胃癌组织幽门螺杆菌感染与微卫星不稳定性的研究
作者：房殿春 罗元辉 周晓东 鲁荣 刘为纹
单位：400038 重庆，第三军医大学西南医院消化科
关键词：
中华内科杂志991019 流行病学研究资料提示，幽门螺杆菌(Hp)、特别是含cag A基因的Hp感染与胃癌之间存在因果关系[1]。体外实验证实Hp培养滤液可诱导胃黏膜细胞DNA损伤[2]。分子生物学方面研究亦提示Hp感染与ras基因活化有关[3]。为从分子水平揭示Hp的致癌机制，我们采用聚合酶链反应(PCR)技术对胃癌组织Hp进行检测，并对Hp感染与胃癌组织微卫星不稳定性(MSI)之间的关系进行分析。
一、材料与方法
1.标本：49例胃癌为我院1994年1月～1996年7月手术切除标本，手术切下肿瘤后立即收集癌及切缘处正常组织，剔除出血坏死部分后置-80℃冰箱保存备用。采用蛋白酶K消化、酚/氯仿法提取基因组DNA，冰冻切片染色证实所检测癌组织肿瘤细胞数均在50%以上。
, 百拇医药
2.引物：参照文献合成D17s261、D17s799、TCF-2、D18s34、D5s409及D5s82 6个微卫星位点和Hp尿素酶A(HpA)和B(HpB)基因引物。D17s799和TCF-2引物序列由Garden博士提供。
3.PCR扩增：采用2400型PCR仪(Perkin Elmer Cetus)扩增微卫星及HpA和HpB基因DNA，循环参数为94℃30秒，56℃40秒，72℃30秒，32个循环后置72℃继续反应10分钟，反应总体积为20 μl(含10×Buffle 2 μl,引物各10 pmol,4×dNTP各0.2 mmol/L,Taq DNA聚合酶2 U，基因组DNA 100 ng)，扩增产物在1.5%琼脂糖(北京中山生物公司)上电泳，溴乙锭染色，紫外光下观察。各微卫星位点的检测经证实无杂带后，以首次扩增产物为模板，另加0.8 μl a-32P dNTP进行第2次扩增，取扩增产物5 μl与等量上样缓冲液(98%甲酰胺，0.025%二甲苯蓝和溴酚蓝，10 mmol/L EDTANa2)混合，95℃变性3分钟后快速冷却，在10%的变性聚丙烯酰胺凝胶(含7 mol尿素)电泳(恒功率55W)2～4小时，凝胶干燥，放射自显影，洗片观察结果。
, 百拇医药
4.结果分析：与正常组织比较，胃癌组织有额外的DNA等位片段或出现等位片段泳动，即可判断为MSI。经1.5%琼脂糖电泳，HpA可见411 bp片段，HpB则可见132 bp片段。
5.统计学分析：以χ2、四表格确切概率法对实验数据进行统计学分析。
二、结果
1.胃癌组织MSI检出率：49例胃癌经PCR扩增，放射自显影观察，TCF-2位点MSI检出率为18.4%(9/49)， D17s261和D17s799位点均为22.4%(11/49)，D18s34位点为28.6%(14/49)，D5s409位点为14.3%(7/49)，D5s82位点为20.4%(10/49)。若将以上位点综合分析，49例胃癌中有26例检出MSI，总检出率为53.1%。其中同一胃癌2个位点以上检出MSI 15例，占MSI阳性者的57.8%。
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2.Hp感染与MSI发生的关系：49例胃癌中检出HpA和HpB基因片段者20例，检出率为40.8%。Hp阳性与阴性组各位点MSI检出情况见表1。经统计学处理，Hp阳性胃癌组各位点MSI检出率与Hp阴性组相比差异无显著性(P>0.05)。将6个位点MSI综合分析，29例Hp阴性和20例Hp阳性胃癌组各检出MSI 13例，经统计学处理，Hp阳性与阴性胃癌组MSI检出率差异亦无显著性(P>0.05)。
表1 幽门螺杆菌(Hp)感染与胃癌组织微卫星不稳定性发生的关系 组别
例数
TCF-2
D17s
261
D17s
, 百拇医药 799
D18s
34
D5s
409
D5s
82
Hp-
29
5
5
7
7
5
, 百拇医药
7
Hp+
20
4
6
4
7
2
3
讨论 尽管众多流行病学调查表明，Hp感染可能与胃癌的发生有关，但Hp感染在胃癌发生中如何起作用仍有待深入研究。Hp致癌机制目前有以下几种推测[4]：(1)Hp感染为慢性胃炎的主要原因，而慢性胃炎→胃黏膜萎缩→肠上皮化生→异型增生→胃癌这一癌变的模式过程已为多数国内外学者所接受。因此，有理由认为，Hp感染为胃癌发生的启动因子。(2)胃黏膜细胞染色体被Hp DNA片段插入，引起癌基因的活化和抑癌基因的失活。(3)Hp感染可使胃黏膜细胞增殖速度加速，Hp产生的某些毒素物质可损伤细胞DNA，这两方面都容易产生DNA复制错误。MSI是指由于复制错误引起的DNA简单重复序列的改变，最近的研究发现其在胃癌发生过程中扮演重要角色，因此，研究Hp感染与MSI的关系对揭示Hp的致癌机制可能有重要意义。
, 百拇医药
文献报告胃癌MSI的检出率为18%～39%[5]，我们采用以PCR为基础的方法对49例胃癌组织TCF-2、D17s261、D17s799、D18s34、D5s409和D5s82 6个微卫星位点的MSI进行检测，MSI的检出率分别为18.4%、22.4%、22.4%、28.6%、14.3%和20.4%。若将以上位点综合分析，则总检出率为53.1%，提示MSI在胃癌的发生中起重要作用，可能是胃癌发生的一种新机制。但通过分析Hp阳性与阴性组的MSI，并未发现Hp感染与MSI有密切相关，提示Hp并非通过引起MSI导致胃癌发生。
近年来对Hp感染与胃癌关系的临床研究逐渐增多，但大多为对胃癌患者Hp感染率的流行病学调查，其结果各家报道不一。从本研究资料看，胃癌组织Hp的检出率仅为40.8%，明显低于以往报告的慢性胃炎和溃疡病检出率，其原因考虑为由于胃癌形成后，造成胃黏膜组织结构和微环境的改变，不适宜Hp的生存，导致Hp的“丢失”所致[6]。但晚近流行病学资料表明，在某些Hp感染率高的地区，胃癌的发生率并不高[7]，且胃癌可以发生在无Hp感染者。因此作者认为，Hp感染不是胃癌发生所必须或直接致病因素。胃癌的发生是多因素作用的结果，若将胃癌发病研究的主流限于Hp，则有可能会误导或减慢我们对胃癌复杂发病机制的研究。因此，我们应客观评价Hp在胃癌发生中的作用。
, http://www.100md.com
本课题受国家自然科学基金资助(编号：39670347)
参考文献
[1] Parsonnet J, Friedman GD, Orentreich N, et al. Risk for gastric cancer in people with Cag A positive or Cag A negative Hp infection. Gut， 1997，40: 297-301.
[2] 梁后杰,刘为纹,房殿春，等. 幽门螺杆菌培养滤液诱导胃黏膜细胞DNA损伤.中华消化杂志 ，1995，15增刊:21-23.
[3] 于君,张锦坤. 应用分子生物学技术研究幽门螺杆菌感染与胃癌变的关系.中华消化杂志， 1995，15增刊:28-31.
[4] Parsonnet J. Helicobacter pylori and gastric cancer. Gastroenterol &127;Clin North Am ，1993，22:89-101.
, 百拇医药
[5] Strickler JG, Zheng J, Shu Q, et al. p53 mutations and microsatellite instability in sporadic gastric cancer: when guardians fail. Cancer Res ，1994， 54:4750-4755.
[6] Karnes WE, Samloff IM, Siurala M, et al. Positive serum antibody and negative tissue staining for H.pylori in subjects with atrophic body gastritis. Gastroenterology， 1991，101:167-174.
[7] Lin JT, Wang LY, Wang JT, et al. Ecological study of association between Helicobacter pylori infection and gastric cancer in Taiwan. Dig Dis Sci，1995，40 :385-389.
(收稿：1998-09-01 修回：1999-07-14), http://www.100md.com
单位：400038 重庆，第三军医大学西南医院消化科
关键词：
中华内科杂志991019 流行病学研究资料提示，幽门螺杆菌(Hp)、特别是含cag A基因的Hp感染与胃癌之间存在因果关系[1]。体外实验证实Hp培养滤液可诱导胃黏膜细胞DNA损伤[2]。分子生物学方面研究亦提示Hp感染与ras基因活化有关[3]。为从分子水平揭示Hp的致癌机制，我们采用聚合酶链反应(PCR)技术对胃癌组织Hp进行检测，并对Hp感染与胃癌组织微卫星不稳定性(MSI)之间的关系进行分析。
一、材料与方法
1.标本：49例胃癌为我院1994年1月～1996年7月手术切除标本，手术切下肿瘤后立即收集癌及切缘处正常组织，剔除出血坏死部分后置-80℃冰箱保存备用。采用蛋白酶K消化、酚/氯仿法提取基因组DNA，冰冻切片染色证实所检测癌组织肿瘤细胞数均在50%以上。
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2.引物：参照文献合成D17s261、D17s799、TCF-2、D18s34、D5s409及D5s82 6个微卫星位点和Hp尿素酶A(HpA)和B(HpB)基因引物。D17s799和TCF-2引物序列由Garden博士提供。
3.PCR扩增：采用2400型PCR仪(Perkin Elmer Cetus)扩增微卫星及HpA和HpB基因DNA，循环参数为94℃30秒，56℃40秒，72℃30秒，32个循环后置72℃继续反应10分钟，反应总体积为20 μl(含10×Buffle 2 μl,引物各10 pmol,4×dNTP各0.2 mmol/L,Taq DNA聚合酶2 U，基因组DNA 100 ng)，扩增产物在1.5%琼脂糖(北京中山生物公司)上电泳，溴乙锭染色，紫外光下观察。各微卫星位点的检测经证实无杂带后，以首次扩增产物为模板，另加0.8 μl a-32P dNTP进行第2次扩增，取扩增产物5 μl与等量上样缓冲液(98%甲酰胺，0.025%二甲苯蓝和溴酚蓝，10 mmol/L EDTANa2)混合，95℃变性3分钟后快速冷却，在10%的变性聚丙烯酰胺凝胶(含7 mol尿素)电泳(恒功率55W)2～4小时，凝胶干燥，放射自显影，洗片观察结果。
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4.结果分析：与正常组织比较，胃癌组织有额外的DNA等位片段或出现等位片段泳动，即可判断为MSI。经1.5%琼脂糖电泳，HpA可见411 bp片段，HpB则可见132 bp片段。
5.统计学分析：以χ2、四表格确切概率法对实验数据进行统计学分析。
二、结果
1.胃癌组织MSI检出率：49例胃癌经PCR扩增，放射自显影观察，TCF-2位点MSI检出率为18.4%(9/49)， D17s261和D17s799位点均为22.4%(11/49)，D18s34位点为28.6%(14/49)，D5s409位点为14.3%(7/49)，D5s82位点为20.4%(10/49)。若将以上位点综合分析，49例胃癌中有26例检出MSI，总检出率为53.1%。其中同一胃癌2个位点以上检出MSI 15例，占MSI阳性者的57.8%。
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2.Hp感染与MSI发生的关系：49例胃癌中检出HpA和HpB基因片段者20例，检出率为40.8%。Hp阳性与阴性组各位点MSI检出情况见表1。经统计学处理，Hp阳性胃癌组各位点MSI检出率与Hp阴性组相比差异无显著性(P>0.05)。将6个位点MSI综合分析，29例Hp阴性和20例Hp阳性胃癌组各检出MSI 13例，经统计学处理，Hp阳性与阴性胃癌组MSI检出率差异亦无显著性(P>0.05)。
表1 幽门螺杆菌(Hp)感染与胃癌组织微卫星不稳定性发生的关系 组别
例数
TCF-2
D17s
261
D17s
, 百拇医药 799
D18s
34
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409
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82
Hp-
29
5
5
7
7
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, 百拇医药
7
Hp+
20
4
6
4
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讨论 尽管众多流行病学调查表明，Hp感染可能与胃癌的发生有关，但Hp感染在胃癌发生中如何起作用仍有待深入研究。Hp致癌机制目前有以下几种推测[4]：(1)Hp感染为慢性胃炎的主要原因，而慢性胃炎→胃黏膜萎缩→肠上皮化生→异型增生→胃癌这一癌变的模式过程已为多数国内外学者所接受。因此，有理由认为，Hp感染为胃癌发生的启动因子。(2)胃黏膜细胞染色体被Hp DNA片段插入，引起癌基因的活化和抑癌基因的失活。(3)Hp感染可使胃黏膜细胞增殖速度加速，Hp产生的某些毒素物质可损伤细胞DNA，这两方面都容易产生DNA复制错误。MSI是指由于复制错误引起的DNA简单重复序列的改变，最近的研究发现其在胃癌发生过程中扮演重要角色，因此，研究Hp感染与MSI的关系对揭示Hp的致癌机制可能有重要意义。
, 百拇医药
文献报告胃癌MSI的检出率为18%～39%[5]，我们采用以PCR为基础的方法对49例胃癌组织TCF-2、D17s261、D17s799、D18s34、D5s409和D5s82 6个微卫星位点的MSI进行检测，MSI的检出率分别为18.4%、22.4%、22.4%、28.6%、14.3%和20.4%。若将以上位点综合分析，则总检出率为53.1%，提示MSI在胃癌的发生中起重要作用，可能是胃癌发生的一种新机制。但通过分析Hp阳性与阴性组的MSI，并未发现Hp感染与MSI有密切相关，提示Hp并非通过引起MSI导致胃癌发生。
近年来对Hp感染与胃癌关系的临床研究逐渐增多，但大多为对胃癌患者Hp感染率的流行病学调查，其结果各家报道不一。从本研究资料看，胃癌组织Hp的检出率仅为40.8%，明显低于以往报告的慢性胃炎和溃疡病检出率，其原因考虑为由于胃癌形成后，造成胃黏膜组织结构和微环境的改变，不适宜Hp的生存，导致Hp的“丢失”所致[6]。但晚近流行病学资料表明，在某些Hp感染率高的地区，胃癌的发生率并不高[7]，且胃癌可以发生在无Hp感染者。因此作者认为，Hp感染不是胃癌发生所必须或直接致病因素。胃癌的发生是多因素作用的结果，若将胃癌发病研究的主流限于Hp，则有可能会误导或减慢我们对胃癌复杂发病机制的研究。因此，我们应客观评价Hp在胃癌发生中的作用。
, http://www.100md.com
本课题受国家自然科学基金资助(编号：39670347)
参考文献
[1] Parsonnet J, Friedman GD, Orentreich N, et al. Risk for gastric cancer in people with Cag A positive or Cag A negative Hp infection. Gut， 1997，40: 297-301.
[2] 梁后杰,刘为纹,房殿春，等. 幽门螺杆菌培养滤液诱导胃黏膜细胞DNA损伤.中华消化杂志 ，1995，15增刊:21-23.
[3] 于君,张锦坤. 应用分子生物学技术研究幽门螺杆菌感染与胃癌变的关系.中华消化杂志， 1995，15增刊:28-31.
[4] Parsonnet J. Helicobacter pylori and gastric cancer. Gastroenterol &127;Clin North Am ，1993，22:89-101.
, 百拇医药
[5] Strickler JG, Zheng J, Shu Q, et al. p53 mutations and microsatellite instability in sporadic gastric cancer: when guardians fail. Cancer Res ，1994， 54:4750-4755.
[6] Karnes WE, Samloff IM, Siurala M, et al. Positive serum antibody and negative tissue staining for H.pylori in subjects with atrophic body gastritis. Gastroenterology， 1991，101:167-174.
[7] Lin JT, Wang LY, Wang JT, et al. Ecological study of association between Helicobacter pylori infection and gastric cancer in Taiwan. Dig Dis Sci，1995，40 :385-389.
(收稿：1998-09-01 修回：1999-07-14), http://www.100md.com