T淋巴细胞是辅助性T淋巴细胞中具有正向调节B淋巴细胞产生免疫球蛋白的主要部分。本研究分离出支气管哮喘病人和健康人记忆性T淋巴细胞，并观察了用PWM活化和自然状态的记忆性T淋巴细胞对自体B淋巴细胞产生IgE的影响作用。
, http://www.100md.com
经过实验，我们观察到支气管哮喘病人离体得到的自然状态的CD+4CD45RO+ T淋巴细胞对B淋巴细胞产生IgE的辅助作用明显高于健康对照。这说明，自然状态下无体外刺激的病人记忆性T淋巴细胞活性明显高于健康对照。有人认为CD+4CD45RO+ T淋巴细胞有Th2样作用，能分泌白细胞介素(IL)-4、IL-5和IL-10[1，5]，并有明确的辅助B淋巴细胞产生IgE的作用，故上述改变可以认为，在支气管哮喘发病中记忆性T淋巴细胞的活性增高可能起了主要作用。T淋巴细胞等免疫细胞在机体内经常以活化或非活化两种状态存在，不同状态下功能不尽相同。为进一步探讨体外活化后记忆性T淋巴细胞对B淋巴细胞产生IgE的作用，本研究在各组加入了PWM。结果显示，体外人为刺激后，哮喘病人记忆性T淋巴细胞对B淋巴细胞产生IgE水平的影响作用与健康对照无明显差别，这表明体外实验时，两者共同接受PWM刺激后，哮喘病人记忆性T淋巴细胞活性下降，其对IgE的辅助作用与健康对照达到同等水平。为进一步观察病人及正常人的记忆性T淋巴细胞是否处于不同的功能状态，本研究还观察了哮喘病人和正常人的记忆性T淋巴细胞体外活化前后对自体B淋巴细胞产生IgE的影响作用。哮喘病人体外活化后记忆性T淋巴细胞与B淋巴细胞共同培养IgE的产生量，明显低于自然状态记忆性T淋巴细胞。正常人活化前后记忆性T淋巴细胞对B淋巴细胞产生IgE的影响作用无明显差别。以上结果表明，PWM刺激后哮喘病人记忆性T淋巴细胞异常功能状态得以调整，而原本处于正常状态的健康人的记忆性T淋巴细胞接受PWM刺激后仍处于正常状态。王昆润[6]报道，用免疫调节剂综合治疗哮喘能矫正哮喘病人的细胞免疫缺损，治疗后免疫细胞数量有所增加，临床效果比传统疗法明显，喘憋发作次数减少，咳嗽、咳痰减轻或消失，全身情况改善。结合本研究可见免疫调节剂在哮喘治疗中有一定的地位。T淋巴细胞对B淋巴细胞产生IgE的控制作用是通过T淋巴细胞释放各种淋巴因子主要是IL-4和两者相互接触来实现的[7]，至于上述结果的确切控制机制有待于进一步研究。总之，哮喘病人的记忆性T淋巴细胞处于异常功能状态，在哮喘发病中起了主要作用，并且记忆性T淋巴细胞的异常功能状态是可以逆转的。
, http://www.100md.com
本课题受国家自然科学基金资助(39400047)
参考文献
1 Ferrer JM, Plaza A, Kreisler M, et al. Differential interleukin secretion by in vitro activated human CD45RO and CD45RO CD4+ T cell subsets. Cell Immunol, 1992,141：10-20.
2 支气管哮喘的定义、诊断、严重度分级及疗效判断标准(修正方案).中华结核和呼吸杂志，1993，16哮喘增刊：5.
3 杨景山.医学细胞化学与细胞生物技术.北京：北京医科大学、中国协和医科大学联合出版社，1990.11-12.
, http://www.100md.com
4 Brinkmann V, Kristofic C. TCR-stimulated naive human CD4+ 45RO+ T cells develop into effector cells that secrete IL-13, IL-5, and INF-gamma, but no IL-4, and help efficient IgE production by B cells. J Immunol, 1995,154：3078-3087.
5 Brinkmann V, Kristofic C. Regulation by corticosteroids of Th1 and Th2 cytokine production in human CD4+ effector T cells generated from CD45RO- and CD45RO+ subsets. J Immunol, 1995,155：3322-3328.
, 百拇医药 6 王昆润.用免疫调节剂综合治疗支气管哮喘.国外医学呼吸系统分册，1996，16：163.
7 Lederman S, Yellin MJ, Inghirami G, et al. Molecular interactions mediating T-B Iymphocyte collaboration in human lymphoid follicles. Roles of T cell-B-cell-activating molecule (5c8 antigen) and CD40 in contact-dependent help. J Immunol, 1992,149：3817-3826.
(收稿：1996-10-25 修回：1998-03-10), 百拇医药