HBsAg DNA疫苗诱导小鼠体液免疫及抑制转基因鼠表面抗原的产生
作者：柯亨宁 斯崇文 成军 于敏 刘丹 田秀兰
单位：柯亨宁 斯崇文 于敏 刘丹 田秀兰(100034 北京医科大学第一医院感染疾病科)；成军(解放军第302医院基因治疗研究中心)
关键词：病毒，乙型肝炎；动物，转基因；疫苗，DNA
中华内科杂志000509 【摘要】 目的 观察乙型肝炎病毒S基因表达质粒(PS)诱导小鼠体液免疫及对HBV转基因(Tg)小鼠血清HBsAg的影响。 方法 将S基因插入到pcDNA3.1+的BamH1位点上构建了PS。体外证实PS表达HBsAg。再分别免疫BALB/C小鼠和Tg小鼠各10只。另用pcDNA3.1+免疫4只BALB/C小鼠。每只小鼠每次肌肉注射纯化质粒100 μg，共3次。用ELISA检测每份血清抗-HBs的效价。结果 PS免疫BALB/C小鼠，2～4周时出现抗-HBs，第8周时平均为135 IU/L。该PS免疫Tg鼠多在6～8周时出现抗体，平均39 IU/L。其中4只HBsAg阳性的Tg鼠免疫后HBsAg转阴。结论 PS不仅能够有效地诱导BALB/C和Tg小鼠的体液免疫，还能抑制Tg鼠HBsAg的产生。
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DNA immunization of a plasmid expressing HBsAg and its effect on the production of HBsAg in HBV-transgenic mice
KE Hengning SI Chongwen CHENG Jun
(Department of Infectious Disease, The First Teaching Hospital, Beijing Medical University, Beijing 100034, China)
【Abstract】 Objective To study the DNA immunization of a plasmid expressing HBsAg in BALB/C mice and HBV-transgenic (Tg) mice. Methods The S gene obtained by polymerase chain reaction was ligated with pGEM-Teasy vector and then subcloned into pcDNA 3.1+ to construct a new plasmid (PS), whose fidelity was verified through sequencing. The ability to express HBsAg was demonstrated by transfection of PS into P815 cells. The PS was then used to immunize 10 BALB/C mice and 10 Tg mice by way of injection. 4 mice were immunized with pcDNA3.1+. Each mouse was injected intramuscularly with one of those plasmids in the same total dose of 300 μg divided into 3 times. Another 6 BALB/ C mice were injected with HBsAg protein as control. All mice were bled before the immunization and biweekly thereafter. Sera of the mice were detected for anti-HBs with ELISA. Results 8 of the 10 mice immunized with PS had detectable anti-HBs. The average level of anti-HBs is 135 IU/L. While in the Tg mice, anti-HBs occurred during 6 to 8 weeks after injection. The average level is 39 IU/L. HBsAg became negative in all the 4 mice with sera positive for HBsAg before immunization. Conclusion PS is effective to elicit a positive humoral immune response in BALB/C mice. PS can also stimulate an immune response in Tg mice, which seems to be responsible for the disappearance of HBsAg.
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【Key word】 Hepatitis B virus; Animals, transgenic; Vaccines, DNA
DNA免疫(又称核酸免疫)是指裸DNA直接注射到皮肤或肌肉组织，并被转染到某种细胞里，转录mRNA，翻译成蛋白质抗原，通过主要组织相容性复合物(MHC)-Ⅰ和MHC-Ⅱ途径刺激机体产生相应的免疫应答。目前在许多传染和非传染性疾病的疫苗研究中有广泛的应用[1,2]。乙型肝炎病毒慢性感染目前尚无有效的抗病毒治疗方法。乙型肝炎病毒血源疫苗和重组疫苗均能有效地预防乙型肝炎病毒的感染。但是，约有10%的人群对现有的乙肝疫苗无应答[3]。我们通过构建乙型肝炎病毒S抗原的表达质粒(PS)研究其在正常免疫应答小鼠及转基因小鼠中诱导免疫应答的能力，并检测转基因小鼠血清HBsAg在注射PS前后的变化，为进一步研究治疗性疫苗打下基础。
材料与方法
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1. PS的构建：载体PS pcDNA3.1+和含有HBV ayw亚型S基因的PS pCMV-S由成军博士惠赠。PGEM-Teasy Vecter Systems 购自Promega等公司。扩增S基因的上游引物：5′-GGAAGATCTATGGAGAAC-ATCACATCAGG-3′。下游引物：5′-GGAAGATCTTT-AAATGTATACCC-3′。划线部分分别为HBsAg基因上游20个核苷酸和下游14个核苷酸的反义序列。上述引物在美国Cybersyn公司合成。用PCR法，扩增25个循环。回收687 bp大小的片段，纯化后，与PGEM-Teasy载体片段连接。转化感受态JM109细菌，筛选、扩增、提取质粒。Bgl II酶切，低溶点胶收取683bp大小的带有黏端的目的基因片段，纯化。载体pcDNA3.1+质粒用BamH I酶切，去磷酸化，纯化。将目的基因片段与载体片段混匀，在T4连接酶的作用下，于16℃反应20 h。将连接产物转化感受态细胞铺制于含氨苄青霉素(100 mg/L)的LB培养基上37℃过夜，挑选菌落PCR阳性者，小提质粒，用Xba I酶切电泳。质粒送Cybersyn公司，采用荧光标记双脱氧链终止法双向测序。
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2. PS转染P815细胞和稳定表达：P815细胞购自美国组织细胞培养中心(ATCC：TlB-64)。经培养后，将细胞配成1×105/ml, 分别接种于60 mm2的培养板中。转染pcDNA3.1+、PS两个质粒各6 μg。具体参照Lipofectin Reagent(购于Gibco-BRL公司)的试剂说明书。10 h后吸出无血清培养液，代之以完全DMEM。培养48 h后用G418(800 mg/L)的DMEM传代选择培养。10～20 d后长出贴壁生长的细胞克隆，逐个转至24孔培养板培养3 d后，再转至6孔培养板中扩增细胞。
3. 免疫荧光的检测方法：一抗用小鼠抗-HBs单克隆抗体，购自中国预防医学科学院病毒研究所。荧光标记的二抗(羊抗鼠IgG抗体)购自Jakson Immuno Research Laboratories(29497)。取40 μl培养的细胞悬液(105/ml)用甩片机甩在玻片上。冷丙酮固定10 min。一抗用小鼠抗-HBs单克隆抗体1∶10稀释，每点加30 μl。室温孵育30 min。PBS洗3次，加入1∶20稀释的FITC标记的二抗30 μl。室温孵育40 min。PBS洗3次，荧光显微镜下观察，选择部分阳性克隆拍照保存。
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4. 细胞的裂解及HBsAg的检测：细胞裂解液：50 mmol/L Tris，pH 8.0，150 mmol/L NaCl，0.02% NaN3, 1% NP-40,100 mg/L PMSF, 1% aprotinin。于临用前加入蛋白酶抑制剂PMSF(phenylmethyl-sulfonylfuoride) 100 g/L，每孔细胞加入PBS洗2次，弃尽PBS。加入裂解液0.5 ml ,置冰上20 min，用刮刀将细胞裂解液刮至一旁，收入离心管。4℃，12 000 g离心2 min。吸上清-70℃冻存待检。HBsAg的检测用RIA法，检测试剂盒购自北京北方生物技术研究所。转基因小鼠HBsAg采用华美公司的酶标试剂盒。具体步骤参照说明书，Cutoff值=2.1。
5. 质粒的大量制备：采用QIGEN Plasmid Purification (Mega) Kit (QIGEN Inc.,Germany)。每500 ml JM109转化株菌液可获高纯度质粒2.5 mg 。紫外分光光度仪定量。
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6. 免疫小鼠与抽血的方法：20只无菌的BALB/C 雌性小鼠，4～6周龄，购于中国药品生物制品检定所。随机分为4组并编号。A组：10只，免疫PS。B组：6只，免疫无氢氧化铝的HBsAg, 每只每次4 μg，共3次。C组：4只，免疫pcDNA3.1+质粒。D组：Tg种鼠购自美国Jakson实验室。实验用10只Tg鼠为在北京医科大学动物室繁殖第三代小鼠。所有小鼠饲养在无菌条件下。纯化的质粒溶于0.9%的生理盐水中。质粒浓度为1～2 g/L。PS免疫小鼠，每次注射PS 100 μg。每隔2周免疫1次，共3次。注射部位为小鼠大腿股四头肌。注射前及注射后，每隔2周用肝素化的毛细吸管从小鼠眼眶后取血200 μl。
7. ELISA法检测抗-HBs，ET1-AB-AUK-3(P001603)试剂盒购自意大利Diasorin公司。操作方法按说明书进行。
结果
1. PS的酶切和测序鉴定：图1显示PS用XbaI酶切后释放的610 bp大小的片段，根据酶切图谱分析，说明是正向插入的克隆质粒。克隆基因测序结果与Genebank(J02203V0146)保存的HBV ayw亚型的S基因序列完全一致。
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1： λDNA用EcoRI酶切的Marker; 2：酶切产物电泳条带
图1 PS用XbaI酶切后释放610 bp的片段
2.PS转染P815细胞稳定表达的结果：图2显示用免疫荧光法检测PS转染P815细胞稳定表达的结果。有表达的细胞克隆呈荧光染色阳性。而转染pcDNA3.1+质粒的克隆均阴性。
3. 放射免疫方法检测转染细胞上清和细胞裂解液的结果：PS转染细胞裂解液为阳性，P/N值为3.6。上清为阴性，P/N值为2.0。pcDNA3.1+质粒转染细胞裂解液P/N值为1.9。
4. PS免疫BALB/C小鼠抗-HBs的变化：10只小鼠中，8只抗-HBs 阳性。最高抗体效价达530 IU/L。其中1只出现1次阳性，抗体效价为5.8 IU/L。2周时2只抗-HBs阳性，4周时7只阳性。6～8周8只阳性。可见，抗体多于第一次免疫后4周出现，6～8周达到观察期高峰(表1)。
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表1 PS免疫BALB/C小鼠抗-HBs检测结果(IU/L) 时间
(周)
小鼠序号
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
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0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
2
32
0
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0
0
6
0
0
0
0
0
4
4.8
70
220
0
7.5
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0
10
10
0
10
6
33
410
210
0
12
5.8
60
120
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0
80
8
22
530
270
0
18
0
20
54
ND
30
注： ND：未检测
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5.不同组免疫小鼠抗体效价平均值的比较(表2)：pcDNA3.1+质粒免疫小鼠抗体始终阴性。A组PS免疫后的抗体效价比C组HBsAg蛋白免疫组低。观察结束时不同免疫组平均值，PS组：(135±172) IU/L。HBsAg免疫组：(480±356) IU/L。抗体效价进行对数转换后的方差分析显示F值为15.87 ，P<0. 01。免疫后第8周抗体效价3组(A、B、D)之间的 q检验显示差异有显著性(P<0.05)。
表2 各组免疫小鼠不同时间抗体效价均值的比较(IU/L) 组别
采样时间(周)
0
2
4
6
, 百拇医药 8
PcDNA3.1+(BALB/C鼠)
0
0
0
0
0
PS(BALB/C鼠)
0
17
96
117
135
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HBsAg (BALb/C鼠)
0
266
108
367
485
PS (Tg鼠)
0
163
103
20
39
6.HBV转基因鼠免疫PS后抗-HBs定量检测结果(表3)：10只免疫小鼠，除2只在免疫后6周和8周意外死亡外，其余8只抗-HBs均出现阳性。平均效价为39 IU/L。免疫2周后出现抗-HBs阳性者，10只中有3只，4周时10只中有2只，6周时9只中有4只，8周及10周时存活8只小鼠全部出现抗-HBs。其中1只小鼠免疫后第2周抗体效价即达到480 IU/L。
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7.转基因鼠免疫PS前后HBsAg检测结果：免疫前1、4、5、6号HBsAg阳性的转基因鼠于免疫后第16
表3 PS免疫个体HBV转基因鼠抗-HBs定量检测结果 (IU/L) 时间
(周)
小鼠序号
1
2
3
4
5
6
7
8
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9
10
2
4
3.6
0
0
0
0
0
480
0
0
4
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0
0
0
0
0
0
0
200
0
5
6
ND
0
0
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8
5
0
0
45
0
20
8
ND
11
ND
7
6
9
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8
43
6
8
10
ND
30
ND
48
30
7
18
43
20
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116
注： ND：为小鼠意外死亡，未检测
表4 PS免疫HBV转基因小鼠前后HBsAg检测结果(A450, P/N ) 时间
小鼠序号
1
2
3
4
5
6
7
8
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9
10
免疫前
4
1.7
0.7
2.1
2.8
2.1
1.5
0.6
1.1
0.5
, http://www.100md.com 免疫16周
1.8*
1.0
1.3*
1.3
1.1
1.1
1.3
1.1
1.5
1.1
注：* 1、3号小鼠分别为免疫后6周和8周时的血清周全部转阴。如表4显示，P/N≥2.1为阳性。
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讨论
本实验证实PS能诱导BALB/C小鼠体液免疫反应。质粒免疫的关键是所构建的表达质粒能够转染机体的抗原提呈细胞，并高水平表达目的蛋白质。这些蛋白质在细胞内通过翻译后的修饰如糖基化，再折叠成具有抗原性的蛋白质。Heather L Davis 构建的表达 HBsAg 的pCMV-S 质粒含有巨细胞病毒(CMV)强启动子和促进分泌的信号肽序列。在S基因的下游还含有较长的非翻译区，其中包括多聚腺苷酸序列。该质粒免疫1次后(肌肉注射100 μg )成功诱导体液免疫反应[5]。我们用载体pcDNA3.1+构建的HBsAg表达质粒仅含有S基因的681个核苷酸。通过肌肉注射免疫小鼠，2周时即有1只小鼠产生抗-HBs，8周时7只抗-HBs效价大于10 IU/L。这一浓度在黑猩猩体内证实具有保护机体免受HBV攻击的作用。其中1只小鼠的抗-HBs达到530 IU/L。而用HBsAg蛋白质免疫小鼠产生的抗-HBs效价最高，平均达480 IU/L。2周时抗-HBs检测阳性率最高。这说明蛋白质抗原直接免疫的效果很好。也可能与我们使用的剂量较大有关。
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质粒免疫的另一特性是能够诱导较强的细胞免疫，对清除细胞内感染极为重要。本研究不仅证实了用PS免疫H-2b型HBV转基因小鼠，成功地诱导了抗体免疫反应，而且使其中4只HBsAg阳性的转基因小鼠HBsAg阴转。转基因鼠产生的HBsAg不能诱导表面抗体和相应细胞免疫的产生，其机制较为复杂。可能与其在发育阶段免疫系统接触了大量的表面抗原诱导了T细胞和B细胞的免疫耐受有关。这种引起机体耐受的机制与人体感染乙型肝炎病毒后引起的耐受有类似之处。都是由于肝细胞表达产生大量的HBsAg，而肝细胞本身缺乏免疫激活所需的共刺激分子，因而诱导了T细胞耐受[5]。这种免疫耐受也不是不可改变的。Mancini等[5] 1993年直接用重组HBsAg或血源的HBsAg采用腹腔注射的方式成功地在HBV转基因鼠的体内诱导了体液免疫反应。1996年他们又用表达中蛋白的质粒免疫方式获得类似结果。转基因鼠肝脏表达HBV mRNA水平下降，而肝脏没有炎症表现，血中HBsAg消失，并通过脾细胞免疫过继实验证实了控制肝脏转基因表达的主要成分为T细胞[6]。Mancini等分析可能与pre-S2基因有关。我们通过肌肉注射自己构建的主蛋白表达质粒免疫转基因小鼠，也成功地诱导了抗体免疫应答。4只HBsAg阳性的转基因鼠免疫后16周检测HBsAg均为阴性，说明其肝脏的转基因表达可能受到抑制。这种作用并不需要重组质粒中含有pre-S2的基因。除此以外，PS诱导的抗-HBs也可能中和了部分HBsAg。质粒免疫产生的辅助性T淋巴细胞(Th)或细胞毒性T淋巴细胞(CTL)分泌的细胞因子如干扰素γ(IFNγ)、肿瘤坏死因子α(TNFα)在控制转基因的表达中可能发挥重要作用。HBsAg特异性CTL还能诱导表达HBsAg的肝细胞凋亡，减少了HBsAg的产生[7]。无论是何种机制，DNA免疫打破转基因鼠的免疫耐受，抑制HBV基因的表达这一现象为慢性乙型肝炎的治疗性疫苗的研究开辟了新的途径。我们对质粒免疫的30只小鼠观察16周，除2只因为操作不当致其意外死亡外，余未发现产生肿瘤或其他严重不良反应。但在应用于人体前，尚须克服注射DNA可能引起的不良反应，如DNA进入人体后，可能激活癌基因而致癌[8]及产生抗DNA抗体，引起人体自身免疫反应等[9]。虽尚未得到证实，但须进一步研究。
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图 2 免疫荧光检测PS 转染P815细胞稳定表达的结果 荧光染色×400
参考文献
1，Ulmer JB，Donnelly JJ，Parker SE, et al. Heterologous protection against influenza by injection of DNA encoding a viral protein. Science, 1993，259：1745-1749.
2，Robinson HL，Torres CA. DNA vaccine. Semin Immunol, 1997，9：271-283.
3，Craven DE，Awdeh ZL，Kunches LM, et al. Nonresponsiveness to hepatitis B vaccine in health care workers. Result of revaccination and genetic typings. Ann Intern Med, 1986，105：356-360.
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4，Davis HL， Michel ML，Whalen RG. DNA-based immunization induces continuous secretion of hepatitis B surface antigen and high levels of circulating antibody. Hum Mol Genet, 1993，2：1847-1851.
5，Mancini M， Hadchouel M， Tiollais P, et al. Induction of anti-hepatitis B surface antigen (HBsAg) antibodies in HBsAg producing transgenic mice: a possible way of circumventing “non-response” to HBsAg. J Med Virol, 1993,39:67-74.
6，Mancini M, Hadchouel M, Davis HL, et al. DNA-mediated immunization in a transgenic mouse model of the hepatitis B surface antigen chronic carrier state. Proc Natl Acad Sci U S A, 1996,93:12496-12501.
, 百拇医药
7，Schirmbeck R, Bohm W, Ando K, et al. Nucleic acid vaccination primes hepatitis B virus surface antigen-specific cytotoxic T lymphocytes in nonresponder mice. J Virol,1995,69:5929-5934.
8，Nichols WW, Ledwith BJ, Manam SV, et al. Potential DNA vaccine integration into host cell genome. Ann N Y Acad Sci, 1995, 772:30-39.
9，Mor G, Singla M, Steinberg AD, et al. Do DNA vaccines induce autoimmune disease? Hum Gen Ther, 1997, 8:293-300.
(收稿日期：1999-08-14), 百拇医药
单位：柯亨宁 斯崇文 于敏 刘丹 田秀兰(100034 北京医科大学第一医院感染疾病科)；成军(解放军第302医院基因治疗研究中心)
关键词：病毒，乙型肝炎；动物，转基因；疫苗，DNA
中华内科杂志000509 【摘要】 目的 观察乙型肝炎病毒S基因表达质粒(PS)诱导小鼠体液免疫及对HBV转基因(Tg)小鼠血清HBsAg的影响。 方法 将S基因插入到pcDNA3.1+的BamH1位点上构建了PS。体外证实PS表达HBsAg。再分别免疫BALB/C小鼠和Tg小鼠各10只。另用pcDNA3.1+免疫4只BALB/C小鼠。每只小鼠每次肌肉注射纯化质粒100 μg，共3次。用ELISA检测每份血清抗-HBs的效价。结果 PS免疫BALB/C小鼠，2～4周时出现抗-HBs，第8周时平均为135 IU/L。该PS免疫Tg鼠多在6～8周时出现抗体，平均39 IU/L。其中4只HBsAg阳性的Tg鼠免疫后HBsAg转阴。结论 PS不仅能够有效地诱导BALB/C和Tg小鼠的体液免疫，还能抑制Tg鼠HBsAg的产生。
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DNA immunization of a plasmid expressing HBsAg and its effect on the production of HBsAg in HBV-transgenic mice
KE Hengning SI Chongwen CHENG Jun
(Department of Infectious Disease, The First Teaching Hospital, Beijing Medical University, Beijing 100034, China)
【Abstract】 Objective To study the DNA immunization of a plasmid expressing HBsAg in BALB/C mice and HBV-transgenic (Tg) mice. Methods The S gene obtained by polymerase chain reaction was ligated with pGEM-Teasy vector and then subcloned into pcDNA 3.1+ to construct a new plasmid (PS), whose fidelity was verified through sequencing. The ability to express HBsAg was demonstrated by transfection of PS into P815 cells. The PS was then used to immunize 10 BALB/C mice and 10 Tg mice by way of injection. 4 mice were immunized with pcDNA3.1+. Each mouse was injected intramuscularly with one of those plasmids in the same total dose of 300 μg divided into 3 times. Another 6 BALB/ C mice were injected with HBsAg protein as control. All mice were bled before the immunization and biweekly thereafter. Sera of the mice were detected for anti-HBs with ELISA. Results 8 of the 10 mice immunized with PS had detectable anti-HBs. The average level of anti-HBs is 135 IU/L. While in the Tg mice, anti-HBs occurred during 6 to 8 weeks after injection. The average level is 39 IU/L. HBsAg became negative in all the 4 mice with sera positive for HBsAg before immunization. Conclusion PS is effective to elicit a positive humoral immune response in BALB/C mice. PS can also stimulate an immune response in Tg mice, which seems to be responsible for the disappearance of HBsAg.
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【Key word】 Hepatitis B virus; Animals, transgenic; Vaccines, DNA
DNA免疫(又称核酸免疫)是指裸DNA直接注射到皮肤或肌肉组织，并被转染到某种细胞里，转录mRNA，翻译成蛋白质抗原，通过主要组织相容性复合物(MHC)-Ⅰ和MHC-Ⅱ途径刺激机体产生相应的免疫应答。目前在许多传染和非传染性疾病的疫苗研究中有广泛的应用[1,2]。乙型肝炎病毒慢性感染目前尚无有效的抗病毒治疗方法。乙型肝炎病毒血源疫苗和重组疫苗均能有效地预防乙型肝炎病毒的感染。但是，约有10%的人群对现有的乙肝疫苗无应答[3]。我们通过构建乙型肝炎病毒S抗原的表达质粒(PS)研究其在正常免疫应答小鼠及转基因小鼠中诱导免疫应答的能力，并检测转基因小鼠血清HBsAg在注射PS前后的变化，为进一步研究治疗性疫苗打下基础。
材料与方法
, 百拇医药
1. PS的构建：载体PS pcDNA3.1+和含有HBV ayw亚型S基因的PS pCMV-S由成军博士惠赠。PGEM-Teasy Vecter Systems 购自Promega等公司。扩增S基因的上游引物：5′-GGAAGATCTATGGAGAAC-ATCACATCAGG-3′。下游引物：5′-GGAAGATCTTT-AAATGTATACCC-3′。划线部分分别为HBsAg基因上游20个核苷酸和下游14个核苷酸的反义序列。上述引物在美国Cybersyn公司合成。用PCR法，扩增25个循环。回收687 bp大小的片段，纯化后，与PGEM-Teasy载体片段连接。转化感受态JM109细菌，筛选、扩增、提取质粒。Bgl II酶切，低溶点胶收取683bp大小的带有黏端的目的基因片段，纯化。载体pcDNA3.1+质粒用BamH I酶切，去磷酸化，纯化。将目的基因片段与载体片段混匀，在T4连接酶的作用下，于16℃反应20 h。将连接产物转化感受态细胞铺制于含氨苄青霉素(100 mg/L)的LB培养基上37℃过夜，挑选菌落PCR阳性者，小提质粒，用Xba I酶切电泳。质粒送Cybersyn公司，采用荧光标记双脱氧链终止法双向测序。
, 百拇医药
2. PS转染P815细胞和稳定表达：P815细胞购自美国组织细胞培养中心(ATCC：TlB-64)。经培养后，将细胞配成1×105/ml, 分别接种于60 mm2的培养板中。转染pcDNA3.1+、PS两个质粒各6 μg。具体参照Lipofectin Reagent(购于Gibco-BRL公司)的试剂说明书。10 h后吸出无血清培养液，代之以完全DMEM。培养48 h后用G418(800 mg/L)的DMEM传代选择培养。10～20 d后长出贴壁生长的细胞克隆，逐个转至24孔培养板培养3 d后，再转至6孔培养板中扩增细胞。
3. 免疫荧光的检测方法：一抗用小鼠抗-HBs单克隆抗体，购自中国预防医学科学院病毒研究所。荧光标记的二抗(羊抗鼠IgG抗体)购自Jakson Immuno Research Laboratories(29497)。取40 μl培养的细胞悬液(105/ml)用甩片机甩在玻片上。冷丙酮固定10 min。一抗用小鼠抗-HBs单克隆抗体1∶10稀释，每点加30 μl。室温孵育30 min。PBS洗3次，加入1∶20稀释的FITC标记的二抗30 μl。室温孵育40 min。PBS洗3次，荧光显微镜下观察，选择部分阳性克隆拍照保存。
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4. 细胞的裂解及HBsAg的检测：细胞裂解液：50 mmol/L Tris，pH 8.0，150 mmol/L NaCl，0.02% NaN3, 1% NP-40,100 mg/L PMSF, 1% aprotinin。于临用前加入蛋白酶抑制剂PMSF(phenylmethyl-sulfonylfuoride) 100 g/L，每孔细胞加入PBS洗2次，弃尽PBS。加入裂解液0.5 ml ,置冰上20 min，用刮刀将细胞裂解液刮至一旁，收入离心管。4℃，12 000 g离心2 min。吸上清-70℃冻存待检。HBsAg的检测用RIA法，检测试剂盒购自北京北方生物技术研究所。转基因小鼠HBsAg采用华美公司的酶标试剂盒。具体步骤参照说明书，Cutoff值=2.1。
5. 质粒的大量制备：采用QIGEN Plasmid Purification (Mega) Kit (QIGEN Inc.,Germany)。每500 ml JM109转化株菌液可获高纯度质粒2.5 mg 。紫外分光光度仪定量。
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6. 免疫小鼠与抽血的方法：20只无菌的BALB/C 雌性小鼠，4～6周龄，购于中国药品生物制品检定所。随机分为4组并编号。A组：10只，免疫PS。B组：6只，免疫无氢氧化铝的HBsAg, 每只每次4 μg，共3次。C组：4只，免疫pcDNA3.1+质粒。D组：Tg种鼠购自美国Jakson实验室。实验用10只Tg鼠为在北京医科大学动物室繁殖第三代小鼠。所有小鼠饲养在无菌条件下。纯化的质粒溶于0.9%的生理盐水中。质粒浓度为1～2 g/L。PS免疫小鼠，每次注射PS 100 μg。每隔2周免疫1次，共3次。注射部位为小鼠大腿股四头肌。注射前及注射后，每隔2周用肝素化的毛细吸管从小鼠眼眶后取血200 μl。
7. ELISA法检测抗-HBs，ET1-AB-AUK-3(P001603)试剂盒购自意大利Diasorin公司。操作方法按说明书进行。
结果
1. PS的酶切和测序鉴定：图1显示PS用XbaI酶切后释放的610 bp大小的片段，根据酶切图谱分析，说明是正向插入的克隆质粒。克隆基因测序结果与Genebank(J02203V0146)保存的HBV ayw亚型的S基因序列完全一致。
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1： λDNA用EcoRI酶切的Marker; 2：酶切产物电泳条带
图1 PS用XbaI酶切后释放610 bp的片段
2.PS转染P815细胞稳定表达的结果：图2显示用免疫荧光法检测PS转染P815细胞稳定表达的结果。有表达的细胞克隆呈荧光染色阳性。而转染pcDNA3.1+质粒的克隆均阴性。
3. 放射免疫方法检测转染细胞上清和细胞裂解液的结果：PS转染细胞裂解液为阳性，P/N值为3.6。上清为阴性，P/N值为2.0。pcDNA3.1+质粒转染细胞裂解液P/N值为1.9。
4. PS免疫BALB/C小鼠抗-HBs的变化：10只小鼠中，8只抗-HBs 阳性。最高抗体效价达530 IU/L。其中1只出现1次阳性，抗体效价为5.8 IU/L。2周时2只抗-HBs阳性，4周时7只阳性。6～8周8只阳性。可见，抗体多于第一次免疫后4周出现，6～8周达到观察期高峰(表1)。
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表1 PS免疫BALB/C小鼠抗-HBs检测结果(IU/L) 时间
(周)
小鼠序号
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
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0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
2
32
0
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0
0
6
0
0
0
0
0
4
4.8
70
220
0
7.5
, http://www.100md.com
0
10
10
0
10
6
33
410
210
0
12
5.8
60
120
, 百拇医药
0
80
8
22
530
270
0
18
0
20
54
ND
30
注： ND：未检测
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5.不同组免疫小鼠抗体效价平均值的比较(表2)：pcDNA3.1+质粒免疫小鼠抗体始终阴性。A组PS免疫后的抗体效价比C组HBsAg蛋白免疫组低。观察结束时不同免疫组平均值，PS组：(135±172) IU/L。HBsAg免疫组：(480±356) IU/L。抗体效价进行对数转换后的方差分析显示F值为15.87 ，P<0. 01。免疫后第8周抗体效价3组(A、B、D)之间的 q检验显示差异有显著性(P<0.05)。
表2 各组免疫小鼠不同时间抗体效价均值的比较(IU/L) 组别
采样时间(周)
0
2
4
6
, 百拇医药 8
PcDNA3.1+(BALB/C鼠)
0
0
0
0
0
PS(BALB/C鼠)
0
17
96
117
135
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HBsAg (BALb/C鼠)
0
266
108
367
485
PS (Tg鼠)
0
163
103
20
39
6.HBV转基因鼠免疫PS后抗-HBs定量检测结果(表3)：10只免疫小鼠，除2只在免疫后6周和8周意外死亡外，其余8只抗-HBs均出现阳性。平均效价为39 IU/L。免疫2周后出现抗-HBs阳性者，10只中有3只，4周时10只中有2只，6周时9只中有4只，8周及10周时存活8只小鼠全部出现抗-HBs。其中1只小鼠免疫后第2周抗体效价即达到480 IU/L。
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7.转基因鼠免疫PS前后HBsAg检测结果：免疫前1、4、5、6号HBsAg阳性的转基因鼠于免疫后第16
表3 PS免疫个体HBV转基因鼠抗-HBs定量检测结果 (IU/L) 时间
(周)
小鼠序号
1
2
3
4
5
6
7
8
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9
10
2
4
3.6
0
0
0
0
0
480
0
0
4
, 百拇医药
0
0
0
0
0
0
0
200
0
5
6
ND
0
0
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8
5
0
0
45
0
20
8
ND
11
ND
7
6
9
, 百拇医药
8
43
6
8
10
ND
30
ND
48
30
7
18
43
20
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116
注： ND：为小鼠意外死亡，未检测
表4 PS免疫HBV转基因小鼠前后HBsAg检测结果(A450, P/N ) 时间
小鼠序号
1
2
3
4
5
6
7
8
, 百拇医药
9
10
免疫前
4
1.7
0.7
2.1
2.8
2.1
1.5
0.6
1.1
0.5
, http://www.100md.com 免疫16周
1.8*
1.0
1.3*
1.3
1.1
1.1
1.3
1.1
1.5
1.1
注：* 1、3号小鼠分别为免疫后6周和8周时的血清周全部转阴。如表4显示，P/N≥2.1为阳性。
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讨论
本实验证实PS能诱导BALB/C小鼠体液免疫反应。质粒免疫的关键是所构建的表达质粒能够转染机体的抗原提呈细胞，并高水平表达目的蛋白质。这些蛋白质在细胞内通过翻译后的修饰如糖基化，再折叠成具有抗原性的蛋白质。Heather L Davis 构建的表达 HBsAg 的pCMV-S 质粒含有巨细胞病毒(CMV)强启动子和促进分泌的信号肽序列。在S基因的下游还含有较长的非翻译区，其中包括多聚腺苷酸序列。该质粒免疫1次后(肌肉注射100 μg )成功诱导体液免疫反应[5]。我们用载体pcDNA3.1+构建的HBsAg表达质粒仅含有S基因的681个核苷酸。通过肌肉注射免疫小鼠，2周时即有1只小鼠产生抗-HBs，8周时7只抗-HBs效价大于10 IU/L。这一浓度在黑猩猩体内证实具有保护机体免受HBV攻击的作用。其中1只小鼠的抗-HBs达到530 IU/L。而用HBsAg蛋白质免疫小鼠产生的抗-HBs效价最高，平均达480 IU/L。2周时抗-HBs检测阳性率最高。这说明蛋白质抗原直接免疫的效果很好。也可能与我们使用的剂量较大有关。
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质粒免疫的另一特性是能够诱导较强的细胞免疫，对清除细胞内感染极为重要。本研究不仅证实了用PS免疫H-2b型HBV转基因小鼠，成功地诱导了抗体免疫反应，而且使其中4只HBsAg阳性的转基因小鼠HBsAg阴转。转基因鼠产生的HBsAg不能诱导表面抗体和相应细胞免疫的产生，其机制较为复杂。可能与其在发育阶段免疫系统接触了大量的表面抗原诱导了T细胞和B细胞的免疫耐受有关。这种引起机体耐受的机制与人体感染乙型肝炎病毒后引起的耐受有类似之处。都是由于肝细胞表达产生大量的HBsAg，而肝细胞本身缺乏免疫激活所需的共刺激分子，因而诱导了T细胞耐受[5]。这种免疫耐受也不是不可改变的。Mancini等[5] 1993年直接用重组HBsAg或血源的HBsAg采用腹腔注射的方式成功地在HBV转基因鼠的体内诱导了体液免疫反应。1996年他们又用表达中蛋白的质粒免疫方式获得类似结果。转基因鼠肝脏表达HBV mRNA水平下降，而肝脏没有炎症表现，血中HBsAg消失，并通过脾细胞免疫过继实验证实了控制肝脏转基因表达的主要成分为T细胞[6]。Mancini等分析可能与pre-S2基因有关。我们通过肌肉注射自己构建的主蛋白表达质粒免疫转基因小鼠，也成功地诱导了抗体免疫应答。4只HBsAg阳性的转基因鼠免疫后16周检测HBsAg均为阴性，说明其肝脏的转基因表达可能受到抑制。这种作用并不需要重组质粒中含有pre-S2的基因。除此以外，PS诱导的抗-HBs也可能中和了部分HBsAg。质粒免疫产生的辅助性T淋巴细胞(Th)或细胞毒性T淋巴细胞(CTL)分泌的细胞因子如干扰素γ(IFNγ)、肿瘤坏死因子α(TNFα)在控制转基因的表达中可能发挥重要作用。HBsAg特异性CTL还能诱导表达HBsAg的肝细胞凋亡，减少了HBsAg的产生[7]。无论是何种机制，DNA免疫打破转基因鼠的免疫耐受，抑制HBV基因的表达这一现象为慢性乙型肝炎的治疗性疫苗的研究开辟了新的途径。我们对质粒免疫的30只小鼠观察16周，除2只因为操作不当致其意外死亡外，余未发现产生肿瘤或其他严重不良反应。但在应用于人体前，尚须克服注射DNA可能引起的不良反应，如DNA进入人体后，可能激活癌基因而致癌[8]及产生抗DNA抗体，引起人体自身免疫反应等[9]。虽尚未得到证实，但须进一步研究。
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图 2 免疫荧光检测PS 转染P815细胞稳定表达的结果 荧光染色×400
参考文献
1，Ulmer JB，Donnelly JJ，Parker SE, et al. Heterologous protection against influenza by injection of DNA encoding a viral protein. Science, 1993，259：1745-1749.
2，Robinson HL，Torres CA. DNA vaccine. Semin Immunol, 1997，9：271-283.
3，Craven DE，Awdeh ZL，Kunches LM, et al. Nonresponsiveness to hepatitis B vaccine in health care workers. Result of revaccination and genetic typings. Ann Intern Med, 1986，105：356-360.
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4，Davis HL， Michel ML，Whalen RG. DNA-based immunization induces continuous secretion of hepatitis B surface antigen and high levels of circulating antibody. Hum Mol Genet, 1993，2：1847-1851.
5，Mancini M， Hadchouel M， Tiollais P, et al. Induction of anti-hepatitis B surface antigen (HBsAg) antibodies in HBsAg producing transgenic mice: a possible way of circumventing “non-response” to HBsAg. J Med Virol, 1993,39:67-74.
6，Mancini M, Hadchouel M, Davis HL, et al. DNA-mediated immunization in a transgenic mouse model of the hepatitis B surface antigen chronic carrier state. Proc Natl Acad Sci U S A, 1996,93:12496-12501.
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7，Schirmbeck R, Bohm W, Ando K, et al. Nucleic acid vaccination primes hepatitis B virus surface antigen-specific cytotoxic T lymphocytes in nonresponder mice. J Virol,1995,69:5929-5934.
8，Nichols WW, Ledwith BJ, Manam SV, et al. Potential DNA vaccine integration into host cell genome. Ann N Y Acad Sci, 1995, 772:30-39.
9，Mor G, Singla M, Steinberg AD, et al. Do DNA vaccines induce autoimmune disease? Hum Gen Ther, 1997, 8:293-300.
(收稿日期：1999-08-14), 百拇医药