血脂康对家兔血管成形术后内膜增殖及C-myc基因表达的影响
作者：齐国先 曾定尹 刘利 赵安乐 许波宁
单位：110001 沈阳，中国医科大学第一临床学院心血管内科
关键词：血管成形术；内膜增殖；基因；血脂康
中华内科杂志990803 【摘 要】 目的 探讨血脂康对家兔血管成形术后血管内膜增殖及C-myc基因表达的影响。方法 30只高胆固醇喂养4周的日本雄性大白兔，用球囊导管剥脱腹主动脉内皮4周后，对局部动脉粥样硬化狭窄部位行球囊成形术后随机分为对照组、高脂组和血脂康组。4周后采集局部血管行病理形态、反转录PCR法C-myc基因半定量及其C-myc蛋白免疫组化分析。结果 病理形态学观察血脂康组血管内膜面积小于对照组(P<0.05)，对照组血管内膜面积小于高脂组(P<0.05)，血脂康组C-myc基因水平及其蛋白阳性细胞百分比低于后两组(P<0.05)，而后两组水平接近(P>0.05)。结论 血脂康可抑制家兔血管成形术后内膜增殖及C-myc基因的表达。
, http://www.100md.com
The effects of Xuezhikang on neointimal proliferation and C-myc gene
expression after angioplasty in rabbits
QI Guoxian, ZENG Dingyin, LIU Li, et al.
Department of Cardiology, The First Affiliated Hospital of China Medical University, Shenyang 110001
【Abstract】 Objective To investigate the effects of Xuezhikang (XZhK) on the neointimal proliferation and C-myc gene expression after angioplasty in rabbits. Methods Angioplasty for atherosclerotic stenosis of celiac arteries was performed in 30 male white rabbits after being fed with cholesterol-supplemented diet for 8 weeks, which were then randomized to control group, high-cholesterol group and XZhK group. After 4 weeks， the local vessels were collected for morphological observation. C-myc mRNA level was measured with RT-PCR and C-myc protein with immunohistochemical analysis. Results Morphological observation showed that the neointimal area in the XZhK group were less than the control group(P<0.05), and that in control group were less than that in the high-cholesterol group (P<0.05). The levels of C-myc mRNA measured with RT-PCR and the percentage of C-myc protein positive cell by immunohistochemical analysis were lower in the XZhK group than in the control and high-cholesterol group (P<0.05), The levels in the latter two groups showed no difference(P>0.05). Conclusion XZhK can inhibit the neointimal proliferation and the expression of C-myc gene after angioplasty in rabbits.
, 百拇医药
【Key words】 Angioplasty Neointimal proliferation Gene Xuezhikang
血管成形术后血管中膜平滑肌细胞(SMC)增生，向内膜下迁移，分泌大量细胞外基质是引起新生内膜增厚发生再狭窄的主要机制[1]。血脂康具有他汀类药物的调血脂作用，并有明显的抗家兔动脉粥样硬化和抑制血管中膜SMC增生的作用[2]。本研究应用实验性家兔动脉粥样硬化后血管狭窄模型，经球囊血管成形术后，观察应用血脂康对血管内膜增生的影响，并探讨其对C-myc原癌基因表达的影响。
材料与方法
一、模型的建立和分组
1997年9～12月期间，选取日本雄性大白兔36只，体重2.5±0.5 kg，月龄6～8个月，经给予1.5g.kg-1.d-1高胆固醇饮食喂养4周后，用球囊导管剥脱主动脉内皮，继续高胆固醇饮食喂养4周，行腹主动脉造影，然后对血管狭窄部位进行球囊扩张，再经造影证实扩张满意为止。共成功建立30只血管成形术模型，随机分为对照组(普通饮食)、高脂组(普通饮食+高胆固醇)和治疗组(普通饮食+血脂康0.8 g.kg-1.d-1)，继续喂养4周后气栓处死。
, 百拇医药
二、标本采集和测定
1.血脂测定：于高胆固醇喂养前和喂养后4周、8周和12周处死前，外周动脉采血测定血清胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)，并计算低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)，计算公式LDL-C=TC-HDL-C-TG/2.2。血脂测定采用酶学方法。
2.病理标本：动物处死后,用10%甲醛原位股动脉内灌注固定，截取成形术部位血管标本固定，逐级脱水包埋，连续切片，用于病理形态学观察和免疫组化分析。逆转录PCR法测定局部血管标本中的C-myc mRNA的相对含量，以标准引物作为内参照，C-myc产物相对量=C-myc产物电泳条带密度/内参照产物电泳条带密度×100。以C-myc单克隆抗体SP法免疫组化染色，细胞核染成棕褐色的细胞为阳性细胞，高倍镜下(400×)计数每视野阳性细胞数占总细胞数的百分比。病理切片行弹力纤维染色，利用计算机图像分析系统分别测出新生内膜面积、中膜面积和管腔面积。
, 百拇医药
三、统计学分析
所有数据以均值±标准差(
±s)表示，组间和组内比较采用t检验。
结果
1.各组实验前后血脂水平改变：见表1。高脂喂养后3组中TC、TG、LDL-C均明显升高，12周后对照组下降，高脂组保持增高，治疗组与对照组相比，TC、LDL-C明显下降(P<0.05)。
表1 实验前后各组血脂水平的变化(mmol/L，±s) 血脂
实验前
实验4周
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对照组
高脂组
治疗组
对照组
高脂组
治疗组
总胆固醇
1.68±0.20
1.69±0.16
1.66±0.15
16.58±2.28*
15.82±2.83*
, http://www.100md.com
16.21±1.01*
甘油三酯
0.64±0.10
0.69±0.09
0.68±0.09
1.79±0.11*
1.67±0.25*
1.61±0.27*
高密度脂蛋白胆固醇
0.42±0.06
0.44±0.10
, 百拇医药
0.40±0.06
0.44±0.10
0.44±0.11
0.45±0.09
低密度脂蛋白胆固醇
0.97±0.12
0.93±0.16
0.97±0.18
15.34±2.25*
13.63±2.67*
15.03±0.70*
, http://www.100md.com
血脂
实验8周
实验12周
对照组
高脂组
治疗组
对照组
高脂组
治疗组
总胆固醇
19.62±2.76*
18.88±3.01*
, 百拇医药
18.01±2.56*
12.04±3.16*△
21.29±2.38*▲
7.51±1.31*▲△
甘油三酯
2.04±0.20*
1.91±0.19*
1.30±0.17*
0.78±0.09△
, http://www.100md.com 2.18±0.29*▲
0.74±0.29△
高密度脂蛋白胆固醇
0.42±0.10
0.42±0.14
0.40±0.05
0.45±0.08
0.42±0.10
0.41±0.15
低密度脂蛋白胆固醇
18.24±2.26*
, 百拇医药
17.60±2.93*
17.40±2.34*
11.27±3.15*△
19.88±2.41*▲
6.73±1.55*△▲
注：实验前后各组家兔数均为10只 与实验前相比，*P<0.05 与实验8周相比，△P<0.05 与对照组相比，▲P<0.05 2.血脂康抑制血管成形术后内膜增殖的作用：见表2，图1～3。血脂康治疗组内膜面积明显小于对照组和高脂组。
表2 血脂康对各组血管内膜增殖的影响(±s) 组别
, 百拇医药
只数
SA(mm2)
NEA(mm2)
MA(mm2)
NEA/MA
对照组
10
5.51±0.55
4.87±0.23
6.94±0.51
0.70±0.08
, 百拇医药 高脂组
10
3.89±0.28*
6.16±0.43*
6.67±0.19
0.91±0.09*
治疗组
10
7.66±0.15*
2.77±0.45*
7.09±0.49
, 百拇医药
0.41±0.06*
注：SA：血管腔；NEA：内膜面积；MA：中膜面积 与对照组比较，*P<0.05
图1为对照组弹力纤维染色，清楚显示血管内膜中度增生，中膜改变不明显。
图2为高脂组，血管内膜明显增生。
, 百拇医药
图3为血脂康组，血管内膜增生明显受抑制
3.血脂康抑制血管成形术后C-myc基因的转录和表达：见表3，图4～6。血脂康治疗组的C-myc mRNA相对量及C-myc蛋白的阳性细胞数明显低于对照组和高脂组(P<0.05)；而后二组比较，P>0.05。
表3 血脂康对各组C-myc基因表达的影响(±s) 组别
只数
阳性细胞百分比(%)
C-myc/GAPDH
对照组
5
, 百拇医药
17.93±3.63
91.75±9.29
高脂组
5
20.61±2.63*
98.95±5.88*
治疗组
5
9.18±3.30△
44.42±5.24△
与对照组相比，△P<0.05 与对照组相比，*P>0.05
, 百拇医药
图4为对照组，血管内膜中细胞核染成棕褐色的为C-myc蛋白阳性细胞，排列整齐。
图5为高脂组，血管内膜中可见C-myc蛋白阳性细胞，排列紊乱。
图6为血脂康组，血管内膜中C-myc蛋白阳性细胞明显减少
讨论
血脂康是从红曲中提取的具有调整血脂作用的中药，主要成分为HMG-CoA还原酶抑制剂，并含有多种必需氨基酸和多种不饱和脂肪酸[3]。实验研究证明其具有调脂作用，并可以通过其抑制血管SMC增殖迁移及保护血管内皮细胞功能来发挥其抗动脉粥样硬化的作用[4]。本研究应用血脂康治疗1个月，发现血脂康治疗组能明显抑制病变部位血管内膜增生，使血管内管腔面积增大，而对血管中膜面积无明显影响。同时也观察到血脂康具有明显的降低胆固醇的作用。而持续应用高胆固醇的喂养组，内膜增殖更加明显，管腔明显减小，与对照组比较差异有显著性(P<0.05)。这一结果提示，血管成形术后，高脂血症可加速病变部位内膜增殖，而应用血脂康治疗，可以抑制血管内膜增殖，推测其作用机制与血脂康调血脂、抑制SMC增殖迁移及保护血管内皮细胞功能有关。
, 百拇医药
本研究应用反转录PCR及免疫组化法， 观察了各组血管局部C-myc基因的表达，血脂康组血管局部C-myc mRNA水平及C-myc蛋白阳性细胞数水平均低于对照组和高脂对照组，这一现象提示血脂康具有明显的抑制C-myc基因转录和表达。血脂康对C-myc基因的作用机制还不清楚，有人发现羟甲基戊二酰辅酶 (HMG-Co)转化酶抑制剂可通过抑制血小板衍化生长因子(PDGF)诱导的磷酯酰肌醇3激酶的活性，影响一些细胞内主要的生长因子信号的传导[5]，另外也可能与其干扰HMG-Co转化成3-甲基-3，5-二羟基戊醛，限制了脱氧核糖核酸的合成有关[6]。高脂组的C-myc mRNA水平和C-myc蛋白阳性细胞数虽然高于对照组，但无统计学意义(P>0.05)，提示血脂康的这一抑制作用与体内血脂水平无明显关系，而与直接抑制血管局部C-myc基因的转录与表达有关。本研究结果提示血脂康可抑制家兔血管成形术后内膜增殖及C-myc基因的表达。
参考文献
, 百拇医药
1 Nikol S, Huehns TY, Hofling B. Molecular biology and post-angioplasy restenosis. Atherosclerosis, 1996,123:17-31.
2 曾定尹,于波,郑晓伟,等. 血脂康对家兔血管平滑肌细胞增殖迁移的抑制作用.中华内科杂志, 1998,37:400.
3 沈志卫,于普林,孙美珍,等. 血脂康治疗原发性高脂血症的前瞻性研究.中华医学杂志, 1996,76:156-157.
4 郑晓伟,曾定尹,王晓静,等. 血脂康对高脂饮食家兔血管内皮细胞功能的保护作用. 中华内科杂志, 1998,37:367-370.
5 McGuire TF, Corey SJ, Sebti SM. Lovastatin inhibits platelet-deprived growth factor(PDGF) stimulation of phosphatidylinositol 3-kinasis activity as well as association of p85 subunit to tyrosine-phosphorylated PDGF receptor. J Biol Chem, 1993,268:22227-22230.
6 Keyomarsi K, Sandoval L, Band V, et al. Synchronization of tumor and normal cells from G1 to multiple cell cycles by lovastatin. Cancer Res, 1991,51:3602-3609.
(收稿：1998-10-24 修回：1999-05-04), http://www.100md.com
单位：110001 沈阳，中国医科大学第一临床学院心血管内科
关键词：血管成形术；内膜增殖；基因；血脂康
中华内科杂志990803 【摘 要】 目的 探讨血脂康对家兔血管成形术后血管内膜增殖及C-myc基因表达的影响。方法 30只高胆固醇喂养4周的日本雄性大白兔，用球囊导管剥脱腹主动脉内皮4周后，对局部动脉粥样硬化狭窄部位行球囊成形术后随机分为对照组、高脂组和血脂康组。4周后采集局部血管行病理形态、反转录PCR法C-myc基因半定量及其C-myc蛋白免疫组化分析。结果 病理形态学观察血脂康组血管内膜面积小于对照组(P<0.05)，对照组血管内膜面积小于高脂组(P<0.05)，血脂康组C-myc基因水平及其蛋白阳性细胞百分比低于后两组(P<0.05)，而后两组水平接近(P>0.05)。结论 血脂康可抑制家兔血管成形术后内膜增殖及C-myc基因的表达。
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The effects of Xuezhikang on neointimal proliferation and C-myc gene
expression after angioplasty in rabbits
QI Guoxian, ZENG Dingyin, LIU Li, et al.
Department of Cardiology, The First Affiliated Hospital of China Medical University, Shenyang 110001
【Abstract】 Objective To investigate the effects of Xuezhikang (XZhK) on the neointimal proliferation and C-myc gene expression after angioplasty in rabbits. Methods Angioplasty for atherosclerotic stenosis of celiac arteries was performed in 30 male white rabbits after being fed with cholesterol-supplemented diet for 8 weeks, which were then randomized to control group, high-cholesterol group and XZhK group. After 4 weeks， the local vessels were collected for morphological observation. C-myc mRNA level was measured with RT-PCR and C-myc protein with immunohistochemical analysis. Results Morphological observation showed that the neointimal area in the XZhK group were less than the control group(P<0.05), and that in control group were less than that in the high-cholesterol group (P<0.05). The levels of C-myc mRNA measured with RT-PCR and the percentage of C-myc protein positive cell by immunohistochemical analysis were lower in the XZhK group than in the control and high-cholesterol group (P<0.05), The levels in the latter two groups showed no difference(P>0.05). Conclusion XZhK can inhibit the neointimal proliferation and the expression of C-myc gene after angioplasty in rabbits.
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【Key words】 Angioplasty Neointimal proliferation Gene Xuezhikang
血管成形术后血管中膜平滑肌细胞(SMC)增生，向内膜下迁移，分泌大量细胞外基质是引起新生内膜增厚发生再狭窄的主要机制[1]。血脂康具有他汀类药物的调血脂作用，并有明显的抗家兔动脉粥样硬化和抑制血管中膜SMC增生的作用[2]。本研究应用实验性家兔动脉粥样硬化后血管狭窄模型，经球囊血管成形术后，观察应用血脂康对血管内膜增生的影响，并探讨其对C-myc原癌基因表达的影响。
材料与方法
一、模型的建立和分组
1997年9～12月期间，选取日本雄性大白兔36只，体重2.5±0.5 kg，月龄6～8个月，经给予1.5g.kg-1.d-1高胆固醇饮食喂养4周后，用球囊导管剥脱主动脉内皮，继续高胆固醇饮食喂养4周，行腹主动脉造影，然后对血管狭窄部位进行球囊扩张，再经造影证实扩张满意为止。共成功建立30只血管成形术模型，随机分为对照组(普通饮食)、高脂组(普通饮食+高胆固醇)和治疗组(普通饮食+血脂康0.8 g.kg-1.d-1)，继续喂养4周后气栓处死。
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二、标本采集和测定
1.血脂测定：于高胆固醇喂养前和喂养后4周、8周和12周处死前，外周动脉采血测定血清胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)，并计算低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)，计算公式LDL-C=TC-HDL-C-TG/2.2。血脂测定采用酶学方法。
2.病理标本：动物处死后,用10%甲醛原位股动脉内灌注固定，截取成形术部位血管标本固定，逐级脱水包埋，连续切片，用于病理形态学观察和免疫组化分析。逆转录PCR法测定局部血管标本中的C-myc mRNA的相对含量，以标准引物作为内参照，C-myc产物相对量=C-myc产物电泳条带密度/内参照产物电泳条带密度×100。以C-myc单克隆抗体SP法免疫组化染色，细胞核染成棕褐色的细胞为阳性细胞，高倍镜下(400×)计数每视野阳性细胞数占总细胞数的百分比。病理切片行弹力纤维染色，利用计算机图像分析系统分别测出新生内膜面积、中膜面积和管腔面积。
, 百拇医药
三、统计学分析
所有数据以均值±标准差(
±s)表示，组间和组内比较采用t检验。结果
1.各组实验前后血脂水平改变：见表1。高脂喂养后3组中TC、TG、LDL-C均明显升高，12周后对照组下降，高脂组保持增高，治疗组与对照组相比，TC、LDL-C明显下降(P<0.05)。
表1 实验前后各组血脂水平的变化(mmol/L，
±s) 血脂实验前
实验4周
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对照组
高脂组
治疗组
对照组
高脂组
治疗组
总胆固醇
1.68±0.20
1.69±0.16
1.66±0.15
16.58±2.28*
15.82±2.83*
, http://www.100md.com
16.21±1.01*
甘油三酯
0.64±0.10
0.69±0.09
0.68±0.09
1.79±0.11*
1.67±0.25*
1.61±0.27*
高密度脂蛋白胆固醇
0.42±0.06
0.44±0.10
, 百拇医药
0.40±0.06
0.44±0.10
0.44±0.11
0.45±0.09
低密度脂蛋白胆固醇
0.97±0.12
0.93±0.16
0.97±0.18
15.34±2.25*
13.63±2.67*
15.03±0.70*
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血脂
实验8周
实验12周
对照组
高脂组
治疗组
对照组
高脂组
治疗组
总胆固醇
19.62±2.76*
18.88±3.01*
, 百拇医药
18.01±2.56*
12.04±3.16*△
21.29±2.38*▲
7.51±1.31*▲△
甘油三酯
2.04±0.20*
1.91±0.19*
1.30±0.17*
0.78±0.09△
, http://www.100md.com 2.18±0.29*▲
0.74±0.29△
高密度脂蛋白胆固醇
0.42±0.10
0.42±0.14
0.40±0.05
0.45±0.08
0.42±0.10
0.41±0.15
低密度脂蛋白胆固醇
18.24±2.26*
, 百拇医药
17.60±2.93*
17.40±2.34*
11.27±3.15*△
19.88±2.41*▲
6.73±1.55*△▲
注：实验前后各组家兔数均为10只 与实验前相比，*P<0.05 与实验8周相比，△P<0.05 与对照组相比，▲P<0.05 2.血脂康抑制血管成形术后内膜增殖的作用：见表2，图1～3。血脂康治疗组内膜面积明显小于对照组和高脂组。
表2 血脂康对各组血管内膜增殖的影响(
±s) 组别, 百拇医药
只数
SA(mm2)
NEA(mm2)
MA(mm2)
NEA/MA
对照组
10
5.51±0.55
4.87±0.23
6.94±0.51
0.70±0.08
, 百拇医药 高脂组
10
3.89±0.28*
6.16±0.43*
6.67±0.19
0.91±0.09*
治疗组
10
7.66±0.15*
2.77±0.45*
7.09±0.49
, 百拇医药
0.41±0.06*
注：SA：血管腔；NEA：内膜面积；MA：中膜面积 与对照组比较，*P<0.05
图1为对照组弹力纤维染色，清楚显示血管内膜中度增生，中膜改变不明显。
图2为高脂组，血管内膜明显增生。
, 百拇医药
图3为血脂康组，血管内膜增生明显受抑制
3.血脂康抑制血管成形术后C-myc基因的转录和表达：见表3，图4～6。血脂康治疗组的C-myc mRNA相对量及C-myc蛋白的阳性细胞数明显低于对照组和高脂组(P<0.05)；而后二组比较，P>0.05。
表3 血脂康对各组C-myc基因表达的影响(
±s) 组别只数
阳性细胞百分比(%)
C-myc/GAPDH
对照组
5
, 百拇医药
17.93±3.63
91.75±9.29
高脂组
5
20.61±2.63*
98.95±5.88*
治疗组
5
9.18±3.30△
44.42±5.24△
与对照组相比，△P<0.05 与对照组相比，*P>0.05
, 百拇医药
图4为对照组，血管内膜中细胞核染成棕褐色的为C-myc蛋白阳性细胞，排列整齐。
图5为高脂组，血管内膜中可见C-myc蛋白阳性细胞，排列紊乱。
图6为血脂康组，血管内膜中C-myc蛋白阳性细胞明显减少
讨论
血脂康是从红曲中提取的具有调整血脂作用的中药，主要成分为HMG-CoA还原酶抑制剂，并含有多种必需氨基酸和多种不饱和脂肪酸[3]。实验研究证明其具有调脂作用，并可以通过其抑制血管SMC增殖迁移及保护血管内皮细胞功能来发挥其抗动脉粥样硬化的作用[4]。本研究应用血脂康治疗1个月，发现血脂康治疗组能明显抑制病变部位血管内膜增生，使血管内管腔面积增大，而对血管中膜面积无明显影响。同时也观察到血脂康具有明显的降低胆固醇的作用。而持续应用高胆固醇的喂养组，内膜增殖更加明显，管腔明显减小，与对照组比较差异有显著性(P<0.05)。这一结果提示，血管成形术后，高脂血症可加速病变部位内膜增殖，而应用血脂康治疗，可以抑制血管内膜增殖，推测其作用机制与血脂康调血脂、抑制SMC增殖迁移及保护血管内皮细胞功能有关。
, 百拇医药
本研究应用反转录PCR及免疫组化法， 观察了各组血管局部C-myc基因的表达，血脂康组血管局部C-myc mRNA水平及C-myc蛋白阳性细胞数水平均低于对照组和高脂对照组，这一现象提示血脂康具有明显的抑制C-myc基因转录和表达。血脂康对C-myc基因的作用机制还不清楚，有人发现羟甲基戊二酰辅酶 (HMG-Co)转化酶抑制剂可通过抑制血小板衍化生长因子(PDGF)诱导的磷酯酰肌醇3激酶的活性，影响一些细胞内主要的生长因子信号的传导[5]，另外也可能与其干扰HMG-Co转化成3-甲基-3，5-二羟基戊醛，限制了脱氧核糖核酸的合成有关[6]。高脂组的C-myc mRNA水平和C-myc蛋白阳性细胞数虽然高于对照组，但无统计学意义(P>0.05)，提示血脂康的这一抑制作用与体内血脂水平无明显关系，而与直接抑制血管局部C-myc基因的转录与表达有关。本研究结果提示血脂康可抑制家兔血管成形术后内膜增殖及C-myc基因的表达。
参考文献
, 百拇医药
1 Nikol S, Huehns TY, Hofling B. Molecular biology and post-angioplasy restenosis. Atherosclerosis, 1996,123:17-31.
2 曾定尹,于波,郑晓伟,等. 血脂康对家兔血管平滑肌细胞增殖迁移的抑制作用.中华内科杂志, 1998,37:400.
3 沈志卫,于普林,孙美珍,等. 血脂康治疗原发性高脂血症的前瞻性研究.中华医学杂志, 1996,76:156-157.
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(收稿：1998-10-24 修回：1999-05-04), http://www.100md.com