乙型病毒性肝炎患者淋巴细胞凋亡的初步观察
作者：范学工 施家琦 刘文恩 王智纯 唐冬生 谭德明 胡国龄
单位：410008 湖南医科大学附属湘雅医院(范学工、刘文恩、王智纯、谭德明、胡国龄)，医学遗传学国家重点实验室(施家琦、唐冬生)
关键词：
中华内科杂志990224 成熟外周血淋巴细胞存在凋亡已被肯定，这一现象在防止过量的抗原激活淋巴细胞，调节免疫应答方面有重要意义[1]。我们对乙型肝炎病人淋巴细胞凋亡状况进行了初步观察，报道如下。
一、对象与方法
1.对象：慢性乙型肝炎患者16例，系我科1997年5～12月的住院病人，其诊断符合1995年第三次全国传染病寄生虫病学术会议制定的标准[2]。其中男性12例，女性4例，年龄22～52岁，平均38岁。所有病例研究前3个月未使用过免疫制剂。11例健康献血员作为正常对照，男性7例，女性4例，年龄20～40岁，平均36岁。
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2.外周血单个核细胞(PBMC)分离、培养：常规方法分离获得PBMC，加入24孔细胞培养板中培养，PBMC浓度为每毫升4×106细胞/孔。对照孔仅PBMC，实验孔为PBMC加植物血凝素(PHA，Sigma)，PHA终浓度为10 mg/L。培养72小时后收获细胞用于凋亡测定。
3.DNA琼脂糖凝胶电泳[3]：收集培养72小时后的PBMC洗两次，加入细胞裂解液(50 mmol/L Tris-HCl,10 mmol/L EDTA, NP40)，3～5分钟后加蛋白酶K(0.5 g/L，Boehringer)和质量分数为10%的SDS，50℃，1小时水浴。然后10 000r/min离心10分钟，取上清液，经异丙醇和NaCl -20℃过夜沉淀。12 000 r/min离心15分钟，弃上清，加TE(含50 mg/L RNA酶，Boehringer)50℃，1 小时溶解DNA，于质量分数为1.5%的琼脂糖凝胶电泳，溴乙啶染色，紫外线灯下观察DNA条带。
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4.流式细胞仪测定[3]：收集培养72小时后的PBMC，洗两次，加入RNA酶(50 mg/L)，37℃消化1小时，加碘化丙啶(PI，50 mg/L)染色30分钟，测定凋亡率，亚G1期细胞为凋亡细胞。测定仪器为FACS Vantage(Becton Dickinson，美国)。
5.统计学处理：采用t检验比较两组凋亡细胞绝对数。
二、结果
1.DNA琼脂糖凝胶电泳：健康对照组PBMC不论是否加入PHA，及乙型肝炎病人静息PBMC(未加PHA)，DNA凝胶电泳均未能显示“梯状带”；而乙型肝炎病人PBMC在加入PHA培养72小时后，于电泳时出现典型的“梯状带”，表明病人淋巴细胞激活后被诱导凋亡。
2.流式术结果：健康对照组静息外周血淋巴细胞凋亡率为(10.35±5.67)%，而PHA激活后凋亡率为(14.82±8.37)%，其平均凋亡率二者之间差异无显著性(P>0.05)。乙型肝炎病人静息淋巴细胞凋亡率为(14.62±9.11)%，激活后为(22.23±12.61)%，其平均凋亡率后者明显增加(P<0.05)。虽然病人淋巴细胞激活后平均凋亡率明显增加，但与健康对照比较P>0.05。
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3.淋巴细胞凋亡与血清丙氨酸转氨酶(ALT)的关系：以200U为界分析，血清ALT水平低的病人，其激活后淋巴细胞凋亡率明显高于ALT水平高的病人(表1)。
表1 乙型肝炎病人淋巴细胞凋亡与ALT的关系 血清ALT
例数
凋亡率(%)
PBMC
PBMC+PHA
≤200 U
6
12.75± 5.45
29.24± 9.52*
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>200 U
10
15.78±10.56
18.03±12.37
注：ALT：丙氨酸转氨酶，赖氏法测定，正常值<40 U；PBMC：外周血单个核细胞；PHA：植物血凝素；与ALT>200 U组比较，*P<0.05
4.淋巴细胞凋亡与乙型肝炎病毒复制指标的关系：本研究没有发现二者之间存在相关性。
讨论 淋巴细胞凋亡在艾滋病和某些自身免疫性疾病发病机制中的作用已得到较广泛的研究[1]，但其在乙型肝炎免疫致病机制中的作用如何，尚不清楚。本研究表明，慢性乙型肝炎病人确实存在激活诱导的淋巴细胞凋亡，并且凋亡率与病人ALT水平成反相关。这一结果说明，淋巴细胞凋亡参与了乙型 肝炎的免疫致病机制。ALT升高不明显的病人，其激活后淋巴细胞凋亡率明显增加，可能是一种宿主保护机制，通过增加淋巴细胞凋亡来“去除”过多的抗原应答细胞，达到一种免疫平衡状态。淋巴细胞凋亡在乙型肝炎病人免疫发病机制中的意义，以及淋巴细胞凋亡增加的机制，尚需更进一步的工作来阐明。
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参考文献
1 Kabelitz D, Pohl T, Pechhold K.Activation-induced cell death (apoptosis) of mature peripheral T lymphocytes. Immunol Today, 1993,14:338-339.
2 病毒性肝炎防治方案.中华传染病杂志，1995，13：241-247.
3 McCloskey TW, Oyaizu N, Coronesi M, et al. Use of a flow cytometric assay to quantitate apoptosis in human lymphocytes. Clin Immunol Immunopathol, 1994,71:14-18.
(收稿：1998-03-02 修回：1998-08-12), http://www.100md.com
单位：410008 湖南医科大学附属湘雅医院(范学工、刘文恩、王智纯、谭德明、胡国龄)，医学遗传学国家重点实验室(施家琦、唐冬生)
关键词：
中华内科杂志990224 成熟外周血淋巴细胞存在凋亡已被肯定，这一现象在防止过量的抗原激活淋巴细胞，调节免疫应答方面有重要意义[1]。我们对乙型肝炎病人淋巴细胞凋亡状况进行了初步观察，报道如下。
一、对象与方法
1.对象：慢性乙型肝炎患者16例，系我科1997年5～12月的住院病人，其诊断符合1995年第三次全国传染病寄生虫病学术会议制定的标准[2]。其中男性12例，女性4例，年龄22～52岁，平均38岁。所有病例研究前3个月未使用过免疫制剂。11例健康献血员作为正常对照，男性7例，女性4例，年龄20～40岁，平均36岁。
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2.外周血单个核细胞(PBMC)分离、培养：常规方法分离获得PBMC，加入24孔细胞培养板中培养，PBMC浓度为每毫升4×106细胞/孔。对照孔仅PBMC，实验孔为PBMC加植物血凝素(PHA，Sigma)，PHA终浓度为10 mg/L。培养72小时后收获细胞用于凋亡测定。
3.DNA琼脂糖凝胶电泳[3]：收集培养72小时后的PBMC洗两次，加入细胞裂解液(50 mmol/L Tris-HCl,10 mmol/L EDTA, NP40)，3～5分钟后加蛋白酶K(0.5 g/L，Boehringer)和质量分数为10%的SDS，50℃，1小时水浴。然后10 000r/min离心10分钟，取上清液，经异丙醇和NaCl -20℃过夜沉淀。12 000 r/min离心15分钟，弃上清，加TE(含50 mg/L RNA酶，Boehringer)50℃，1 小时溶解DNA，于质量分数为1.5%的琼脂糖凝胶电泳，溴乙啶染色，紫外线灯下观察DNA条带。
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4.流式细胞仪测定[3]：收集培养72小时后的PBMC，洗两次，加入RNA酶(50 mg/L)，37℃消化1小时，加碘化丙啶(PI，50 mg/L)染色30分钟，测定凋亡率，亚G1期细胞为凋亡细胞。测定仪器为FACS Vantage(Becton Dickinson，美国)。
5.统计学处理：采用t检验比较两组凋亡细胞绝对数。
二、结果
1.DNA琼脂糖凝胶电泳：健康对照组PBMC不论是否加入PHA，及乙型肝炎病人静息PBMC(未加PHA)，DNA凝胶电泳均未能显示“梯状带”；而乙型肝炎病人PBMC在加入PHA培养72小时后，于电泳时出现典型的“梯状带”，表明病人淋巴细胞激活后被诱导凋亡。
2.流式术结果：健康对照组静息外周血淋巴细胞凋亡率为(10.35±5.67)%，而PHA激活后凋亡率为(14.82±8.37)%，其平均凋亡率二者之间差异无显著性(P>0.05)。乙型肝炎病人静息淋巴细胞凋亡率为(14.62±9.11)%，激活后为(22.23±12.61)%，其平均凋亡率后者明显增加(P<0.05)。虽然病人淋巴细胞激活后平均凋亡率明显增加，但与健康对照比较P>0.05。
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3.淋巴细胞凋亡与血清丙氨酸转氨酶(ALT)的关系：以200U为界分析，血清ALT水平低的病人，其激活后淋巴细胞凋亡率明显高于ALT水平高的病人(表1)。
表1 乙型肝炎病人淋巴细胞凋亡与ALT的关系 血清ALT
例数
凋亡率(%)
PBMC
PBMC+PHA
≤200 U
6
12.75± 5.45
29.24± 9.52*
, 百拇医药
>200 U
10
15.78±10.56
18.03±12.37
注：ALT：丙氨酸转氨酶，赖氏法测定，正常值<40 U；PBMC：外周血单个核细胞；PHA：植物血凝素；与ALT>200 U组比较，*P<0.05
4.淋巴细胞凋亡与乙型肝炎病毒复制指标的关系：本研究没有发现二者之间存在相关性。
讨论 淋巴细胞凋亡在艾滋病和某些自身免疫性疾病发病机制中的作用已得到较广泛的研究[1]，但其在乙型肝炎免疫致病机制中的作用如何，尚不清楚。本研究表明，慢性乙型肝炎病人确实存在激活诱导的淋巴细胞凋亡，并且凋亡率与病人ALT水平成反相关。这一结果说明，淋巴细胞凋亡参与了乙型 肝炎的免疫致病机制。ALT升高不明显的病人，其激活后淋巴细胞凋亡率明显增加，可能是一种宿主保护机制，通过增加淋巴细胞凋亡来“去除”过多的抗原应答细胞，达到一种免疫平衡状态。淋巴细胞凋亡在乙型肝炎病人免疫发病机制中的意义，以及淋巴细胞凋亡增加的机制，尚需更进一步的工作来阐明。
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参考文献
1 Kabelitz D, Pohl T, Pechhold K.Activation-induced cell death (apoptosis) of mature peripheral T lymphocytes. Immunol Today, 1993,14:338-339.
2 病毒性肝炎防治方案.中华传染病杂志，1995，13：241-247.
3 McCloskey TW, Oyaizu N, Coronesi M, et al. Use of a flow cytometric assay to quantitate apoptosis in human lymphocytes. Clin Immunol Immunopathol, 1994,71:14-18.
(收稿：1998-03-02 修回：1998-08-12), http://www.100md.com