加强人胰岛素样生长因子Ⅱ基因启动子与肝细胞癌变关系的研究
作者：杨冬华
单位：510282 广州，第一军医大学珠江医院消化内科
关键词：
中华内科杂志990202 原发性肝癌(HCC)的癌变是一个涉及多基因、多病因、多步骤的复杂过程。乙型肝炎病毒(HBV)是HCC发生的重要致癌因子之一，80%～90%的HCC细胞中均含有HBV DNA整合，但HBV致癌的机制尚不清楚。癌基因的激活在肿瘤形成中起着重要作用，某些肿瘤存在原癌基因的扩增、异位、缺失、突变、过表达等改变。因此，基因结构的改变和生长因子的调控异常与肿瘤的发生学关系密切。
近年来国内外研究证明，人胰岛素样生长因子Ⅱ(IGF-Ⅱ)是IGFs基因家族中与肝细胞早期癌变关系最为密切的成员。成熟的IGF-Ⅱ是由67个氨基酸组成的单链多肽，分子量75 000，是调节胚胎生长发育必需的生长因子之一，肝脏是合成和分泌IGF-Ⅱ的主要器官。人IGF-Ⅱ基因位于染色体11p15.5，是由30 kb组成的父源印迹性单拷贝基因，内含至少9个外显子(E1～9)和4个不同的启动子(P1～4)，编码5种5′非翻译区不同的IGF-Ⅱ mRNA。P1调控E1～3、E7～9，表达5.3 kb的IGF-Ⅱ mRNA；P2调控E4、E7～9，表达5.0 kb IGF-Ⅱ mRNA；P3调控E5、E7～9，表达6.0 kb和2.2 kb IGF-Ⅱ mRNA；P4调控E6～9，表达4.8 kb的IGF-Ⅱ mRNA。IGF-Ⅱ表达受多种因素共同调控，转录水平是调控的关键。在生长发育过程中，4个启动子不同的生物学活性，具有组织特异性和发育阶段独立性的表达特征。胎肝和新生儿肝脏中活性表达的启动子主要为P3，由P3启动转录，产生大量IGF-Ⅱ，促进胚胎的生长发育。出生后随着年龄增长呈向下调节，70%成人肝脏中P3呈关闭状态，仅极少部分呈微量表达。随着年龄增长，人体对IGF-Ⅱ需求相应减少，逐渐呈向上调节，因此，IGF-Ⅱ在成人正常肝组织中主要表达为P1。P2和P4在不同的生长发育阶段呈不同水平的表达。近来关于IGF-Ⅱ启动子特异性调节的研究证明，P3是以细胞生长依赖的方式转录表达，P4则作为“看家”启动子呈保守状态，因此在整个生长发育阶段呈恒定的表达。IGF-Ⅱ印迹也具有启动子特异性，P1活性来自双重等位基因，P2、P3和P4则来自一个等位基因。其中P1和P3在不同的生长发育阶段起着启闭的关键性作用，虽然4个启动子有着不同的生物学功能，表达的蛋白产物近似相同，但确切的作用迄今仍不清楚[1，2]。
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近来研究证明，IGF-Ⅱ是肝癌细胞或瘤株维持和加速生长的自分泌或旁分泌生长因子之一，IGF-Ⅱ的过量表达与肝细胞的恶性转化和自主性生长的生物学行为有关。我们曾从转录水平、蛋白水平和细胞水平，并结合有或无HBV感染背景，系统地观察了IGF-Ⅱ及其作用的受体在慢性活动性肝炎、肝硬化、肝癌和癌旁肝组织中的表达，发现在肝细胞癌变过程中，IGF-Ⅱ基因呈胚胎性过量表达，该特征提示了肝细胞发生异常增殖和分化的某阶段再次激活已关闭的启动子P3而产生胚胎表型的逆转，导致类似胚胎样细胞的表达，可能与自分泌生长刺激机制对肝细胞的分化调节方式有关。值得注意的是该现象在癌旁肝组织不典型增生肝细胞中尤为显著，可能与P3异常启动有关。因此我们认为IGF-Ⅱ基因的异常激活和过表达，促使具有高增殖活性状态的癌前肝细胞向肝癌细胞转化，最终导致肝癌的发生。同时我们亦观察到IGF-Ⅱ mRNA表达水平的高低与肝细胞的分化程度呈负相关现象，分化程度越低则IGF-Ⅱ表达水平越高，预示形成细胞癌变的可能性越大，因此过量表达的IGF-Ⅱ可作为肝细胞癌前病变的警视信号[3，4]。近来Li等[2]亦证实人HCC中70%的IGF-Ⅱ P1活性缺失，该特征属于肝细胞癌变的早期事件，可作为肝癌临床早期诊断的标志，但确切的转化调控机制及其因果关系，仍在探索中。Kim等[5]研究认为肝硬变再生结节和肝癌细胞的快速分裂导致肝脏供血不足，造成局部缺氧状态，促使IGF-Ⅱ合成增强，并作为血管活性因子，间接促进血管内皮生长因子的合成，刺激HCC新生肿瘤血管的形成，从而使P3、P4呈过量表达状态，但启动子对IGF-Ⅱ过量表达的特异性调节机制仍不清楚。
, 百拇医药
P3再次激活取代P1的始动原因目前尚未肯定，亦无直接的证据。我们曾观察到：(1)HBV DNA整合或(和)HBxAg阳性的癌旁肝组织和肝癌组织中，IGF-Ⅱ表达明显增高；(2)IGF-Ⅱ异常表达的肝癌细胞中存在染色体11p的缺失、重排及11p13、11p15脆性位点和癌断点；(3)聚合酶链反应-单链构型多态性技术初步检测了2、3、4外显子的单链多态性改变，未见结构变异。国内外研究亦发现HBV、HCV感染、HBxAg表达与肝癌中IGF-Ⅱ异常表达相关的现象[6，7]，但均未能从根本上阐明其因果关系。国外曾报道肝癌细胞株或其他肿瘤中IGF-Ⅱ异常表达与IGF-Ⅱ基因的去甲基化和遗传印迹缺失(LOI)或遗传印迹松弛有关。体外转染试验表明：(1)P3能被Wt1、Ap-1复合物激活但可被野生型p53和Wt1基因抑制；(2)P4能被Wt1抑制而被蛋白磷酸酶抑制剂激活；(3)CCAAT/Enhancer结合蛋白则可反式激活P1[8]。近来研究认为，人HCC和肝癌细胞株中LOI呈散在性现象，发生率低，可能与IGF-Ⅱ过表达无关[2]。因此，HCC发生及发展的演变过程与LOI发生频率是否存在特异性关系，仍待进一步证实。国内曾报道肝癌中发现由P3调控转录的IGF-Ⅱ cDNA变异体，但不清楚是否存在于正常肝组织以及该变异体在肝细胞癌变中的作用[9]。
, 百拇医药
我们认为IGF-Ⅱ基因结构、尤其是启动子调控区域的改变或突变可能对肝细胞癌变过程中P3再次被激活和P1活性缺失具有重要作用。因此，深入探讨肝细胞癌变演化过程中IGF-Ⅱ基因启动子的结构、功能和突变与IGF-Ⅱ基因异常激活及胚胎性过量表达的调控机制，以及HBV DNA感染或整合与IGF-Ⅱ基因启动子异常表达机制之间始动或促动的因果关系，对进一步阐明IGF-Ⅱ基因在肝细胞癌变过程中的本质，探讨肝癌癌变的机制，指导肝癌高危人群的防治监测和临床早期诊治具有重要的意义。
参考文献
1 Li X, Cui H, Sandstedt B, et al. Expression levels of the insulin-like growth factor Ⅱ gene (IGF-Ⅱ) in the human liver: development relationships of the four promoters. J Endocrinol, 1996,149：117-124.
, 百拇医药
2 Li X, Nong Z, Ekstrom C, et al. Disrupted IGF2 promoter control by silencing of promoter P1 in human hepatocellular carcinoma. Cancer Res, 1997,57：2048-2054.
3 Yang DH, Liu WW, Gu JR, et al. The expression of the products of IGF-Ⅱ, IGF-Ⅱ receptors and CSF-1 receptors in human primary hepatocellular carcinoma and juxtacancerous liver tissue. J Med Coll PLA, 1993,8：368-376.
4 Yang DH, Xiu C, Yang B, et al. Expression of insulin-like growth factor Ⅱ and its receptors in liver cells of chronic liver diseases. China Natl J N Gastroenterol, 1997,3：117-118.
, 百拇医药
5 Kim KW, Bae SK, Lee OH, et al. Insulin-like growth factor Ⅱ induced by hypoxia may contribute to angiogenesis of human hepatocellular carcinoma. Cancer Res, 1998,58：348-351.
6 Su Q, Liu YF, Zhang JF, et al. Expression of insulin like growth factor Ⅱ in hepatitis B, cirrhosis and hepatocellular carcinoma: its relationship with hepatitis B virus antigen expression. Hepatology, 1994,20：788-799.
7 Nardone G, Romano M, Calabro A, et al. Activation of fetal promoter of insulin-like growth factor Ⅱ gene in hepatitis C virus-related chronic hepatitis, cirrhosis and hepatocellular carcinoma. Hepatology, 1996,23：1304-1312.
8 Rietveld LE, Holthuizen PE, Sussenbach S. Identification of a key regulatory element for the basal activity of the human insulin-like growth factor Ⅱ gene promoter P3. Biochem J, 1997,327：689-697.
9 陈思红，周筱梅，李岱宗，等.人肝癌组织IGF-Ⅱ cDNA变异体的克隆和顺序分析.科学通报，1994，39：664-666.
(收稿：1998-09-26 修回：1998-11-10), 百拇医药
单位：510282 广州，第一军医大学珠江医院消化内科
关键词：
中华内科杂志990202 原发性肝癌(HCC)的癌变是一个涉及多基因、多病因、多步骤的复杂过程。乙型肝炎病毒(HBV)是HCC发生的重要致癌因子之一，80%～90%的HCC细胞中均含有HBV DNA整合，但HBV致癌的机制尚不清楚。癌基因的激活在肿瘤形成中起着重要作用，某些肿瘤存在原癌基因的扩增、异位、缺失、突变、过表达等改变。因此，基因结构的改变和生长因子的调控异常与肿瘤的发生学关系密切。
近年来国内外研究证明，人胰岛素样生长因子Ⅱ(IGF-Ⅱ)是IGFs基因家族中与肝细胞早期癌变关系最为密切的成员。成熟的IGF-Ⅱ是由67个氨基酸组成的单链多肽，分子量75 000，是调节胚胎生长发育必需的生长因子之一，肝脏是合成和分泌IGF-Ⅱ的主要器官。人IGF-Ⅱ基因位于染色体11p15.5，是由30 kb组成的父源印迹性单拷贝基因，内含至少9个外显子(E1～9)和4个不同的启动子(P1～4)，编码5种5′非翻译区不同的IGF-Ⅱ mRNA。P1调控E1～3、E7～9，表达5.3 kb的IGF-Ⅱ mRNA；P2调控E4、E7～9，表达5.0 kb IGF-Ⅱ mRNA；P3调控E5、E7～9，表达6.0 kb和2.2 kb IGF-Ⅱ mRNA；P4调控E6～9，表达4.8 kb的IGF-Ⅱ mRNA。IGF-Ⅱ表达受多种因素共同调控，转录水平是调控的关键。在生长发育过程中，4个启动子不同的生物学活性，具有组织特异性和发育阶段独立性的表达特征。胎肝和新生儿肝脏中活性表达的启动子主要为P3，由P3启动转录，产生大量IGF-Ⅱ，促进胚胎的生长发育。出生后随着年龄增长呈向下调节，70%成人肝脏中P3呈关闭状态，仅极少部分呈微量表达。随着年龄增长，人体对IGF-Ⅱ需求相应减少，逐渐呈向上调节，因此，IGF-Ⅱ在成人正常肝组织中主要表达为P1。P2和P4在不同的生长发育阶段呈不同水平的表达。近来关于IGF-Ⅱ启动子特异性调节的研究证明，P3是以细胞生长依赖的方式转录表达，P4则作为“看家”启动子呈保守状态，因此在整个生长发育阶段呈恒定的表达。IGF-Ⅱ印迹也具有启动子特异性，P1活性来自双重等位基因，P2、P3和P4则来自一个等位基因。其中P1和P3在不同的生长发育阶段起着启闭的关键性作用，虽然4个启动子有着不同的生物学功能，表达的蛋白产物近似相同，但确切的作用迄今仍不清楚[1，2]。
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近来研究证明，IGF-Ⅱ是肝癌细胞或瘤株维持和加速生长的自分泌或旁分泌生长因子之一，IGF-Ⅱ的过量表达与肝细胞的恶性转化和自主性生长的生物学行为有关。我们曾从转录水平、蛋白水平和细胞水平，并结合有或无HBV感染背景，系统地观察了IGF-Ⅱ及其作用的受体在慢性活动性肝炎、肝硬化、肝癌和癌旁肝组织中的表达，发现在肝细胞癌变过程中，IGF-Ⅱ基因呈胚胎性过量表达，该特征提示了肝细胞发生异常增殖和分化的某阶段再次激活已关闭的启动子P3而产生胚胎表型的逆转，导致类似胚胎样细胞的表达，可能与自分泌生长刺激机制对肝细胞的分化调节方式有关。值得注意的是该现象在癌旁肝组织不典型增生肝细胞中尤为显著，可能与P3异常启动有关。因此我们认为IGF-Ⅱ基因的异常激活和过表达，促使具有高增殖活性状态的癌前肝细胞向肝癌细胞转化，最终导致肝癌的发生。同时我们亦观察到IGF-Ⅱ mRNA表达水平的高低与肝细胞的分化程度呈负相关现象，分化程度越低则IGF-Ⅱ表达水平越高，预示形成细胞癌变的可能性越大，因此过量表达的IGF-Ⅱ可作为肝细胞癌前病变的警视信号[3，4]。近来Li等[2]亦证实人HCC中70%的IGF-Ⅱ P1活性缺失，该特征属于肝细胞癌变的早期事件，可作为肝癌临床早期诊断的标志，但确切的转化调控机制及其因果关系，仍在探索中。Kim等[5]研究认为肝硬变再生结节和肝癌细胞的快速分裂导致肝脏供血不足，造成局部缺氧状态，促使IGF-Ⅱ合成增强，并作为血管活性因子，间接促进血管内皮生长因子的合成，刺激HCC新生肿瘤血管的形成，从而使P3、P4呈过量表达状态，但启动子对IGF-Ⅱ过量表达的特异性调节机制仍不清楚。
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P3再次激活取代P1的始动原因目前尚未肯定，亦无直接的证据。我们曾观察到：(1)HBV DNA整合或(和)HBxAg阳性的癌旁肝组织和肝癌组织中，IGF-Ⅱ表达明显增高；(2)IGF-Ⅱ异常表达的肝癌细胞中存在染色体11p的缺失、重排及11p13、11p15脆性位点和癌断点；(3)聚合酶链反应-单链构型多态性技术初步检测了2、3、4外显子的单链多态性改变，未见结构变异。国内外研究亦发现HBV、HCV感染、HBxAg表达与肝癌中IGF-Ⅱ异常表达相关的现象[6，7]，但均未能从根本上阐明其因果关系。国外曾报道肝癌细胞株或其他肿瘤中IGF-Ⅱ异常表达与IGF-Ⅱ基因的去甲基化和遗传印迹缺失(LOI)或遗传印迹松弛有关。体外转染试验表明：(1)P3能被Wt1、Ap-1复合物激活但可被野生型p53和Wt1基因抑制；(2)P4能被Wt1抑制而被蛋白磷酸酶抑制剂激活；(3)CCAAT/Enhancer结合蛋白则可反式激活P1[8]。近来研究认为，人HCC和肝癌细胞株中LOI呈散在性现象，发生率低，可能与IGF-Ⅱ过表达无关[2]。因此，HCC发生及发展的演变过程与LOI发生频率是否存在特异性关系，仍待进一步证实。国内曾报道肝癌中发现由P3调控转录的IGF-Ⅱ cDNA变异体，但不清楚是否存在于正常肝组织以及该变异体在肝细胞癌变中的作用[9]。
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我们认为IGF-Ⅱ基因结构、尤其是启动子调控区域的改变或突变可能对肝细胞癌变过程中P3再次被激活和P1活性缺失具有重要作用。因此，深入探讨肝细胞癌变演化过程中IGF-Ⅱ基因启动子的结构、功能和突变与IGF-Ⅱ基因异常激活及胚胎性过量表达的调控机制，以及HBV DNA感染或整合与IGF-Ⅱ基因启动子异常表达机制之间始动或促动的因果关系，对进一步阐明IGF-Ⅱ基因在肝细胞癌变过程中的本质，探讨肝癌癌变的机制，指导肝癌高危人群的防治监测和临床早期诊治具有重要的意义。
参考文献
1 Li X, Cui H, Sandstedt B, et al. Expression levels of the insulin-like growth factor Ⅱ gene (IGF-Ⅱ) in the human liver: development relationships of the four promoters. J Endocrinol, 1996,149：117-124.
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2 Li X, Nong Z, Ekstrom C, et al. Disrupted IGF2 promoter control by silencing of promoter P1 in human hepatocellular carcinoma. Cancer Res, 1997,57：2048-2054.
3 Yang DH, Liu WW, Gu JR, et al. The expression of the products of IGF-Ⅱ, IGF-Ⅱ receptors and CSF-1 receptors in human primary hepatocellular carcinoma and juxtacancerous liver tissue. J Med Coll PLA, 1993,8：368-376.
4 Yang DH, Xiu C, Yang B, et al. Expression of insulin-like growth factor Ⅱ and its receptors in liver cells of chronic liver diseases. China Natl J N Gastroenterol, 1997,3：117-118.
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5 Kim KW, Bae SK, Lee OH, et al. Insulin-like growth factor Ⅱ induced by hypoxia may contribute to angiogenesis of human hepatocellular carcinoma. Cancer Res, 1998,58：348-351.
6 Su Q, Liu YF, Zhang JF, et al. Expression of insulin like growth factor Ⅱ in hepatitis B, cirrhosis and hepatocellular carcinoma: its relationship with hepatitis B virus antigen expression. Hepatology, 1994,20：788-799.
7 Nardone G, Romano M, Calabro A, et al. Activation of fetal promoter of insulin-like growth factor Ⅱ gene in hepatitis C virus-related chronic hepatitis, cirrhosis and hepatocellular carcinoma. Hepatology, 1996,23：1304-1312.
8 Rietveld LE, Holthuizen PE, Sussenbach S. Identification of a key regulatory element for the basal activity of the human insulin-like growth factor Ⅱ gene promoter P3. Biochem J, 1997,327：689-697.
9 陈思红，周筱梅，李岱宗，等.人肝癌组织IGF-Ⅱ cDNA变异体的克隆和顺序分析.科学通报，1994，39：664-666.
(收稿：1998-09-26 修回：1998-11-10), 百拇医药