环孢素A治疗再生障碍性贫血体外药敏试验的初步研究
作者：常英军 邹正辉 曹祥山 梁建英
单位：215004 江苏省，苏州医学院附属第二医院血液科
关键词：贫血，再生障碍性；环孢霉素
中华内科杂志000503 【摘要】 目的 建立一种有利于提高环孢素A(CsA)治疗再生障碍性贫血(再障)疗效的体外药敏试验方法。 方法 用体外集落培养法对14例再障患者进行CsA体外敏感试验并研究其与临床疗效的关系。 结果 体外/体内(S/R)(S：敏感，R：耐药)：S/S 7例，R/R 6例，R/S 1例。与临床总符合率为92.9%，阳性符合率100%，阴性符合率85.7%，试验敏感性87.5%，特异性100%。 结论 CsA体外敏感试验与临床疗效有很好的相关性，能较可靠的预测CsA的临床疗效。
A study on cyclosporin A sensitivity test in aplastic anemia
, http://www.100md.com
CHANG Yingjun ZOU Zhenghui CAO Xiangshan
(Department of Hematology, The Second Affiliated Hospital, Suzhou Medical College, Suzhou 215004, China)
【Abstract】 Objective To find a method of testing cyclosporin A (CsA) sensitivity for aplastic anemia (AA) in vitro. Methods The sensitivity of AA to CsA was estimated in 14 patients with AA by colony formation assay in vitro. The relationship of sensitivity test with clinical efficacy was investigated also. Results 7 patients were found to be sensitive both in vitro and in vivo, 6 to be resistant both in vitro and in vivo and the remaining one to be resistant in vitro, but sensitive in vivo. The general, positive and negative coincident rates of in vitro with in vivo and the specificity and sensitivity were 92.9%, 100%, 85.7%, 87.5% and 100% respectively. Conclusion This method is a good single drug test for the therapy of AA.
, 百拇医药
【Key words】 Anemia, aplastic； Cyclosporin
大量临床研究证实环孢素A (CsA)治疗再生障碍性贫血(再障)疗效确切[1]，但其单独应用的总有效率仅为50%～60%，且治疗费用较高。因此，我们研究了CsA体外药物敏感试验及其与临床疗效的关系，现报告如下。
资料与方法
1. 病例：再障组14例，急性再障2例，慢性再障12例；其中男6例，女8例，年龄12～61岁。正常对照组8例，男5例，女3例，平均年龄26岁，均为健康志愿者，骨髓象检查正常。
2. 治疗方案：CsA(瑞士Sandoz公司产品)治疗方法为CsA 4～6mg.kg-1.d-1，连续应用3个月以上，同时检测肝、肾功能。
, 百拇医药
3.骨髓造血祖细胞培养及CsA敏感试验：(1)粒-巨噬细胞集落(CFU-GM)培养：采用甲基纤维素法。经常规骨髓穿刺，抽取骨髓液3～5 ml，应用Ficoll-Hypaque淋巴细胞分离液分离单个核细胞(MNC)。培养体系组成：甲基纤维素1%，胎牛血清30%，牛血清蛋白1%，2-巯基乙醇1×10-4 mol/L，谷氨酰氨2 mmol/L，粒-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)50 μg/L，先灵葆雅(中国)有限公司，细胞1.5×105个，上述培养体系1.5 ml 混匀加注于24孔培养板内，设3个复孔，含骨髓MNC 0.5×105个/孔，置37℃、5%CO2饱和湿度的CO2培养箱内培养10 d，倒置显微镜下计数≥40个细胞为一个集落。(2)体外CsA敏感试验：CsA敏感试验组：14例再障患者骨髓MNC分别加入IMDM液稀释的浓度为1 mg/L的CsA溶液中37℃温育1h，IMDM液洗2次，使CsA液终浓度为0.33 mg/L，CFU-GM集落培养，每例再障患者同时行不经CsA温育的CFU-GM集落培养；8例正常对照CFU-GM培养同再障患者也分为CsA温育和不加CsA组。(3)体外药敏试验判定标准：依据我们的预试验并参考有关文献[2]标准制定如下：对照组集落数≥10个，则加药组集落较对照组增加50%以上为敏感；对照组集落数<10个，则加药组集落数绝对值较对照组增加6个以上为敏感。其他指标：体外药敏试验与临床结果的符合率为：S/S的例数与R/R的例数之和除以总例数×100%；阳性符合率为：S/S的例数除以S/S的例数与S/R的例数之和×100%； 阴性符合率为：R/R的例数除以R/R的例数与R/S的例数之和×100%；预测的敏感性为：S/S的例数除以S/S的例数与R/S的例数之和×100%；特异性为：R/R的例数除以S/R的例数与R/R的例数之和×100%。
, 百拇医药
4. 诊断及疗效标准：均按文献[3]标准。
5. 统计学处理：结果以均数±标准差(
±s)表示，组间比较采用两样本间t 检验，敏感试验前后比较采用自身对照t检验。
结果
1.骨髓CFU-GM培养结果(图1)：培养体系加及不加CsA时CFU-GM的生长情况，正常对照组CFU-GM数分别为：(109.6±29.7)个/105MNC 与(105.3±30.2)个/105MNC，P>0.8；体外对CsA不敏感的再障患者则为：(5.1±2.9)个/105MNC 和(3.7±3.6)个/105MNC，P>0.05；而体外对CsA敏感的再障患者CFU-GM数分别为：(12.9±4.2)个/105 MNC及(4.7±3.6)个/105MNC，P<0.001；并且再障组患者CFU-GM数显著低于正常对照组 P<0.01。可见，CsA不能明显增加正常对照组及体外对CsA不敏感的再障患者的CFU-GM数目，却明显促进CsA体外敏感再障患者的CFU-GM生长。
, 百拇医药
2.临床疗效与体外药敏试验结果：(1)临床疗效：14例再障患者中，3～6个月后，缓解3例，明显进步5例，无效6例，总有效率为57.1%。(2)临床疗效和体外药敏试验的关系：体外敏感7例，S/S7例，体外耐药7例，R/R 6例，R/S 1例。体外药敏试验与临床结果的符合率92.9%，阳性符合率100%，阴性符合率85.7%，预测的敏感性87.5%，特异性100%。(3)临床疗效与患者骨髓CFU-GM数的关系：8例CsA治疗有效的患者，治疗前骨髓CFU-GM数为(4.1±3.7)个/105MNC，与CsA治疗无效的6例患者的CFU-GM数(3.8±3.2)个/105MNC比较，差异无显著性(P>0.05)。
图1 再障患者敏感试验前后CFU-GM生长情况
讨论
, 百拇医药
CsA是由11个氨基酸残基组成的一种环化多肽，为土中霉菌的代谢产物，它主要通过抑制T淋巴细胞生成白细胞介素-2(IL-2)和γ-干扰素(INF-γ)等造血负调控因子以及阻止IL-2受体的表达，同时间接提高CFU-GM的生长而发挥其再障治疗作用。资料显示CsA单独或联合其他药物(雄激素、抗胸腺球蛋白、重组人粒细胞集落刺激因子及促红细胞生成素等)应用是治疗再障颇有前途的方案[4]。
近来，Bacigalupo等[5]报道白细胞≤5×109/L的再障患者对CsA反应率显著低于白细胞>5×109/L的患者(P＝0.002)，且生存率亦显著降低(P＝0.003)。Nakao等[6]分析了30例接受CsA治疗的再障病人的临床资料，结果表明这些患者诊断时骨髓涂片中红、粒两系细胞的比例(E/G)范围为0.15～5.26(正常为0.33)。经18个月治疗后，18例E/G>0.60的患者中15例对CsA有反应，而12例E/G≤0.60的患者组中仅有1例对CsA有反应(P<0.001)。此前，他们对23例再障患者CsA治疗前骨髓MNC INF-γ的mRNA进行检测后发现，13例CsA治疗有效的患者中有12例治疗前可检测到INF-γ mRNA的表达；而无效患者中仅有3例可检测到(P＝0.003)。这表明抑制INF-γ的过度生成不仅为CsA治疗再障机制之一，而且揭示治疗前测定INF-γ也可作为预测CsA疗效的一项指标。但这些指标预测CsA疗效的价值尚待评价。我们的研究显示，7例体外敏感患者体内应用CsA后均获得临床疗效，这与Tong等[7]的研究结果基本一致，他们发现CsA治疗有效的患者，体内和体外对CsA均有反应；不敏感的7例中1例在CsA敏感试验前后均无CFU-GM生长，体内应用却取得疗效，分析无集落生长的原因可能与骨髓抽取时骨髓液被稀释而未获取培养所需的造血干/祖细胞有关。研究初步表明CsA临床疗效与体外敏感试验的符合率为92.9%，且具有高度的敏感性和特异性，是一种体外预测CsA疗效的理想方法。此外，再障发病机制的多因素性决定了其药物治疗的综合性，因此，对CsA和雄激素等多种药物联合应用，治疗再障的疗效进行预测是值得今后进一步去探索的问题。
, 百拇医药
参考文献
1，Marsh JCW, Gordon-Smith EC. Treatment of aplastic anaemia with antilymphocyte globulin and cyclosporin. Int J Hematol,1995,62：133-144.
2，白任奎，赵志平，刘延方. 再生障碍性贫血体外集落药敏试验与临床疗效关系的研究. 中华血液学杂志，1989，10：63-64.
3，张之南，主编.血液学诊断及疗效标准. 第2版. 北京：科学出版社，1998.33-38.
4，邵宗鸿，郑以州，张益枝，等. 长效睾丸酮合并环孢霉素A治疗慢性再生障碍性贫血. 中华血液学杂志，1998，19：175-177.
5，Bacigalupo A, Broccia G, Corda G, et al. Antilymphocyte globulin, cyclosporin,and granulocyte colony-stimulating factor in patients with acquired severe aplastic anemia (SAA): a pilot study of the EBMT SAA Working Party. Blood,1995,85:1348-1353.
, http://www.100md.com
6，Nakao S, Yamaguchi M, Takamatsu H, et al. Relative erythroid hyperplasia in the bone marrow at diagnosis of aplastic anaemia: a predictive marker for a favourable response to cyclosporine therapy. Br J Haematol, 1996,92:318-323.
7，Tong J, Bacigalupo A, Piaggio G,et al. Severe aplastic anemia (SAA): response to cyclosporin A (CyA) in vivo and in vitro. Eur J Haematol,1991,46:212-216.
(收稿日期：1999-10-21), 百拇医药
单位：215004 江苏省，苏州医学院附属第二医院血液科
关键词：贫血，再生障碍性；环孢霉素
中华内科杂志000503 【摘要】 目的 建立一种有利于提高环孢素A(CsA)治疗再生障碍性贫血(再障)疗效的体外药敏试验方法。 方法 用体外集落培养法对14例再障患者进行CsA体外敏感试验并研究其与临床疗效的关系。 结果 体外/体内(S/R)(S：敏感，R：耐药)：S/S 7例，R/R 6例，R/S 1例。与临床总符合率为92.9%，阳性符合率100%，阴性符合率85.7%，试验敏感性87.5%，特异性100%。 结论 CsA体外敏感试验与临床疗效有很好的相关性，能较可靠的预测CsA的临床疗效。
A study on cyclosporin A sensitivity test in aplastic anemia
, http://www.100md.com
CHANG Yingjun ZOU Zhenghui CAO Xiangshan
(Department of Hematology, The Second Affiliated Hospital, Suzhou Medical College, Suzhou 215004, China)
【Abstract】 Objective To find a method of testing cyclosporin A (CsA) sensitivity for aplastic anemia (AA) in vitro. Methods The sensitivity of AA to CsA was estimated in 14 patients with AA by colony formation assay in vitro. The relationship of sensitivity test with clinical efficacy was investigated also. Results 7 patients were found to be sensitive both in vitro and in vivo, 6 to be resistant both in vitro and in vivo and the remaining one to be resistant in vitro, but sensitive in vivo. The general, positive and negative coincident rates of in vitro with in vivo and the specificity and sensitivity were 92.9%, 100%, 85.7%, 87.5% and 100% respectively. Conclusion This method is a good single drug test for the therapy of AA.
, 百拇医药
【Key words】 Anemia, aplastic； Cyclosporin
大量临床研究证实环孢素A (CsA)治疗再生障碍性贫血(再障)疗效确切[1]，但其单独应用的总有效率仅为50%～60%，且治疗费用较高。因此，我们研究了CsA体外药物敏感试验及其与临床疗效的关系，现报告如下。
资料与方法
1. 病例：再障组14例，急性再障2例，慢性再障12例；其中男6例，女8例，年龄12～61岁。正常对照组8例，男5例，女3例，平均年龄26岁，均为健康志愿者，骨髓象检查正常。
2. 治疗方案：CsA(瑞士Sandoz公司产品)治疗方法为CsA 4～6mg.kg-1.d-1，连续应用3个月以上，同时检测肝、肾功能。
, 百拇医药
3.骨髓造血祖细胞培养及CsA敏感试验：(1)粒-巨噬细胞集落(CFU-GM)培养：采用甲基纤维素法。经常规骨髓穿刺，抽取骨髓液3～5 ml，应用Ficoll-Hypaque淋巴细胞分离液分离单个核细胞(MNC)。培养体系组成：甲基纤维素1%，胎牛血清30%，牛血清蛋白1%，2-巯基乙醇1×10-4 mol/L，谷氨酰氨2 mmol/L，粒-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)50 μg/L，先灵葆雅(中国)有限公司，细胞1.5×105个，上述培养体系1.5 ml 混匀加注于24孔培养板内，设3个复孔，含骨髓MNC 0.5×105个/孔，置37℃、5%CO2饱和湿度的CO2培养箱内培养10 d，倒置显微镜下计数≥40个细胞为一个集落。(2)体外CsA敏感试验：CsA敏感试验组：14例再障患者骨髓MNC分别加入IMDM液稀释的浓度为1 mg/L的CsA溶液中37℃温育1h，IMDM液洗2次，使CsA液终浓度为0.33 mg/L，CFU-GM集落培养，每例再障患者同时行不经CsA温育的CFU-GM集落培养；8例正常对照CFU-GM培养同再障患者也分为CsA温育和不加CsA组。(3)体外药敏试验判定标准：依据我们的预试验并参考有关文献[2]标准制定如下：对照组集落数≥10个，则加药组集落较对照组增加50%以上为敏感；对照组集落数<10个，则加药组集落数绝对值较对照组增加6个以上为敏感。其他指标：体外药敏试验与临床结果的符合率为：S/S的例数与R/R的例数之和除以总例数×100%；阳性符合率为：S/S的例数除以S/S的例数与S/R的例数之和×100%； 阴性符合率为：R/R的例数除以R/R的例数与R/S的例数之和×100%；预测的敏感性为：S/S的例数除以S/S的例数与R/S的例数之和×100%；特异性为：R/R的例数除以S/R的例数与R/R的例数之和×100%。
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4. 诊断及疗效标准：均按文献[3]标准。
5. 统计学处理：结果以均数±标准差(
±s)表示，组间比较采用两样本间t 检验，敏感试验前后比较采用自身对照t检验。结果
1.骨髓CFU-GM培养结果(图1)：培养体系加及不加CsA时CFU-GM的生长情况，正常对照组CFU-GM数分别为：(109.6±29.7)个/105MNC 与(105.3±30.2)个/105MNC，P>0.8；体外对CsA不敏感的再障患者则为：(5.1±2.9)个/105MNC 和(3.7±3.6)个/105MNC，P>0.05；而体外对CsA敏感的再障患者CFU-GM数分别为：(12.9±4.2)个/105 MNC及(4.7±3.6)个/105MNC，P<0.001；并且再障组患者CFU-GM数显著低于正常对照组 P<0.01。可见，CsA不能明显增加正常对照组及体外对CsA不敏感的再障患者的CFU-GM数目，却明显促进CsA体外敏感再障患者的CFU-GM生长。
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2.临床疗效与体外药敏试验结果：(1)临床疗效：14例再障患者中，3～6个月后，缓解3例，明显进步5例，无效6例，总有效率为57.1%。(2)临床疗效和体外药敏试验的关系：体外敏感7例，S/S7例，体外耐药7例，R/R 6例，R/S 1例。体外药敏试验与临床结果的符合率92.9%，阳性符合率100%，阴性符合率85.7%，预测的敏感性87.5%，特异性100%。(3)临床疗效与患者骨髓CFU-GM数的关系：8例CsA治疗有效的患者，治疗前骨髓CFU-GM数为(4.1±3.7)个/105MNC，与CsA治疗无效的6例患者的CFU-GM数(3.8±3.2)个/105MNC比较，差异无显著性(P>0.05)。
图1 再障患者敏感试验前后CFU-GM生长情况
讨论
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CsA是由11个氨基酸残基组成的一种环化多肽，为土中霉菌的代谢产物，它主要通过抑制T淋巴细胞生成白细胞介素-2(IL-2)和γ-干扰素(INF-γ)等造血负调控因子以及阻止IL-2受体的表达，同时间接提高CFU-GM的生长而发挥其再障治疗作用。资料显示CsA单独或联合其他药物(雄激素、抗胸腺球蛋白、重组人粒细胞集落刺激因子及促红细胞生成素等)应用是治疗再障颇有前途的方案[4]。
近来，Bacigalupo等[5]报道白细胞≤5×109/L的再障患者对CsA反应率显著低于白细胞>5×109/L的患者(P＝0.002)，且生存率亦显著降低(P＝0.003)。Nakao等[6]分析了30例接受CsA治疗的再障病人的临床资料，结果表明这些患者诊断时骨髓涂片中红、粒两系细胞的比例(E/G)范围为0.15～5.26(正常为0.33)。经18个月治疗后，18例E/G>0.60的患者中15例对CsA有反应，而12例E/G≤0.60的患者组中仅有1例对CsA有反应(P<0.001)。此前，他们对23例再障患者CsA治疗前骨髓MNC INF-γ的mRNA进行检测后发现，13例CsA治疗有效的患者中有12例治疗前可检测到INF-γ mRNA的表达；而无效患者中仅有3例可检测到(P＝0.003)。这表明抑制INF-γ的过度生成不仅为CsA治疗再障机制之一，而且揭示治疗前测定INF-γ也可作为预测CsA疗效的一项指标。但这些指标预测CsA疗效的价值尚待评价。我们的研究显示，7例体外敏感患者体内应用CsA后均获得临床疗效，这与Tong等[7]的研究结果基本一致，他们发现CsA治疗有效的患者，体内和体外对CsA均有反应；不敏感的7例中1例在CsA敏感试验前后均无CFU-GM生长，体内应用却取得疗效，分析无集落生长的原因可能与骨髓抽取时骨髓液被稀释而未获取培养所需的造血干/祖细胞有关。研究初步表明CsA临床疗效与体外敏感试验的符合率为92.9%，且具有高度的敏感性和特异性，是一种体外预测CsA疗效的理想方法。此外，再障发病机制的多因素性决定了其药物治疗的综合性，因此，对CsA和雄激素等多种药物联合应用，治疗再障的疗效进行预测是值得今后进一步去探索的问题。
, 百拇医药
参考文献
1，Marsh JCW, Gordon-Smith EC. Treatment of aplastic anaemia with antilymphocyte globulin and cyclosporin. Int J Hematol,1995,62：133-144.
2，白任奎，赵志平，刘延方. 再生障碍性贫血体外集落药敏试验与临床疗效关系的研究. 中华血液学杂志，1989，10：63-64.
3，张之南，主编.血液学诊断及疗效标准. 第2版. 北京：科学出版社，1998.33-38.
4，邵宗鸿，郑以州，张益枝，等. 长效睾丸酮合并环孢霉素A治疗慢性再生障碍性贫血. 中华血液学杂志，1998，19：175-177.
5，Bacigalupo A, Broccia G, Corda G, et al. Antilymphocyte globulin, cyclosporin,and granulocyte colony-stimulating factor in patients with acquired severe aplastic anemia (SAA): a pilot study of the EBMT SAA Working Party. Blood,1995,85:1348-1353.
, http://www.100md.com
6，Nakao S, Yamaguchi M, Takamatsu H, et al. Relative erythroid hyperplasia in the bone marrow at diagnosis of aplastic anaemia: a predictive marker for a favourable response to cyclosporine therapy. Br J Haematol, 1996,92:318-323.
7，Tong J, Bacigalupo A, Piaggio G,et al. Severe aplastic anemia (SAA): response to cyclosporin A (CyA) in vivo and in vitro. Eur J Haematol,1991,46:212-216.
(收稿日期：1999-10-21), 百拇医药