逆转录聚合酶链反应检测慢性髓细胞白血病骨髓成纤维细胞BCR/ABL mRNA
作者：熊玉宁 付家瑜 李金兰 常艳 陈珊珊
单位：100700 北京军区总医院血液科(熊玉宁)；北京医科大学血液病研究所(付家瑜、李金兰、常艳、陈珊珊)
关键词：
中华内科杂志990924 BCR/ABL mRNA存在于所有慢性髓细胞白血病(CML)细胞，骨髓成纤维细胞是否存在BCR/ABL mRNA尚未见报道。本实验应用高度敏感的逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)，对31例不同病期的CML骨髓白血病细胞及纯化的骨髓成纤维细胞进行BCR/ABL mRNA检测，旨在从分子水平探讨CML骨髓成纤维细胞与造血细胞是否同源及观察骨髓成纤维细胞的纯化效果。
一、材料与方法
1.病例：CML骨髓标本31例，其中CML慢性期(CML-CP)17例，男10例，女7例，年龄21～55岁；加速期(CML-AP)7例，男5例，女2例，年龄13～55岁；急变期(CML-BC)7例，男6例，女1例，年龄21～66岁。疾病分期按文献[1]标准进行。正常对照取自正常人骨髓。
, 百拇医药
2.骨髓成纤维细胞层的建立、传代和纯化：参照文献[2]加以改良：胎牛血清25%，骨髓单个核细胞1×106/ml，氢化可的松10-6 mol/L，青霉素100 mg/L，链霉素100 mg/L，基本成分培养基(MEM) 4.0 ml，总体积6.0 ml。每周换液一次，培养2～3周，骨髓成纤维细胞层即可铺满瓶底。用胰蛋白酶消化传代，每周一次，经3～4次传代后即可得到基本纯化的骨髓成纤维细胞。
3.CML白血病细胞及骨髓成纤维细胞RNA的提取：异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法。
4.RT-PCR扩增及敏感度试验按常规进行。
二、结果
1.PCR扩增的敏感度：本实验的敏感度在10-4 μg，即10-4 μg RNA扩增的产物即可检测到，加之PCR产物电泳时仅取5 μl(即总产物的十分之一)，所以实际敏感度为10-5 μg，即推测在105个细胞中，只要有1个白血病细胞(约含10-5 μg RNA)即可被检测到。
, 百拇医药
2.CML骨髓白血病细胞及成纤维细胞BCR/ABL融合基因mRNA的表达：31例CML中，骨髓白血病细胞全部检测到BCR/ABL mRNA(其中b2a2型9例，b3a2型22例)。无论CML骨髓白血病细胞转录何种形式mRNA，其相应的骨髓成纤维细胞均未检测到BCR/ABL mRNA的表达，见表1。
讨论 CML是发生于造血干细胞水平的恶性克隆增殖性疾病，其恶性克隆累及髓系、红系、巨核系、B淋巴细胞，T淋巴细胞有时亦受累，但不累及骨髓成纤维细胞[3-5]。由于染色体分析的敏感度较低，因而本实验应用敏感度高、特异性强的PCR技术进行骨髓成纤维细胞BCR/ABL mRNA的检测。结果发现，无论CML骨髓白血病细胞转录何种形式的融合基因，其骨髓成纤维细胞均无相应的融合基因存在。Greenberg等[4]通过染色体分析发现，无论是慢性期、加速期或急变期的CML，其骨髓成纤维细胞均无Ph染色体存在。这与本实验从分子水平检测BCR/ABL mRNA表达结果一致，说明CML骨髓成纤维细胞不是来源于CML恶性克隆。从RT-PCR检测CML骨髓成纤维细胞BCR/ABL mRNA的结果表明，通过适当的培养、传代纯化即可获得基本纯化的骨髓成纤维细胞(至少在10-5无造血细胞存在)，为进一步研究骨髓成纤维细胞提供了可靠的细胞来源。
, 百拇医药
表1 CML骨髓白血病及成纤维细胞BCR/ABL mRNA的检测 诊断
例
数
病程
(月)
白血病细胞
成纤维细胞
BCR/
ABL
b3a2
mRNA
类型
, 百拇医药 b2a2
BCR/
ABL
b3a2
mRNA
类型
b2a2
CML-CP
17
初诊～46
10
7
0
, 百拇医药
0
CML-AP
7
21～48
5
2
0
0
CML-BC
7
18～48
7
0
0
, 百拇医药
0
注：CML：慢性髓细胞白血病；其中CML-CP、AP、BC分别为慢性期、加速期、急性期
参考文献
[1] 张之南，主编.血液病诊断及疗效标准.第1版.天津:科学出版社,1991 .193.
[2] Bendall LJ,Kortlepel K, Gottlieb DJ. Human acute myeloid leukemia cells bind to bone marrow stroma via a combination of beta-1 and beta-2 integrin mechanisms.Blood,1993,82:3125-3132.
[3] Shtivelman E, Lifshitz B,Gale RP,et al.Alternative splicing of RNAs transcribed from human abl gene and from the bcr-abl fused gene.Cell,1986,47:277.
, 百拇医药
[4] Greenberg BR,Wilson FD,Woo L,et al.Cytogenetics of fibrobla stic colonies in Ph1-positive chronic myelogenous leukemia. Blood,1978,51:1039.
[5] Laurel D.Holmer. Chronic myelogenous leukemia.In: Denise M, Harmening, eds. Clinical hematology and fundamentals of hemostasis. 3rd ed. Philadelphia:F. A Davis Company,1997.361-374.
(收稿：1998-08-31 修回：1999-01-04), 百拇医药
单位：100700 北京军区总医院血液科(熊玉宁)；北京医科大学血液病研究所(付家瑜、李金兰、常艳、陈珊珊)
关键词：
中华内科杂志990924 BCR/ABL mRNA存在于所有慢性髓细胞白血病(CML)细胞，骨髓成纤维细胞是否存在BCR/ABL mRNA尚未见报道。本实验应用高度敏感的逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)，对31例不同病期的CML骨髓白血病细胞及纯化的骨髓成纤维细胞进行BCR/ABL mRNA检测，旨在从分子水平探讨CML骨髓成纤维细胞与造血细胞是否同源及观察骨髓成纤维细胞的纯化效果。
一、材料与方法
1.病例：CML骨髓标本31例，其中CML慢性期(CML-CP)17例，男10例，女7例，年龄21～55岁；加速期(CML-AP)7例，男5例，女2例，年龄13～55岁；急变期(CML-BC)7例，男6例，女1例，年龄21～66岁。疾病分期按文献[1]标准进行。正常对照取自正常人骨髓。
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2.骨髓成纤维细胞层的建立、传代和纯化：参照文献[2]加以改良：胎牛血清25%，骨髓单个核细胞1×106/ml，氢化可的松10-6 mol/L，青霉素100 mg/L，链霉素100 mg/L，基本成分培养基(MEM) 4.0 ml，总体积6.0 ml。每周换液一次，培养2～3周，骨髓成纤维细胞层即可铺满瓶底。用胰蛋白酶消化传代，每周一次，经3～4次传代后即可得到基本纯化的骨髓成纤维细胞。
3.CML白血病细胞及骨髓成纤维细胞RNA的提取：异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法。
4.RT-PCR扩增及敏感度试验按常规进行。
二、结果
1.PCR扩增的敏感度：本实验的敏感度在10-4 μg，即10-4 μg RNA扩增的产物即可检测到，加之PCR产物电泳时仅取5 μl(即总产物的十分之一)，所以实际敏感度为10-5 μg，即推测在105个细胞中，只要有1个白血病细胞(约含10-5 μg RNA)即可被检测到。
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2.CML骨髓白血病细胞及成纤维细胞BCR/ABL融合基因mRNA的表达：31例CML中，骨髓白血病细胞全部检测到BCR/ABL mRNA(其中b2a2型9例，b3a2型22例)。无论CML骨髓白血病细胞转录何种形式mRNA，其相应的骨髓成纤维细胞均未检测到BCR/ABL mRNA的表达，见表1。
讨论 CML是发生于造血干细胞水平的恶性克隆增殖性疾病，其恶性克隆累及髓系、红系、巨核系、B淋巴细胞，T淋巴细胞有时亦受累，但不累及骨髓成纤维细胞[3-5]。由于染色体分析的敏感度较低，因而本实验应用敏感度高、特异性强的PCR技术进行骨髓成纤维细胞BCR/ABL mRNA的检测。结果发现，无论CML骨髓白血病细胞转录何种形式的融合基因，其骨髓成纤维细胞均无相应的融合基因存在。Greenberg等[4]通过染色体分析发现，无论是慢性期、加速期或急变期的CML，其骨髓成纤维细胞均无Ph染色体存在。这与本实验从分子水平检测BCR/ABL mRNA表达结果一致，说明CML骨髓成纤维细胞不是来源于CML恶性克隆。从RT-PCR检测CML骨髓成纤维细胞BCR/ABL mRNA的结果表明，通过适当的培养、传代纯化即可获得基本纯化的骨髓成纤维细胞(至少在10-5无造血细胞存在)，为进一步研究骨髓成纤维细胞提供了可靠的细胞来源。
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表1 CML骨髓白血病及成纤维细胞BCR/ABL mRNA的检测 诊断
例
数
病程
(月)
白血病细胞
成纤维细胞
BCR/
ABL
b3a2
mRNA
类型
, 百拇医药 b2a2
BCR/
ABL
b3a2
mRNA
类型
b2a2
CML-CP
17
初诊～46
10
7
0
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0
CML-AP
7
21～48
5
2
0
0
CML-BC
7
18～48
7
0
0
, 百拇医药
0
注：CML：慢性髓细胞白血病；其中CML-CP、AP、BC分别为慢性期、加速期、急性期
参考文献
[1] 张之南，主编.血液病诊断及疗效标准.第1版.天津:科学出版社,1991 .193.
[2] Bendall LJ,Kortlepel K, Gottlieb DJ. Human acute myeloid leukemia cells bind to bone marrow stroma via a combination of beta-1 and beta-2 integrin mechanisms.Blood,1993,82:3125-3132.
[3] Shtivelman E, Lifshitz B,Gale RP,et al.Alternative splicing of RNAs transcribed from human abl gene and from the bcr-abl fused gene.Cell,1986,47:277.
, 百拇医药
[4] Greenberg BR,Wilson FD,Woo L,et al.Cytogenetics of fibrobla stic colonies in Ph1-positive chronic myelogenous leukemia. Blood,1978,51:1039.
[5] Laurel D.Holmer. Chronic myelogenous leukemia.In: Denise M, Harmening, eds. Clinical hematology and fundamentals of hemostasis. 3rd ed. Philadelphia:F. A Davis Company,1997.361-374.
(收稿：1998-08-31 修回：1999-01-04), 百拇医药