T淋巴细胞对哮喘患者嗜酸细胞阳离子蛋白生成的影响
作者：王秀丽 黄瑾 王晓红 张丽华 黄利军
单位：130041 长春，白求恩医科大学第二临床学院呼吸内科(王秀丽、黄瑾)；哈尔滨医科大学第一临床学院变态反应科(王晓红、张丽华、黄利军)
关键词：
中华内科杂志990217 多种炎性细胞和介质参与哮喘发病过程，其中以肥大细胞、嗜酸细胞和T淋巴细胞为主要效应细胞，在这些细胞的相互作用中已有人提出T淋巴细胞可能具有中枢性调节作用[1]。然而不同T淋巴细胞亚群所发挥的功能作用不尽相同，CD+8 T淋巴细胞是抑制性T淋巴细胞亚群，CD+4 T淋巴细胞为辅助性T淋巴细胞，它可进一步分为记忆性T淋巴细胞(CD+4CD45RO+)和幼稚性T淋巴细胞(CD+4CD45RA+)，为探讨上述T淋巴细胞亚群在哮喘发病中的免疫调控作用，选择嗜酸细胞阳离子蛋白(ECP)作为反映嗜酸细胞的功能指标，测定活化前后T淋巴细胞亚群与嗜酸细胞混合培养上清液中ECP含量的变化。
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一、对象和方法
1.研究对象：哮喘组：支气管哮喘病人11例，男6例，女5例，年龄21～42岁，平均年龄34岁，均为我院住院及门诊病人，符合1997年全国哮喘会议修订的诊断标准[2]。健康对照组10例，男5例，女5例，年龄20～38岁，平均年龄30岁，均为血站健康献血员。
2.主要试剂：抗CD8、CD4、CD3单抗为北京医科大学免疫室提供；抗CD45RO及抗CD45RA单抗购自美国Phar Mingen公司；右旋糖酐、硅化聚乙酰胺吡酪烷酮购自天象人生物制品销售公司；ECP试剂盒和CAP检测系统为法码西亚普强亚洲有限公司产品。
3.方法：(1)外周血T淋巴细胞亚群的分离和培养：无菌取外周静脉血10 ml，分离血清冻存备用，参照文献[3]分离外周血单个核细胞，贴壁去除单核细胞，利用尼龙毛柱法分离T淋巴细胞，利用抗体补体灭活法分离T淋巴细胞亚群，方法为将T淋巴细胞制成细胞悬液，分2孔置于24孔培养板中，分别加入抗CD4及抗CD8单抗，反应后加入兔补体血清，得到CD+8和CD+4 T淋巴细胞，再用同样方法将CD+4 T淋巴细胞分离为CD+4CD45RA+和CD+4CD45RO+ T淋巴细胞，将分离的T淋巴细胞亚群体外经抗CD3单抗刺激，非刺激的每孔细胞悬液浓度为2×105/ml，37℃ CO2环境中培养96小时后收上清液冻存备用。(2)外周血嗜酸细胞分离：无菌取健康人血400 ml，2份血加1份质量分数为3%的右旋糖酐，置室温30分钟使红细胞自然下沉，吸取上清液离心分离白细胞，用Ficoll液分离去除外周血单个核细胞(PBMC)，收取粒细胞部分用于硅化聚乙酰胺吡酪烷酮液分离提取嗜酸细胞，制成2×106/ml细胞悬液备用。(3)将上述嗜酸细胞悬液加入24孔培养板中，每孔0.5 ml，再加入冻存的T淋巴细胞亚群培养上清液0.5 ml，置37℃ CO2箱中混合培养96小时后收取培养上清液，用ECP试剂盒及CAP检测系统测定血清及细胞培养上清液中ECP含量。
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4.统计学方法：t检验。
二、结果
1.哮喘病人T淋巴细胞亚群未经抗CD3单抗刺激时对ECP产生的影响：见表1。表1结果表明，CD+4CD45RO+ T淋巴细胞亚群在哮喘组嗜酸细胞产生ECP水平明显升高，与健康对照组比较，差异有显著性(P<0.05)，说明CD+4CD45RO+ T淋巴细胞对外周血嗜酸细胞分泌ECP具有辅助增强作用。CD+8 T淋巴细胞亚群在哮喘组嗜酸细胞分泌ECP水平也明显高于健康对照组(P<0.05)，说明哮喘病人CD+8 T淋巴细胞对嗜酸细胞功能抑制作用减弱。而CD+4CD45RA+ T淋巴细胞对嗜酸细胞分泌ECP水平与健康对照组无明显差别，哮喘病人血清ECP水平虽然较健康人升高，但差异无显著性。
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表1 哮喘病人T淋巴细胞亚群对ECP产生的影响(μg/L，
±s) 组别
例数
ECP
CD+4CD45RA+
CD+4CD45RO+
CD+8
血清
哮喘组
, 百拇医药
11
197±79
278±127
224±67
106±38
健康对照组
10
214±97
168± 87
161±52
95±25
t值
0.44
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2.29
2.40
0.77
P值
>0.05
<0.05
<0.05
>0.05
注：ECP：嗜酸细胞阳离子蛋白
2.哮喘病人T淋巴细胞亚群体外经抗CD3单抗刺激后对ECP产生的影响：见表2。表2结果表明，哮喘组和健康对照组无明显差别。
表2 哮喘病人T淋巴细胞亚群体外经抗CD3单抗刺激后
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对ECP产生的影响(μg/L，±s) 组别
例数
ECP
CD+4CD45RA+
CD+4CD45RO+
CD+8
哮喘组
11
, 百拇医药 196±59
247±149
233±123
健康对照组
10
201±53
175± 51
206±133
t值
0.20
1.45
0.48
P值
, http://www.100md.com
>0.05
>0.05
>0.05
注：ECP：嗜酸细胞阳离子蛋白
讨论 支气管哮喘是气道变应性炎症，多种细胞和介质引发哮喘，T淋巴细胞作为免疫效应细胞，分泌多种细胞因子，可能发挥重要的免疫调控作用，然而不同T淋巴细胞亚群功能不同，探讨各细胞亚群在哮喘中所发挥的不同功能变化对于揭示哮喘的发生发展规律具有重要意义。嗜酸细胞及其ECP在哮喘发病中的变化及作用已被广泛研究并得到公认，因此选择ECP作为观察指标可以比较准确的反映T淋巴细胞各亚群对嗜酸细胞的调控作用。
CD+4 T淋巴细胞亚群功能不完全相同，早期认为CD+4CD45RA+ T淋巴细胞功能作用不明显，发挥辅助作用的主要是CD+4CD45RO+ T淋巴细胞亚群，但近年来有文章报道，CD+4CD45RA+ T淋巴细胞亚群可以诱导B淋巴细胞产生IgE[4]，也有报道在变态反应性疾病中发生数目变化[5]。本研究结果发现，CD+4CD45RO+ T淋巴细胞对ECP产生辅助作用明显增强，而CD+4CD45RA+ T淋巴细胞对ECP无明显作用，说明CD+4 T淋巴细胞对于外周血嗜酸细胞产生ECP具有辅助作用的主要是CD+4CD45RO+ T淋巴细胞亚群。
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CD+8 T淋巴细胞亚群一般情况下对其他免疫活性细胞起抑制作用，本研究结果表明，哮喘病人CD+8 T淋巴细胞对嗜酸细胞产生ECP抑制作用减弱，ECP生成增多。
哮喘病人CD+8 T淋巴细胞抑制功能减弱与CD+4CD45RO+ T淋巴细胞辅助功能增强的结果，均使血嗜酸细胞产生ECP增多，说明嗜酸细胞的功能变化受T淋巴细胞的调控，T淋巴细胞发挥调控作用可能与其分泌的细胞因子有关，但哪些细胞因子发挥作用尚不清楚，因此本实验用T淋巴细胞亚群培养上清液与嗜酸细胞混合培养后检测ECP，观察T淋巴细胞亚群可能发挥的功能作用，为研究哮喘发病机制提供新的理论依据。实验发现，T淋巴细胞亚群体外经抗CD3单抗刺激后对嗜酸细胞产生ECP的影响与健康对照组比较，无明显差别，而不用抗CD3单抗刺激的T淋巴细胞则表现出对ECP产生的影响作用，能否提示T淋巴细胞不同亚群CD3功能群的差异与哮喘发病机制存在一定的关系，具体机制有待于进一步研究。
, 百拇医药
参考文献
1 Walker C, Virchow Jc Jr, Pieter LB, et al. T cell subsets and their soluble products regulate eosinophilia inallergic and nonallergic asthma. J Immunology, 1991,146：1829-1835.
2 支气管哮喘防治指南.支气管哮喘的定义、诊断、治疗、疗效判断标准及教育和管理方案.中华结核和呼吸杂志，1997，20：261-265.
3 杨景山.医学细胞化学与细胞生物技术.北京：北京医科大学、中国协和医科大学联合出版社，1990.11-12.
4 Brinkmann V, Kristofic C. TCR-stimulated naive human CD4+45RO-T cells develop into effector cells that secrete IL-13, IL-5, and IFN-gammar, but no IL-4, and help efficient IgE production by B cells. J Immunol, 1995,154：3078-3087.
5 Schauer U, Jung T, Heymanns J, et al. Imbalance of CD4+CD45R+ and CD4+CD29+ T helper cell subsets in patients with atopic diseases. Clin Exp Immunol, 1991,83：25-29.
(收稿：1998-02-22 修回：1998-10-20), 百拇医药
单位：130041 长春，白求恩医科大学第二临床学院呼吸内科(王秀丽、黄瑾)；哈尔滨医科大学第一临床学院变态反应科(王晓红、张丽华、黄利军)
关键词：
中华内科杂志990217 多种炎性细胞和介质参与哮喘发病过程，其中以肥大细胞、嗜酸细胞和T淋巴细胞为主要效应细胞，在这些细胞的相互作用中已有人提出T淋巴细胞可能具有中枢性调节作用[1]。然而不同T淋巴细胞亚群所发挥的功能作用不尽相同，CD+8 T淋巴细胞是抑制性T淋巴细胞亚群，CD+4 T淋巴细胞为辅助性T淋巴细胞，它可进一步分为记忆性T淋巴细胞(CD+4CD45RO+)和幼稚性T淋巴细胞(CD+4CD45RA+)，为探讨上述T淋巴细胞亚群在哮喘发病中的免疫调控作用，选择嗜酸细胞阳离子蛋白(ECP)作为反映嗜酸细胞的功能指标，测定活化前后T淋巴细胞亚群与嗜酸细胞混合培养上清液中ECP含量的变化。
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一、对象和方法
1.研究对象：哮喘组：支气管哮喘病人11例，男6例，女5例，年龄21～42岁，平均年龄34岁，均为我院住院及门诊病人，符合1997年全国哮喘会议修订的诊断标准[2]。健康对照组10例，男5例，女5例，年龄20～38岁，平均年龄30岁，均为血站健康献血员。
2.主要试剂：抗CD8、CD4、CD3单抗为北京医科大学免疫室提供；抗CD45RO及抗CD45RA单抗购自美国Phar Mingen公司；右旋糖酐、硅化聚乙酰胺吡酪烷酮购自天象人生物制品销售公司；ECP试剂盒和CAP检测系统为法码西亚普强亚洲有限公司产品。
3.方法：(1)外周血T淋巴细胞亚群的分离和培养：无菌取外周静脉血10 ml，分离血清冻存备用，参照文献[3]分离外周血单个核细胞，贴壁去除单核细胞，利用尼龙毛柱法分离T淋巴细胞，利用抗体补体灭活法分离T淋巴细胞亚群，方法为将T淋巴细胞制成细胞悬液，分2孔置于24孔培养板中，分别加入抗CD4及抗CD8单抗，反应后加入兔补体血清，得到CD+8和CD+4 T淋巴细胞，再用同样方法将CD+4 T淋巴细胞分离为CD+4CD45RA+和CD+4CD45RO+ T淋巴细胞，将分离的T淋巴细胞亚群体外经抗CD3单抗刺激，非刺激的每孔细胞悬液浓度为2×105/ml，37℃ CO2环境中培养96小时后收上清液冻存备用。(2)外周血嗜酸细胞分离：无菌取健康人血400 ml，2份血加1份质量分数为3%的右旋糖酐，置室温30分钟使红细胞自然下沉，吸取上清液离心分离白细胞，用Ficoll液分离去除外周血单个核细胞(PBMC)，收取粒细胞部分用于硅化聚乙酰胺吡酪烷酮液分离提取嗜酸细胞，制成2×106/ml细胞悬液备用。(3)将上述嗜酸细胞悬液加入24孔培养板中，每孔0.5 ml，再加入冻存的T淋巴细胞亚群培养上清液0.5 ml，置37℃ CO2箱中混合培养96小时后收取培养上清液，用ECP试剂盒及CAP检测系统测定血清及细胞培养上清液中ECP含量。
, 百拇医药
4.统计学方法：t检验。
二、结果
1.哮喘病人T淋巴细胞亚群未经抗CD3单抗刺激时对ECP产生的影响：见表1。表1结果表明，CD+4CD45RO+ T淋巴细胞亚群在哮喘组嗜酸细胞产生ECP水平明显升高，与健康对照组比较，差异有显著性(P<0.05)，说明CD+4CD45RO+ T淋巴细胞对外周血嗜酸细胞分泌ECP具有辅助增强作用。CD+8 T淋巴细胞亚群在哮喘组嗜酸细胞分泌ECP水平也明显高于健康对照组(P<0.05)，说明哮喘病人CD+8 T淋巴细胞对嗜酸细胞功能抑制作用减弱。而CD+4CD45RA+ T淋巴细胞对嗜酸细胞分泌ECP水平与健康对照组无明显差别，哮喘病人血清ECP水平虽然较健康人升高，但差异无显著性。
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表1 哮喘病人T淋巴细胞亚群对ECP产生的影响(μg/L，
±s) 组别例数
ECP
CD+4CD45RA+
CD+4CD45RO+
CD+8
血清
哮喘组
, 百拇医药
11
197±79
278±127
224±67
106±38
健康对照组
10
214±97
168± 87
161±52
95±25
t值
0.44
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2.29
2.40
0.77
P值
>0.05
<0.05
<0.05
>0.05
注：ECP：嗜酸细胞阳离子蛋白
2.哮喘病人T淋巴细胞亚群体外经抗CD3单抗刺激后对ECP产生的影响：见表2。表2结果表明，哮喘组和健康对照组无明显差别。
表2 哮喘病人T淋巴细胞亚群体外经抗CD3单抗刺激后
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对ECP产生的影响(μg/L，
±s) 组别例数
ECP
CD+4CD45RA+
CD+4CD45RO+
CD+8
哮喘组
11
, 百拇医药 196±59
247±149
233±123
健康对照组
10
201±53
175± 51
206±133
t值
0.20
1.45
0.48
P值
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>0.05
>0.05
>0.05
注：ECP：嗜酸细胞阳离子蛋白
讨论 支气管哮喘是气道变应性炎症，多种细胞和介质引发哮喘，T淋巴细胞作为免疫效应细胞，分泌多种细胞因子，可能发挥重要的免疫调控作用，然而不同T淋巴细胞亚群功能不同，探讨各细胞亚群在哮喘中所发挥的不同功能变化对于揭示哮喘的发生发展规律具有重要意义。嗜酸细胞及其ECP在哮喘发病中的变化及作用已被广泛研究并得到公认，因此选择ECP作为观察指标可以比较准确的反映T淋巴细胞各亚群对嗜酸细胞的调控作用。
CD+4 T淋巴细胞亚群功能不完全相同，早期认为CD+4CD45RA+ T淋巴细胞功能作用不明显，发挥辅助作用的主要是CD+4CD45RO+ T淋巴细胞亚群，但近年来有文章报道，CD+4CD45RA+ T淋巴细胞亚群可以诱导B淋巴细胞产生IgE[4]，也有报道在变态反应性疾病中发生数目变化[5]。本研究结果发现，CD+4CD45RO+ T淋巴细胞对ECP产生辅助作用明显增强，而CD+4CD45RA+ T淋巴细胞对ECP无明显作用，说明CD+4 T淋巴细胞对于外周血嗜酸细胞产生ECP具有辅助作用的主要是CD+4CD45RO+ T淋巴细胞亚群。
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CD+8 T淋巴细胞亚群一般情况下对其他免疫活性细胞起抑制作用，本研究结果表明，哮喘病人CD+8 T淋巴细胞对嗜酸细胞产生ECP抑制作用减弱，ECP生成增多。
哮喘病人CD+8 T淋巴细胞抑制功能减弱与CD+4CD45RO+ T淋巴细胞辅助功能增强的结果，均使血嗜酸细胞产生ECP增多，说明嗜酸细胞的功能变化受T淋巴细胞的调控，T淋巴细胞发挥调控作用可能与其分泌的细胞因子有关，但哪些细胞因子发挥作用尚不清楚，因此本实验用T淋巴细胞亚群培养上清液与嗜酸细胞混合培养后检测ECP，观察T淋巴细胞亚群可能发挥的功能作用，为研究哮喘发病机制提供新的理论依据。实验发现，T淋巴细胞亚群体外经抗CD3单抗刺激后对嗜酸细胞产生ECP的影响与健康对照组比较，无明显差别，而不用抗CD3单抗刺激的T淋巴细胞则表现出对ECP产生的影响作用，能否提示T淋巴细胞不同亚群CD3功能群的差异与哮喘发病机制存在一定的关系，具体机制有待于进一步研究。
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参考文献
1 Walker C, Virchow Jc Jr, Pieter LB, et al. T cell subsets and their soluble products regulate eosinophilia inallergic and nonallergic asthma. J Immunology, 1991,146：1829-1835.
2 支气管哮喘防治指南.支气管哮喘的定义、诊断、治疗、疗效判断标准及教育和管理方案.中华结核和呼吸杂志，1997，20：261-265.
3 杨景山.医学细胞化学与细胞生物技术.北京：北京医科大学、中国协和医科大学联合出版社，1990.11-12.
4 Brinkmann V, Kristofic C. TCR-stimulated naive human CD4+45RO-T cells develop into effector cells that secrete IL-13, IL-5, and IFN-gammar, but no IL-4, and help efficient IgE production by B cells. J Immunol, 1995,154：3078-3087.
5 Schauer U, Jung T, Heymanns J, et al. Imbalance of CD4+CD45R+ and CD4+CD29+ T helper cell subsets in patients with atopic diseases. Clin Exp Immunol, 1991,83：25-29.
(收稿：1998-02-22 修回：1998-10-20), 百拇医药