急性白血病患者WT1基因表达的临床意义
作者：郭晓楠 徐世荣 董作仁 任金海 林凤茹 姚尔固
单位：050000 石家庄，河北医科大学第二医院血液内科
关键词：
中华内科杂志990421 WT1基因是从Wilms瘤细胞的染色体11p13位点分离出来的肿瘤基因，但其在白血病的发生及发展中也起一定作用。虽然许多学者研究了WT1基因在白血病中的表达情况，但多数是关于WT1基因在白血病发病意义上的研究。关于WT1基因在急性白血病治疗反应方面的研究目前尚不多见，我们对此进行了探讨。
一、资料和方法
1. 研究对象：62例急性白血病患者中男36例，女26例，年龄(34.77±13.65)岁。急性髓细胞白血病 ( AML ) 53例，急性淋巴细胞白血病 ( ALL ) 9例，均为初治或复发病例。
, 百拇医药
15例健康志愿者外周血及8例非血液病患者的骨髓作为正常对照。其中男15例，女8例，年龄(34.57±6.83)岁。所有患者的骨髓及对照者的外周血或骨髓标本均进行了WT1基因的检测。
2. 方法：(1) 单个核细胞(MNC)的分离及总RNA的提取：取静脉血5～8 ml或骨髓2 ml进行单个核细胞的分离[1]。采用异硫氰酸胍-苯酚-氯仿一步法提取细胞总RNA[2]，-80℃保存。(2)cDNA合成及PCR扩增引物由美国Cybersyn公司合成。其中WT1上游引物为5′-CCCTGACCCTTCCCTTCT-3′，下游引物为5′-CCCGATGCCTTGCTCTCTGAT-3′，扩增产物的长度为182 bp。以β-肌动蛋白作为内对照，其上游引物为5′-CCCTTCCCTCCTCAGA-3′，下游引物为5′-TGTCACCTTCACCGTTCCAG-3′，扩增产物的长度为325 bp。cDNA合成及PCR反应按我院血研室法[1]。扩增条件：94℃变性40秒；WT 155℃退火40秒，β-肌动蛋白60℃退火40秒；72℃延伸60秒，在PCR扩增仪(美国PE公司)上扩增30个循环。取10 μl扩增产物，在2%琼脂糖凝胶上进行电泳(75 V，50分钟)，EB染色，紫外透射仪下观察结果并照相。
, 百拇医药
3. 临床治疗方案：ALL：初治患者用VCDP方案(长春新碱、环磷酰胺、柔红霉素、泼尼松)；复发患者用VCDEP方案(E为足叶已甙 ) 或AVM方案( 阿糖胞苷、Vm26、米托蒽醌)。AML：M3患者采用全反式维甲酸 ( ATRA ) 或以ATRA为主联用小剂量DA(柔红霉素、阿糖胞苷)或HA(高三尖杉酯碱)方案；其他亚型初治患者采用AD或ADE方案，复发患者采用AMV或AME方案。
4. 统计学处理：采用SPSS 6.0统计软件包，进行χ2检验、logistic回归分析及一般统计量的处理，数据以均值±标准差表示。
二、结果
1. 正常人及急性白血病患者WT1基因的表达：62例急性白血病患者中，35例WT1基因表达阳性(56.5%) 。9例ALL患者中，8例(88.9%) WT1基因表达阳性；53例AML患者中，27例(50.9%) WT1基因表达阳性，ALL与AML的WT1阳性表达率差异无显著性(P>0.05)；23例正常人外周血或骨髓细胞中均未检测到WT1 mRNA的表达，与病人表达率相比差异有显著性(P<0.001)。
, 百拇医药
2. WT1与完全缓解(CR)率的关系：35例WT1阳性表达患者中CR 20例(57.1%)，27例WT1阴性表达患者中CR 23例(85.2%)，两组差异有显著性(P=0.018)。对性别、年龄、FAB分型、外周血白细胞计数及WT1进行的logistic回归分析表明，WT1是惟一入选因素，WT1基因阳性表达患者未缓解的相对危险度为4.37。
讨论 WT1基因是Wilms瘤的易感基因。但近年的研究发现WT1在白血病细胞中高度表达，并与白血病的发生、发展及预后有一定关系。本研究发现，AML患者WT1阳性表达率为50.9%，ALL患者阳性表达率为88.9%；23例正常人的骨髓或外周血均未检测到WT1表达，与文献报道的结果一致[3，4]。说明WT1基因在未成熟的白血病细胞中呈高表达，随细胞的分化成熟逐渐降低，而趋于成熟的正常造血细胞很少表达或不表达。
为探讨急性白血病患者WT1基因的表达与化疗反应的关系，我们对性别、年龄、FAB分型、外周血白细胞计数及WT1进行了logistic回归分析。结果表明，WT1是影响CR率的惟一入选因素，WT1基因阳性表达患者未缓解的相对危险度为4.37。WT1阳性表达患者的完全缓解率明显低于阴性表达患者。Inoue等[4]发现，WT1基因相对表达水平≥0.6的急性白血病患者，其CR率(47.8%)明显低于相对表达水平<0.6(90.7%)的患者。King-Underwood等[5]亦发现WT1表达阳性的患者对化疗反应较差。这些学者的研究结果与我们的发现一致。
, 百拇医药
综上所述，WT1基因的表达与急性白血病患者的化疗反应密切相关，是影响白血病患者CR率的最重要危险因素之一。WT1基因表达阳性者，CR率低，预后差。
参考文献
1 董作仁，罗建民，徐文新，等.急性白血病患者多药耐药基因mdr1的表达及其临床意义.中华肿瘤杂志，1997,19:72-75.
2 Chomczynski P, Sacchi N. Single-step methods of RNA isolation by acid guanidiniun thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Ann Biochem, 1987, 162:156-159.
3 Miwa H, Beran M, Saunders GF, et al. Expression of the Wilms' tumor gene (WT1) in human leukemias. Leukemia, 1992, 6:405-409.
, 百拇医药
4 Inoue K, Sugiyama H, Ogawa H, et al. WT1 as a new prognostic factor and a new marker for the detection of minimal residual disease in acute leukemia. Blood, 1994, 84:3071-3079.
5 King-Underwood L, Renshaw J, Pritchard-Jones K, et al. Mutations in the Wilm's tumor gene WT1 in leukemias. Blood, 1996, 87:2171-2179.
(收稿：1998-04-14 修回：1998-07-13), 百拇医药
单位：050000 石家庄，河北医科大学第二医院血液内科
关键词：
中华内科杂志990421 WT1基因是从Wilms瘤细胞的染色体11p13位点分离出来的肿瘤基因，但其在白血病的发生及发展中也起一定作用。虽然许多学者研究了WT1基因在白血病中的表达情况，但多数是关于WT1基因在白血病发病意义上的研究。关于WT1基因在急性白血病治疗反应方面的研究目前尚不多见，我们对此进行了探讨。
一、资料和方法
1. 研究对象：62例急性白血病患者中男36例，女26例，年龄(34.77±13.65)岁。急性髓细胞白血病 ( AML ) 53例，急性淋巴细胞白血病 ( ALL ) 9例，均为初治或复发病例。
, 百拇医药
15例健康志愿者外周血及8例非血液病患者的骨髓作为正常对照。其中男15例，女8例，年龄(34.57±6.83)岁。所有患者的骨髓及对照者的外周血或骨髓标本均进行了WT1基因的检测。
2. 方法：(1) 单个核细胞(MNC)的分离及总RNA的提取：取静脉血5～8 ml或骨髓2 ml进行单个核细胞的分离[1]。采用异硫氰酸胍-苯酚-氯仿一步法提取细胞总RNA[2]，-80℃保存。(2)cDNA合成及PCR扩增引物由美国Cybersyn公司合成。其中WT1上游引物为5′-CCCTGACCCTTCCCTTCT-3′，下游引物为5′-CCCGATGCCTTGCTCTCTGAT-3′，扩增产物的长度为182 bp。以β-肌动蛋白作为内对照，其上游引物为5′-CCCTTCCCTCCTCAGA-3′，下游引物为5′-TGTCACCTTCACCGTTCCAG-3′，扩增产物的长度为325 bp。cDNA合成及PCR反应按我院血研室法[1]。扩增条件：94℃变性40秒；WT 155℃退火40秒，β-肌动蛋白60℃退火40秒；72℃延伸60秒，在PCR扩增仪(美国PE公司)上扩增30个循环。取10 μl扩增产物，在2%琼脂糖凝胶上进行电泳(75 V，50分钟)，EB染色，紫外透射仪下观察结果并照相。
, 百拇医药
3. 临床治疗方案：ALL：初治患者用VCDP方案(长春新碱、环磷酰胺、柔红霉素、泼尼松)；复发患者用VCDEP方案(E为足叶已甙 ) 或AVM方案( 阿糖胞苷、Vm26、米托蒽醌)。AML：M3患者采用全反式维甲酸 ( ATRA ) 或以ATRA为主联用小剂量DA(柔红霉素、阿糖胞苷)或HA(高三尖杉酯碱)方案；其他亚型初治患者采用AD或ADE方案，复发患者采用AMV或AME方案。
4. 统计学处理：采用SPSS 6.0统计软件包，进行χ2检验、logistic回归分析及一般统计量的处理，数据以均值±标准差表示。
二、结果
1. 正常人及急性白血病患者WT1基因的表达：62例急性白血病患者中，35例WT1基因表达阳性(56.5%) 。9例ALL患者中，8例(88.9%) WT1基因表达阳性；53例AML患者中，27例(50.9%) WT1基因表达阳性，ALL与AML的WT1阳性表达率差异无显著性(P>0.05)；23例正常人外周血或骨髓细胞中均未检测到WT1 mRNA的表达，与病人表达率相比差异有显著性(P<0.001)。
, 百拇医药
2. WT1与完全缓解(CR)率的关系：35例WT1阳性表达患者中CR 20例(57.1%)，27例WT1阴性表达患者中CR 23例(85.2%)，两组差异有显著性(P=0.018)。对性别、年龄、FAB分型、外周血白细胞计数及WT1进行的logistic回归分析表明，WT1是惟一入选因素，WT1基因阳性表达患者未缓解的相对危险度为4.37。
讨论 WT1基因是Wilms瘤的易感基因。但近年的研究发现WT1在白血病细胞中高度表达，并与白血病的发生、发展及预后有一定关系。本研究发现，AML患者WT1阳性表达率为50.9%，ALL患者阳性表达率为88.9%；23例正常人的骨髓或外周血均未检测到WT1表达，与文献报道的结果一致[3，4]。说明WT1基因在未成熟的白血病细胞中呈高表达，随细胞的分化成熟逐渐降低，而趋于成熟的正常造血细胞很少表达或不表达。
为探讨急性白血病患者WT1基因的表达与化疗反应的关系，我们对性别、年龄、FAB分型、外周血白细胞计数及WT1进行了logistic回归分析。结果表明，WT1是影响CR率的惟一入选因素，WT1基因阳性表达患者未缓解的相对危险度为4.37。WT1阳性表达患者的完全缓解率明显低于阴性表达患者。Inoue等[4]发现，WT1基因相对表达水平≥0.6的急性白血病患者，其CR率(47.8%)明显低于相对表达水平<0.6(90.7%)的患者。King-Underwood等[5]亦发现WT1表达阳性的患者对化疗反应较差。这些学者的研究结果与我们的发现一致。
, 百拇医药
综上所述，WT1基因的表达与急性白血病患者的化疗反应密切相关，是影响白血病患者CR率的最重要危险因素之一。WT1基因表达阳性者，CR率低，预后差。
参考文献
1 董作仁，罗建民，徐文新，等.急性白血病患者多药耐药基因mdr1的表达及其临床意义.中华肿瘤杂志，1997,19:72-75.
2 Chomczynski P, Sacchi N. Single-step methods of RNA isolation by acid guanidiniun thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Ann Biochem, 1987, 162:156-159.
3 Miwa H, Beran M, Saunders GF, et al. Expression of the Wilms' tumor gene (WT1) in human leukemias. Leukemia, 1992, 6:405-409.
, 百拇医药
4 Inoue K, Sugiyama H, Ogawa H, et al. WT1 as a new prognostic factor and a new marker for the detection of minimal residual disease in acute leukemia. Blood, 1994, 84:3071-3079.
5 King-Underwood L, Renshaw J, Pritchard-Jones K, et al. Mutations in the Wilm's tumor gene WT1 in leukemias. Blood, 1996, 87:2171-2179.
(收稿：1998-04-14 修回：1998-07-13), 百拇医药