移植物抗白血病效应的研究进展
作者：孙玉英 奚永志 孔繁华
单位：100039 北京， 军事医学科学院附属医院免疫学研究室
关键词：
中华内科杂志000633 自80年代以来，由于单克隆抗体、分子克隆等技术的发展，使得免疫细胞膜表面分子的研究进展十分迅速。免疫细胞膜表面分子包括大量重要的抗原、受体或其他分子，其中绝大部分属于CD分子。充分认识这些分子的结构、特性、分布及功能，对于透彻理解免疫应答规律是至关重要的。人类白细胞分化抗原国际协作组会议将识别同一分化抗原的来自不同实验室的单克隆抗体归为一个分化群，简称CD(cluster of differentiation, CD)。到目前为止，人类白细胞分化抗原的国际协作组会议共举行了6次，CD的序列号已至CD166[1]。CD抗原可以分为9个组，包括T细胞、B细胞、髓样细胞、NK细胞、血小板、活化抗原、黏附分子和细胞因子受体等。从另一个角度划分，CD分子又包括许多重要的黏附分子、免疫球蛋白超家族成员，它们广泛参与免疫活性细胞识别抗原，充当某些免疫活性物质的受体，介导细胞与基质间的黏附，介导机体的免疫应答，参与炎症、造血调控、创伤愈合、凝血、肿瘤发生和转移等重要的生理和病理过程[2]。
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免疫球蛋白(Ig)融合蛋白是指在基因水平将目的蛋白基因同Ig部分片段基因相连，并在真核或原核细胞中表达出的具有上述2部分结构域的重组蛋白。由于目的蛋白同免疫球蛋白部分结构域融合，使重组蛋白获得了多种新的特性：(1)引入的重链稳定区CH结构域使重组蛋白具有更长的半衰期，更适合于体内的应用。(2)通过抗Fc段亲和层析、葡萄球菌A(G)蛋白可以方便地进行纯化及免疫共沉淀实验。(3)由于存在大量商品化的与Fc段配套的产品，使融合蛋白的检测更加方便、特异、敏感。(4)Fc段具有穿过胎盘、结合补体并介导补体依赖的细胞毒作用，介导ADCC效应等，这一特性被应用于某些疾病的靶向性治疗。(5)不同Ig(IgG、IgM、IgA)Fc结构域可以形成多聚体分子，提高重组蛋白结合抗原或配体的能力。由于上述两方面的因素，CD/Ig融合蛋白被广泛应用于细胞膜表面分子结构与功能研究。以下对几种主要的CD/Ig融合蛋白研究概况作一简介。
1.CD4/Ig： CD4为膜表面糖蛋白，胞膜外区具有4个IgV样结构域，属免疫球蛋白超家族。HIV病毒能通过与CD4分子的第1个IgV样区结合而感染CD+4 T细胞，并最终导致获得性免疫缺陷综合征。为了利用CD4的这种特性治疗HIV感染，Chamow等[3]制备了CD4/IgG融合蛋白，包括CD4胞膜外区第1、2结构域、人Ig重链绞链区及Fc段，这种重组蛋白能与HIV-1 病毒结合，阻断HIV的感染过程，其体内半衰期较长，能通过Fc段发挥活化补体及抗体依赖细胞介导的ADCC作用，并能有效穿过胎盘对胎儿起到防护作用。在对16例AIDS患者进行的I期临床验证中，患者最大耐受为1 000 μg/kg，未发现有严重的毒性反应[4]。Traunecker等将CD4分子与不同亚类的免疫球蛋白重组，用CD4氨基端的2个结构域替换小鼠IgG2a或IgM的VH 和CH1区，CD4/IgM比CD4/IgG的抑制作用要强1 000倍以上，而且融合蛋白获得了结合Fc受体、结合补体成分Clq的功能[5]。Allaway等[6,7]将人IgG2重链及轻链可变区用人CD4的第1、2结构域替换，这样构建的四聚体能以nM级的亲和力结合于纯化的gp120蛋白。药代动力学显示CD4/IgG2融合蛋白在试验动物(兔)体内半衰期在1 d以上，而可溶性CD4分子半衰期仅为15 min。CD4/IgG2不能与细胞膜表面的Fc段受体结合，因此它不会产生抗体依赖的增强病毒感染作用。在细胞融合实验中，CD4/IgG2四聚体抑制合胞体形成的能力明显强于可溶性CD4分子，而且CD4/IgG2在较低的浓度下能有效中和多种HIV病毒株。在hu-PBL-SCID模型中，每kg体重给予10～50 mg融合蛋白能有效保护实验动物免于HIV感染，其保护作用明显强于HIV抗体(多克隆抗体在150 mg/kg 水平仍只有部分保护作用)，有进一步应用于体内的可能性。
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Zettlmeissl等[8]在真核细胞内表达了人CD4胞膜外区与人不同Ig重链稳定区的融合蛋白，这些融合蛋白能抑制HIV感染及HIV介导的细胞毒作用。作者制备的含绞链区CD4/IgG1分子能有效结合于HIV的gp160蛋白及人Fc受体，并具有补体辅助的抑制病毒传播的作用。小鼠及猴体内实验证实重组CD4/Ig融合蛋白半衰期长于可溶性的CD4分子。
MT-4为人T细胞系，对HIV-1高度敏感，在MT-4感染HIV-1后，用4 μg/ml的CD4/Ig即能完全阻断HIV-1诱导的特异性细胞病理学改变、抗原表达及病毒颗粒的释放，能完全抑制HIV诱导的合胞体形成。此融合蛋白在1 μg/ml的浓度下即能阻断HTLV-III/B和YU-1对外周血单个核细胞的感染。将Fc受体阳性的U937细胞用CD4/Ig融合蛋白预先处理，可以抑制HIV的感染(95%)。Chowdhury等[9]认为CD4/Ig融合蛋白有希望用于HIV的治疗。
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嗜碱性粒细胞及肥大细胞是IgE介导的I型变态反应的主要效应细胞，它们参与抗寄生虫、抗病毒及抗细菌免疫。Krauss等[10]构建的CD4/IgE融合蛋白包括CD4氨基端的2个结构域及IgE重链的CH2-4结构域，这种重组蛋白能与gp120蛋白结合，其同嗜碱性粒细胞膜表面高亲和力受体及淋巴细胞膜表面低亲和力受体的亲和力同天然IgE无明显差异。同时，融合蛋白中CD4结构域同gp120的结合特性也与天然CD4相似。在实验中发现，用CD4/IgE“武装”的嗜碱性粒细胞能在HIV病毒或HIV感染细胞的诱导下释放介质。作者进一步证实HIV结合的嗜碱性粒细胞使易感性T细胞内病毒的复制减弱。上述结果表明I型超敏反应的效应细胞及CD4/IgE有希望应用于HIV的治疗。
Batra等[11]将假单胞菌属外毒素PE40引入CD4分子，制备了CD4-PE40融合蛋白，为了增加融合蛋白在血清中的半衰期，作者将IgG1重链稳定区重组入CD4-PE40融合蛋白，构建了CD4-CH2-PE40、CD4-CH3-PE40、CD4-CH1-CH2-PE40及CD4-CH2-CH3-PE40融合蛋白。融合蛋白在大肠杆菌中表达并纯化，插入的IgG1稳定区对CD4-PE40的毒性无影响。这些融合蛋白对表达gp120蛋白的细胞具有相同的毒性。在CD4-PE40中插入IgG1稳定区增加了融合蛋白的半衰期，其中以CD4-CH2-PE40半衰期最长，为115 min。
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2.CD28/Ig与CTLA-4/Ig：免疫应答需要T-B细胞间的相互作用。CD28能通过与B7的相互作用活化B细胞。CD28和B7的反应也是T细胞活化的一个共刺激信号，TCR复合物及CD28介导的信号是T淋巴细胞活化所必须的。CD28分子表达于95%的CD+4和50%的CD+8T细胞膜表面，它是由2条Mr 44×103的多肽链通过二硫键形成的同源二聚体，分子量约为Mr 90×103，属免疫球蛋白超家族成员，CD28与CTLA-4高度同源，其配体包括B7-1(CD80)及B7-2(CD86)。
Linsley等[12]表达了B7和CD28/Ig融合蛋白，并证实125I标记的B7/Ig能结合于CD28转染的CHO细胞，抑制CD28介导的细胞黏附，并刺激T细胞增殖，而B7+ CHO能增加T细胞IL-2的转录水平，证实CD28信号通路能被B7激活，导致T细胞细胞因子分泌的增加、T细胞的增殖。由于CTLA4与CD28高度同源，因此，大多研究者都采用CTLA4/Ig融合蛋白代替CD28进行共刺激信号分子的研究。T细胞的活化需要2种信号，第一是T细胞受体与抗原提呈细胞的MHC复合物相互作用的信号，另一个为共刺激信号，如表达于抗原提呈细胞的B7抗原及表达于T细胞上的CD28分子。重组的CTLA4/Ig融合蛋白能以高亲和力结合于B7分子，通过CTLA4/Ig融合蛋白阻断CD28/B7的反应能在体内及体外抑制T细胞的活化。在MHC匹配的小鼠角膜移植模型中应用CTLA4/Ig(腹腔注射300 μg CTLA4/Ig)能延长移植物的存活[13]。
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在器官移植前对供体器官进行基因修饰可能是抑制或控制移植物抗宿主病的一个有效方法。Oral 等[14]通过重组腺病毒载体对角膜细胞进行了CTLA-4/Ig基因转染，在转染后第28天仍能检测到角膜细胞培养上清液中有融合蛋白的表达。表达的融合蛋白具有生物学活性，能结合CD80分子。在噬齿类模型中，选择性地通过B7特异性的融合蛋白CTLA4/Ig抑制T细胞共刺激信号能延长异体移植物的存活时间，抗CD40及其配体CD40L的抗体与CTLA4/Ig具有协同作用。在恒河猴模型中，CTLA4/Ig与CD40L特异性抗体协同作用要比它们单独作用时效率高100倍。在肾移植实验中，对照组的排斥反应时间为5～8 d，单独应用CTLA4/Ig或CD40L mAb组延长至20～98 d，而两者联合应用组延长至150 d以上。CTLA4/Ig及CD40L mAb对外周血T细胞和B细胞计数均无影响，亦无明显的毒副作用[15]。Yin等[16]将CD4 mAb与CTLA4/Ig联合应用于器官移植的动物模型中。结果，单独的CD4 mAb处理或CTLA4/Ig处理均能延长异体器官移植的存活期，两者协同能使器官的存活时间延长4倍。
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3.CD40/Ig：多种肾小球肾炎是由于自身抗体的产生引起的。正常情况下，B细胞产生抗体需要表达于T细胞膜表面的CD40L提供共刺激信号，CD40/CD40L的相互作用能诱导B细胞分化及免疫球蛋白的类别转换。Biancone等[17]通过CD40/Ig干扰CD40/CD40L的相互作用，观察了其对小鼠动物模型中膜型肾小球肾炎的治疗作用。给小鼠注射兔抗鼠肾小管IgG能诱导膜型肾小球肾炎。但在裸鼠中无法成功诱导，表明这一过程需要T细胞参与。注射兔抗鼠肾小管IgG 及CD40/Ig融合蛋白的C57BL/10小鼠只有迟发的自身反应，但没有膜型肾小球肾炎损伤，而融合蛋白对照组无保护作用。结果提示通过干扰CD40/CD40L共刺激信号通路能抑制T细胞依赖抗体的产生，阻止膜型肾小球肾炎的发生。
, 百拇医药 Chen等[18]采用人/鼠SCID嵌合模型研究CD40/CD40L在体液反应中的作用，首先将人外周血淋巴细胞植入SCID小鼠，制备人/鼠SCID嵌合模型。结果证实当CD40/CD40L相互作用受到抑制时，小鼠的多克隆体液免疫明显受到影响，当注射CD40/Ig融合蛋白、特异性的抗CD40或CD40L中和抗体后，这种反应明显受到抑制。在SCID小鼠中移植人淋巴细胞的同时注射上述中和试剂，可以抑制人抗鼠红细胞抗体及总Ig水平维持70 d。上述试剂有可能加以利用来抑制人类抗原特异性的体液免疫反应，如自身免疫病或过敏反应。
4.Fas/Ig：Fas抗原也被称为Apo-1，为CD95。Fas抗原是Mr 45×103的I型膜表面蛋白，属于肿瘤坏死因子/神经生长因子受体家族，Fas与其配体FasL结合能介导凋亡信号，在免疫反应调节中十分重要。T细胞杂交瘤膜表面的受体交联诱导FasL并上调Fas表达，导致其活化并凋亡，这种活化诱导的细胞凋亡需要RNA和蛋白的从头合成。Fas/Ig融合蛋白能阻断细胞凋亡的发生，但不能阻断细胞的活化[19]。
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在T细胞介导的细胞毒作用中，效应细胞表达FasL，而靶细胞表达Fas抗原。活化的CD4+ T细胞克隆BK1能裂解表达野生型Fas抗原的靶细胞，但不能裂解无Fas抗原表达的靶细胞，表明BK1介导的细胞裂解与Fas介导的信号转导有关。Hanabuchi等[20]通过Fas/Ig 融合蛋白证实CD3 mAb诱导BK1细胞活化并表达FasL，而静止BK1不表达FasL，并且BK1介导的细胞裂解能被Fas/Ig所阻断。Fas介导的细胞毒作用不仅限于BK1细胞，脾脏CD+4 T细胞及CD+8 T细胞均能介导Fas依赖的靶细胞裂解作用。gld/gld 小鼠由于其Fas抗原的缺陷，不能介导Fas依赖的细胞毒作用，作者认为Fas介导的靶细胞裂解参与了T细胞的细胞毒作用。Suda等[21]也证实，细胞毒T淋巴细胞杂交瘤PC60-d10S需要靶细胞表达Fas以诱导靶细胞的裂解，此CTL细胞系能被小鼠Fas/IgG1融合蛋白(mFas/IgFc)染色。而且，mFas/IgFc能抑制PC60-d10S的细胞毒活性。PC60-d10S经mFas/IgFc染色及Sorting分离后，这群细胞膜表面一种约Mr 40×103的蛋白能被mFas/IgFc免疫沉淀下来，通过mFas/IgFc纯化的这种蛋白对表达Fas的细胞具有细胞毒作用，但对不表达Fas的细胞无细胞毒作用。表明表达于PC60-d10S细胞膜表面的Mr 40×103的蛋白为Fas-L，它通过Fas抗原诱导凋亡。
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Tsutsui等[22]在研究IL-12对淋巴细胞作用时发现，对携带同基因CSA1M 或 OV-HM肿瘤的BALB/c或F1鼠全身注射rIL-12将导致肿瘤的完全消退。CSA1M肿瘤细胞表达Fas抗原，IFN-γ能使Fas表达增强。而OV-HM细胞不表达Fas抗原，亦不受IFN-γ诱导。只有CSA1M能被Fas mAb或表达FasL的细胞裂解，表明CSA1M细胞膜表面的Fas参与介导了细胞的凋亡。在携带CSA1M和OV-HM的小鼠注射IL-12后，其脾细胞中CD3+CD4-CD8-B220+淋巴细胞明显增加，这一表型的细胞对Fas+ CSA1M有较强的细胞毒作用，而对Fas-OV-HM肿瘤细胞无明显细胞毒作用，对CSA1M的裂解作用能被Fas/Ig融合蛋白完全阻断。上述结果表明IL-12能诱导具有细胞毒作用(FasL介导)淋巴细胞的扩增，促进了肿瘤的消退。
上述对CD4/Ig、CD28/Ig、CD40/Ig、CD95/Ig等重要的CD免疫球蛋白融合蛋白的应用概况作了简要介绍，从中可以看出，由于免疫球蛋白融合蛋白本身所具有的特点，它可以方便地通过组化实验、阻断实验、流式细胞仪技术等方法广泛地应用于CD分子功能的研究和配体/受体的鉴定，亦有希望作为一种改良的生物导弹应用于疾病的治疗中。
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参考文献
1，沈德诚.第六届国际人类白细胞分化抗原会议情况简介.细胞与分子免疫学杂志, 1997，13:68-72.
2，金伯泉，主编. 细胞和分子免疫学. 第1版. 西安：世界图书出版公司，1995.
3，Chamow SM, Peers DH, Byrn RA, et al. Enzymatic cleavage of a CD4 immunoadhesin generates crystallizable, biologically active Fd-like fragments. Biochemistry, 1990,29: 9885-9891 .
4，Chamow SM, Duliege AM, Ammann A, et al. CD4 immunoadhesins in anti-HIV therapy: new developments. Int J Cancer 1992, 7(Suppl): 69-72.
, 百拇医药
5，Traunecker A, Schneider J, Kiefer H, et al. Highly efficient neutralization of HIV with recombinant CD4-immunoglobulin molecules. Nature, 1989,339: 68-70.
6，Allaway GP, Davis Bruno KL, Beaudry GA, et al. Expression and characterization of CD4-IgG2, a novel heterotetramer that neutralizes primary HIV type 1 isolates. AIDS Res Hum Retroviruses, 1995,11: 533-539.
7，Gauduin MC, Allaway GP, Olson WC, et al. CD4immunoglobulin G2 protects Hu-PBL-SCID mice against challenge by primary human immunodeficiency virus type 1 isolates. J Virol, 1998,72:3475-3478.
, 百拇医药
8，Zettlmeissl G, Gregersen JP, Duport JM, et al. Expression and characterization of human CD4: immunoglobulin fusion proteins. DNA Cell Biol, 1990,9: 347-353.
9，Chowdhury IH, Koyanagi Y, Takamatsu K, et al. Evaluation of anti-human immunodeficiency virus effect of recombinant CD4immunoglobulin in vitro: a good candidate for AIDS treatment. Med Microbiol Immunol (Berl), 1991,180: 183-192.
10，Krauss S, Kufer P, Federle C, et al. Recombinant CD4IgE, a novel hybrid molecule, inducing basophils to respond to human immunodeficiency virus (HIV) and HIV-infected target cells. Eur J Immunol, 1995,25:192-199.
, 百拇医药
11，Batra JK, Kasturi S, Gallo MG, et al. Insertion of constant region domains of human IgG1 into CD4-PE40 increases its plasma half-life. Mol Immunol, 1993,30: 379-386.
12，Linsley PS, Braey W, Grosmaire L, et al. Binding of the B cell activation antigen B7 to CD28 costimulates T cell proliferation and interleukin 2 mRNA accumulation. J Exp Med, 1991,173:721-730.
13，Hoffmann F, Zhang EP, Pohl T, et al. Inhibition of corneal allograft reaction by CTLA4-Ig. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol, 1997, 235: 535-540.
, http://www.100md.com
14，Oral HB, Larkin DF, Fehervari Z, et al. Ex vivo adenovirus-mediated gene transfer and immunomodulatory protein production in human cornea. Gene Ther, 1997,4: 639-647.
15，Kirk AD, Harlan DM, Armstrong NN, et al. CTLA4-Ig and anti-CD40 ligand prevent renal allograft rejection in primates. Proc Natl Acad Sci USA, 1997,94: 8789-8794.
16，Yin DP, Sankary HN, Chong AS, et al. Effect of anti-CD4 monoclonal antibody combined with human CTLA4Ig on the survival of hamster liver and heart xenografts in Lewis rats. Transplantation, 1997,64:317-321.
, 百拇医药
17，Biancone L, Andres G, Ahn H, et al. Inhibition of the CD40CD40 ligand pathway prevents murine membranous glomerulonephritis. Kidney Int, 1995,48:458-468.
18，Chen FA, Williams SS, Fanslow WC, et al. Human antibody response in human peripheral blood leukocyte/severe combined immunodeficient chimeric model is dependent on B and T cell costimulation via CD40/CD40 ligand. J Immunol, 1995,155:2833-2840.
, 百拇医药
19，Ju ST, Panka DJ, Cui H, et al. Fas(CD95)/FasL interactions required for programmed cell death after T-cell activation. Nature, 1995,373:444-448.
20，Hanabuchi S, Koyanagi M, Kawasaki A, et al. Fas and its ligand in a general mechanism of T-cell-mediated cytotoxicity. Proc Natl Acad Sci USA, 1994,91: 4930-4934.
21，Suda T, Nagata S. Purification and characterization of the Fas-ligand that induces apoptosis. J Exp Med, 1994,179: 873-879.
22，Tsutsui T, Mu J, Ogawa M, et al. Administration of IL-12 induces a CD3+CD4CD8B220+ lymphoid population capable of eliciting cytolysis against Fas-positive tumor cells. J Immunol, 1997,159:2599-2605.
(收稿日期：1999-08-11), http://www.100md.com
单位：100039 北京， 军事医学科学院附属医院免疫学研究室
关键词：
中华内科杂志000633 自80年代以来，由于单克隆抗体、分子克隆等技术的发展，使得免疫细胞膜表面分子的研究进展十分迅速。免疫细胞膜表面分子包括大量重要的抗原、受体或其他分子，其中绝大部分属于CD分子。充分认识这些分子的结构、特性、分布及功能，对于透彻理解免疫应答规律是至关重要的。人类白细胞分化抗原国际协作组会议将识别同一分化抗原的来自不同实验室的单克隆抗体归为一个分化群，简称CD(cluster of differentiation, CD)。到目前为止，人类白细胞分化抗原的国际协作组会议共举行了6次，CD的序列号已至CD166[1]。CD抗原可以分为9个组，包括T细胞、B细胞、髓样细胞、NK细胞、血小板、活化抗原、黏附分子和细胞因子受体等。从另一个角度划分，CD分子又包括许多重要的黏附分子、免疫球蛋白超家族成员，它们广泛参与免疫活性细胞识别抗原，充当某些免疫活性物质的受体，介导细胞与基质间的黏附，介导机体的免疫应答，参与炎症、造血调控、创伤愈合、凝血、肿瘤发生和转移等重要的生理和病理过程[2]。
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免疫球蛋白(Ig)融合蛋白是指在基因水平将目的蛋白基因同Ig部分片段基因相连，并在真核或原核细胞中表达出的具有上述2部分结构域的重组蛋白。由于目的蛋白同免疫球蛋白部分结构域融合，使重组蛋白获得了多种新的特性：(1)引入的重链稳定区CH结构域使重组蛋白具有更长的半衰期，更适合于体内的应用。(2)通过抗Fc段亲和层析、葡萄球菌A(G)蛋白可以方便地进行纯化及免疫共沉淀实验。(3)由于存在大量商品化的与Fc段配套的产品，使融合蛋白的检测更加方便、特异、敏感。(4)Fc段具有穿过胎盘、结合补体并介导补体依赖的细胞毒作用，介导ADCC效应等，这一特性被应用于某些疾病的靶向性治疗。(5)不同Ig(IgG、IgM、IgA)Fc结构域可以形成多聚体分子，提高重组蛋白结合抗原或配体的能力。由于上述两方面的因素，CD/Ig融合蛋白被广泛应用于细胞膜表面分子结构与功能研究。以下对几种主要的CD/Ig融合蛋白研究概况作一简介。
1.CD4/Ig： CD4为膜表面糖蛋白，胞膜外区具有4个IgV样结构域，属免疫球蛋白超家族。HIV病毒能通过与CD4分子的第1个IgV样区结合而感染CD+4 T细胞，并最终导致获得性免疫缺陷综合征。为了利用CD4的这种特性治疗HIV感染，Chamow等[3]制备了CD4/IgG融合蛋白，包括CD4胞膜外区第1、2结构域、人Ig重链绞链区及Fc段，这种重组蛋白能与HIV-1 病毒结合，阻断HIV的感染过程，其体内半衰期较长，能通过Fc段发挥活化补体及抗体依赖细胞介导的ADCC作用，并能有效穿过胎盘对胎儿起到防护作用。在对16例AIDS患者进行的I期临床验证中，患者最大耐受为1 000 μg/kg，未发现有严重的毒性反应[4]。Traunecker等将CD4分子与不同亚类的免疫球蛋白重组，用CD4氨基端的2个结构域替换小鼠IgG2a或IgM的VH 和CH1区，CD4/IgM比CD4/IgG的抑制作用要强1 000倍以上，而且融合蛋白获得了结合Fc受体、结合补体成分Clq的功能[5]。Allaway等[6,7]将人IgG2重链及轻链可变区用人CD4的第1、2结构域替换，这样构建的四聚体能以nM级的亲和力结合于纯化的gp120蛋白。药代动力学显示CD4/IgG2融合蛋白在试验动物(兔)体内半衰期在1 d以上，而可溶性CD4分子半衰期仅为15 min。CD4/IgG2不能与细胞膜表面的Fc段受体结合，因此它不会产生抗体依赖的增强病毒感染作用。在细胞融合实验中，CD4/IgG2四聚体抑制合胞体形成的能力明显强于可溶性CD4分子，而且CD4/IgG2在较低的浓度下能有效中和多种HIV病毒株。在hu-PBL-SCID模型中，每kg体重给予10～50 mg融合蛋白能有效保护实验动物免于HIV感染，其保护作用明显强于HIV抗体(多克隆抗体在150 mg/kg 水平仍只有部分保护作用)，有进一步应用于体内的可能性。
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Zettlmeissl等[8]在真核细胞内表达了人CD4胞膜外区与人不同Ig重链稳定区的融合蛋白，这些融合蛋白能抑制HIV感染及HIV介导的细胞毒作用。作者制备的含绞链区CD4/IgG1分子能有效结合于HIV的gp160蛋白及人Fc受体，并具有补体辅助的抑制病毒传播的作用。小鼠及猴体内实验证实重组CD4/Ig融合蛋白半衰期长于可溶性的CD4分子。
MT-4为人T细胞系，对HIV-1高度敏感，在MT-4感染HIV-1后，用4 μg/ml的CD4/Ig即能完全阻断HIV-1诱导的特异性细胞病理学改变、抗原表达及病毒颗粒的释放，能完全抑制HIV诱导的合胞体形成。此融合蛋白在1 μg/ml的浓度下即能阻断HTLV-III/B和YU-1对外周血单个核细胞的感染。将Fc受体阳性的U937细胞用CD4/Ig融合蛋白预先处理，可以抑制HIV的感染(95%)。Chowdhury等[9]认为CD4/Ig融合蛋白有希望用于HIV的治疗。
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嗜碱性粒细胞及肥大细胞是IgE介导的I型变态反应的主要效应细胞，它们参与抗寄生虫、抗病毒及抗细菌免疫。Krauss等[10]构建的CD4/IgE融合蛋白包括CD4氨基端的2个结构域及IgE重链的CH2-4结构域，这种重组蛋白能与gp120蛋白结合，其同嗜碱性粒细胞膜表面高亲和力受体及淋巴细胞膜表面低亲和力受体的亲和力同天然IgE无明显差异。同时，融合蛋白中CD4结构域同gp120的结合特性也与天然CD4相似。在实验中发现，用CD4/IgE“武装”的嗜碱性粒细胞能在HIV病毒或HIV感染细胞的诱导下释放介质。作者进一步证实HIV结合的嗜碱性粒细胞使易感性T细胞内病毒的复制减弱。上述结果表明I型超敏反应的效应细胞及CD4/IgE有希望应用于HIV的治疗。
Batra等[11]将假单胞菌属外毒素PE40引入CD4分子，制备了CD4-PE40融合蛋白，为了增加融合蛋白在血清中的半衰期，作者将IgG1重链稳定区重组入CD4-PE40融合蛋白，构建了CD4-CH2-PE40、CD4-CH3-PE40、CD4-CH1-CH2-PE40及CD4-CH2-CH3-PE40融合蛋白。融合蛋白在大肠杆菌中表达并纯化，插入的IgG1稳定区对CD4-PE40的毒性无影响。这些融合蛋白对表达gp120蛋白的细胞具有相同的毒性。在CD4-PE40中插入IgG1稳定区增加了融合蛋白的半衰期，其中以CD4-CH2-PE40半衰期最长，为115 min。
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2.CD28/Ig与CTLA-4/Ig：免疫应答需要T-B细胞间的相互作用。CD28能通过与B7的相互作用活化B细胞。CD28和B7的反应也是T细胞活化的一个共刺激信号，TCR复合物及CD28介导的信号是T淋巴细胞活化所必须的。CD28分子表达于95%的CD+4和50%的CD+8T细胞膜表面，它是由2条Mr 44×103的多肽链通过二硫键形成的同源二聚体，分子量约为Mr 90×103，属免疫球蛋白超家族成员，CD28与CTLA-4高度同源，其配体包括B7-1(CD80)及B7-2(CD86)。
Linsley等[12]表达了B7和CD28/Ig融合蛋白，并证实125I标记的B7/Ig能结合于CD28转染的CHO细胞，抑制CD28介导的细胞黏附，并刺激T细胞增殖，而B7+ CHO能增加T细胞IL-2的转录水平，证实CD28信号通路能被B7激活，导致T细胞细胞因子分泌的增加、T细胞的增殖。由于CTLA4与CD28高度同源，因此，大多研究者都采用CTLA4/Ig融合蛋白代替CD28进行共刺激信号分子的研究。T细胞的活化需要2种信号，第一是T细胞受体与抗原提呈细胞的MHC复合物相互作用的信号，另一个为共刺激信号，如表达于抗原提呈细胞的B7抗原及表达于T细胞上的CD28分子。重组的CTLA4/Ig融合蛋白能以高亲和力结合于B7分子，通过CTLA4/Ig融合蛋白阻断CD28/B7的反应能在体内及体外抑制T细胞的活化。在MHC匹配的小鼠角膜移植模型中应用CTLA4/Ig(腹腔注射300 μg CTLA4/Ig)能延长移植物的存活[13]。
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在器官移植前对供体器官进行基因修饰可能是抑制或控制移植物抗宿主病的一个有效方法。Oral 等[14]通过重组腺病毒载体对角膜细胞进行了CTLA-4/Ig基因转染，在转染后第28天仍能检测到角膜细胞培养上清液中有融合蛋白的表达。表达的融合蛋白具有生物学活性，能结合CD80分子。在噬齿类模型中，选择性地通过B7特异性的融合蛋白CTLA4/Ig抑制T细胞共刺激信号能延长异体移植物的存活时间，抗CD40及其配体CD40L的抗体与CTLA4/Ig具有协同作用。在恒河猴模型中，CTLA4/Ig与CD40L特异性抗体协同作用要比它们单独作用时效率高100倍。在肾移植实验中，对照组的排斥反应时间为5～8 d，单独应用CTLA4/Ig或CD40L mAb组延长至20～98 d，而两者联合应用组延长至150 d以上。CTLA4/Ig及CD40L mAb对外周血T细胞和B细胞计数均无影响，亦无明显的毒副作用[15]。Yin等[16]将CD4 mAb与CTLA4/Ig联合应用于器官移植的动物模型中。结果，单独的CD4 mAb处理或CTLA4/Ig处理均能延长异体器官移植的存活期，两者协同能使器官的存活时间延长4倍。
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3.CD40/Ig：多种肾小球肾炎是由于自身抗体的产生引起的。正常情况下，B细胞产生抗体需要表达于T细胞膜表面的CD40L提供共刺激信号，CD40/CD40L的相互作用能诱导B细胞分化及免疫球蛋白的类别转换。Biancone等[17]通过CD40/Ig干扰CD40/CD40L的相互作用，观察了其对小鼠动物模型中膜型肾小球肾炎的治疗作用。给小鼠注射兔抗鼠肾小管IgG能诱导膜型肾小球肾炎。但在裸鼠中无法成功诱导，表明这一过程需要T细胞参与。注射兔抗鼠肾小管IgG 及CD40/Ig融合蛋白的C57BL/10小鼠只有迟发的自身反应，但没有膜型肾小球肾炎损伤，而融合蛋白对照组无保护作用。结果提示通过干扰CD40/CD40L共刺激信号通路能抑制T细胞依赖抗体的产生，阻止膜型肾小球肾炎的发生。
, 百拇医药 Chen等[18]采用人/鼠SCID嵌合模型研究CD40/CD40L在体液反应中的作用，首先将人外周血淋巴细胞植入SCID小鼠，制备人/鼠SCID嵌合模型。结果证实当CD40/CD40L相互作用受到抑制时，小鼠的多克隆体液免疫明显受到影响，当注射CD40/Ig融合蛋白、特异性的抗CD40或CD40L中和抗体后，这种反应明显受到抑制。在SCID小鼠中移植人淋巴细胞的同时注射上述中和试剂，可以抑制人抗鼠红细胞抗体及总Ig水平维持70 d。上述试剂有可能加以利用来抑制人类抗原特异性的体液免疫反应，如自身免疫病或过敏反应。
4.Fas/Ig：Fas抗原也被称为Apo-1，为CD95。Fas抗原是Mr 45×103的I型膜表面蛋白，属于肿瘤坏死因子/神经生长因子受体家族，Fas与其配体FasL结合能介导凋亡信号，在免疫反应调节中十分重要。T细胞杂交瘤膜表面的受体交联诱导FasL并上调Fas表达，导致其活化并凋亡，这种活化诱导的细胞凋亡需要RNA和蛋白的从头合成。Fas/Ig融合蛋白能阻断细胞凋亡的发生，但不能阻断细胞的活化[19]。
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在T细胞介导的细胞毒作用中，效应细胞表达FasL，而靶细胞表达Fas抗原。活化的CD4+ T细胞克隆BK1能裂解表达野生型Fas抗原的靶细胞，但不能裂解无Fas抗原表达的靶细胞，表明BK1介导的细胞裂解与Fas介导的信号转导有关。Hanabuchi等[20]通过Fas/Ig 融合蛋白证实CD3 mAb诱导BK1细胞活化并表达FasL，而静止BK1不表达FasL，并且BK1介导的细胞裂解能被Fas/Ig所阻断。Fas介导的细胞毒作用不仅限于BK1细胞，脾脏CD+4 T细胞及CD+8 T细胞均能介导Fas依赖的靶细胞裂解作用。gld/gld 小鼠由于其Fas抗原的缺陷，不能介导Fas依赖的细胞毒作用，作者认为Fas介导的靶细胞裂解参与了T细胞的细胞毒作用。Suda等[21]也证实，细胞毒T淋巴细胞杂交瘤PC60-d10S需要靶细胞表达Fas以诱导靶细胞的裂解，此CTL细胞系能被小鼠Fas/IgG1融合蛋白(mFas/IgFc)染色。而且，mFas/IgFc能抑制PC60-d10S的细胞毒活性。PC60-d10S经mFas/IgFc染色及Sorting分离后，这群细胞膜表面一种约Mr 40×103的蛋白能被mFas/IgFc免疫沉淀下来，通过mFas/IgFc纯化的这种蛋白对表达Fas的细胞具有细胞毒作用，但对不表达Fas的细胞无细胞毒作用。表明表达于PC60-d10S细胞膜表面的Mr 40×103的蛋白为Fas-L，它通过Fas抗原诱导凋亡。
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Tsutsui等[22]在研究IL-12对淋巴细胞作用时发现，对携带同基因CSA1M 或 OV-HM肿瘤的BALB/c或F1鼠全身注射rIL-12将导致肿瘤的完全消退。CSA1M肿瘤细胞表达Fas抗原，IFN-γ能使Fas表达增强。而OV-HM细胞不表达Fas抗原，亦不受IFN-γ诱导。只有CSA1M能被Fas mAb或表达FasL的细胞裂解，表明CSA1M细胞膜表面的Fas参与介导了细胞的凋亡。在携带CSA1M和OV-HM的小鼠注射IL-12后，其脾细胞中CD3+CD4-CD8-B220+淋巴细胞明显增加，这一表型的细胞对Fas+ CSA1M有较强的细胞毒作用，而对Fas-OV-HM肿瘤细胞无明显细胞毒作用，对CSA1M的裂解作用能被Fas/Ig融合蛋白完全阻断。上述结果表明IL-12能诱导具有细胞毒作用(FasL介导)淋巴细胞的扩增，促进了肿瘤的消退。
上述对CD4/Ig、CD28/Ig、CD40/Ig、CD95/Ig等重要的CD免疫球蛋白融合蛋白的应用概况作了简要介绍，从中可以看出，由于免疫球蛋白融合蛋白本身所具有的特点，它可以方便地通过组化实验、阻断实验、流式细胞仪技术等方法广泛地应用于CD分子功能的研究和配体/受体的鉴定，亦有希望作为一种改良的生物导弹应用于疾病的治疗中。
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参考文献
1，沈德诚.第六届国际人类白细胞分化抗原会议情况简介.细胞与分子免疫学杂志, 1997，13:68-72.
2，金伯泉，主编. 细胞和分子免疫学. 第1版. 西安：世界图书出版公司，1995.
3，Chamow SM, Peers DH, Byrn RA, et al. Enzymatic cleavage of a CD4 immunoadhesin generates crystallizable, biologically active Fd-like fragments. Biochemistry, 1990,29: 9885-9891 .
4，Chamow SM, Duliege AM, Ammann A, et al. CD4 immunoadhesins in anti-HIV therapy: new developments. Int J Cancer 1992, 7(Suppl): 69-72.
, 百拇医药
5，Traunecker A, Schneider J, Kiefer H, et al. Highly efficient neutralization of HIV with recombinant CD4-immunoglobulin molecules. Nature, 1989,339: 68-70.
6，Allaway GP, Davis Bruno KL, Beaudry GA, et al. Expression and characterization of CD4-IgG2, a novel heterotetramer that neutralizes primary HIV type 1 isolates. AIDS Res Hum Retroviruses, 1995,11: 533-539.
7，Gauduin MC, Allaway GP, Olson WC, et al. CD4immunoglobulin G2 protects Hu-PBL-SCID mice against challenge by primary human immunodeficiency virus type 1 isolates. J Virol, 1998,72:3475-3478.
, 百拇医药
8，Zettlmeissl G, Gregersen JP, Duport JM, et al. Expression and characterization of human CD4: immunoglobulin fusion proteins. DNA Cell Biol, 1990,9: 347-353.
9，Chowdhury IH, Koyanagi Y, Takamatsu K, et al. Evaluation of anti-human immunodeficiency virus effect of recombinant CD4immunoglobulin in vitro: a good candidate for AIDS treatment. Med Microbiol Immunol (Berl), 1991,180: 183-192.
10，Krauss S, Kufer P, Federle C, et al. Recombinant CD4IgE, a novel hybrid molecule, inducing basophils to respond to human immunodeficiency virus (HIV) and HIV-infected target cells. Eur J Immunol, 1995,25:192-199.
, 百拇医药
11，Batra JK, Kasturi S, Gallo MG, et al. Insertion of constant region domains of human IgG1 into CD4-PE40 increases its plasma half-life. Mol Immunol, 1993,30: 379-386.
12，Linsley PS, Braey W, Grosmaire L, et al. Binding of the B cell activation antigen B7 to CD28 costimulates T cell proliferation and interleukin 2 mRNA accumulation. J Exp Med, 1991,173:721-730.
13，Hoffmann F, Zhang EP, Pohl T, et al. Inhibition of corneal allograft reaction by CTLA4-Ig. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol, 1997, 235: 535-540.
, http://www.100md.com
14，Oral HB, Larkin DF, Fehervari Z, et al. Ex vivo adenovirus-mediated gene transfer and immunomodulatory protein production in human cornea. Gene Ther, 1997,4: 639-647.
15，Kirk AD, Harlan DM, Armstrong NN, et al. CTLA4-Ig and anti-CD40 ligand prevent renal allograft rejection in primates. Proc Natl Acad Sci USA, 1997,94: 8789-8794.
16，Yin DP, Sankary HN, Chong AS, et al. Effect of anti-CD4 monoclonal antibody combined with human CTLA4Ig on the survival of hamster liver and heart xenografts in Lewis rats. Transplantation, 1997,64:317-321.
, 百拇医药
17，Biancone L, Andres G, Ahn H, et al. Inhibition of the CD40CD40 ligand pathway prevents murine membranous glomerulonephritis. Kidney Int, 1995,48:458-468.
18，Chen FA, Williams SS, Fanslow WC, et al. Human antibody response in human peripheral blood leukocyte/severe combined immunodeficient chimeric model is dependent on B and T cell costimulation via CD40/CD40 ligand. J Immunol, 1995,155:2833-2840.
, 百拇医药
19，Ju ST, Panka DJ, Cui H, et al. Fas(CD95)/FasL interactions required for programmed cell death after T-cell activation. Nature, 1995,373:444-448.
20，Hanabuchi S, Koyanagi M, Kawasaki A, et al. Fas and its ligand in a general mechanism of T-cell-mediated cytotoxicity. Proc Natl Acad Sci USA, 1994,91: 4930-4934.
21，Suda T, Nagata S. Purification and characterization of the Fas-ligand that induces apoptosis. J Exp Med, 1994,179: 873-879.
22，Tsutsui T, Mu J, Ogawa M, et al. Administration of IL-12 induces a CD3+CD4CD8B220+ lymphoid population capable of eliciting cytolysis against Fas-positive tumor cells. J Immunol, 1997,159:2599-2605.
(收稿日期：1999-08-11), http://www.100md.com