细胞间黏附分子-1在肾小球炎症过程中的作用及霉酚酸酯的保护效应
作者：郭志勇 崔若兰
单位：第二军医大学附属长海医院肾内科 上海，200433
关键词：
中华内科杂志000724 为探讨细胞间黏附分子-1(ICAM-1)在肾小球炎症过程中的作用，我们观察肿瘤坏死因子α(TNFα)对MC与巨噬细胞黏附的影响，以及新型免疫抑制剂霉酚酸酯(MMF)的保护效应。
一、材料和方法
1.材料：采用雄性SD大鼠，体重200～250 g，购自上海西普尔必凯实验有限公司；抗ICAM-1单克隆抗体由美国Rabb教授惠赠；MMF由罗氏公司惠赠。
2.系膜细胞、巨噬细胞培养：按经典方法培养、鉴定大鼠肾小球系膜细胞和巨噬细胞，选4～6代细胞用于本实验。
, 百拇医药
3.细胞增殖的测定：采用细胞增殖测定试剂盒，通过四唑盐MTS经细胞线粒体的代谢率来反映存活的细胞数。
4.TNFα对MC与巨噬细胞黏附的影响：生长致密的MC经消化制成细胞悬液，以1.0×104个/L接种于96孔培养板内，置37℃、5% CO2孵箱内孵育48 h，生成致密单层。加入不同剂量TNFα(5、50、100、250 IU)继续孵育不同时间(8、16、24、48h)后取出。用Hank液冲洗3次后，每孔加入巨噬细胞悬液100 μl(1.0×104个/孔)置37 ℃、5% CO2孵箱内孵育30 min。小心吸出未结合的巨噬细胞，并用含0.1% BSA的磷酸缓冲液轻轻荡洗，用Bath等建立的测定髓过氧化物酶(MPO)活性的方法对结合的巨噬细胞进行定量测定。
5.MMF对MC与巨噬细胞黏附的影响：MC单层先与不同浓度的MMF(0、0.1、1.0、10.0 mmol/L)共同孵育4 h后，再用浓度为100 IU的TNFα刺激24 h，加入巨噬细胞悬液，测定MPO活性，并计算MMF抑制率。
, 百拇医药
抑制率=(TNFα黏附率-MMF黏附率)/(TNFα黏附率-基础黏附率)×100%
6.统计学分析：实验数据以
±s表示，各组间比较采用方差分析，统计过程在SPLM统计软件上完成。
二、结果
1.TNFα刺激MC与巨噬细胞黏附的时效、量效结果：TNFα 100 IU刺激MC 8 h，即可明显诱导MC与巨噬细胞黏附，黏附率为(54.7±2.3) %，基础黏附率为(45.2±1.6) %，16 h黏附率为(57.3±2.8)%,24 h黏附率达到高峰，为(68.8%±1.2)%，48 h黏附率为(63.5%±2.9)%，与24 h相比略有下降，但差别不明显，故选择24 h作为TNFα刺激时间。
TNFα刺激MC单层24 h后，加入巨噬细胞。结果表明：TNFα浓度为0、5、50、100、250 IU时，MC与巨噬细胞的黏附率分别为(42.3±2.1)%、(48.1±3.2)%、(54.7±1.9)%、(63.6±3.1)%、(58.7±2.5)%(P<0.01)。
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2.MMF对TNFα诱导后MC与巨噬细胞黏附的影响： MMF浓度为0.1～10.0 mmol/L时，呈剂量依赖性显著抑制TNFα诱导MC与巨噬细胞黏附，且MMF浓度为0.1、1.0、10.0 mmol/L时，其抑制率分别为24.6%、51.2%及86.9%(表1)。
表1 不同浓度的霉酚酸酯对TNFα诱导后肾小球
系膜细胞与巨噬细胞黏附的影响 霉酚酸酯浓度
(mmol/L)
肿瘤坏死因子
(IU)
黏附率
(%)
抑制率
, 百拇医药
(%)
0
0
41.2±5.2
0
100
54.5±1.3
0.1
100
50.4±2.2
24.6
1.0
100
, 百拇医药
46.8±3.1
51.2
10.0
100
42.5±4.6
86.9
讨论 最近发现，细胞黏附分子及其黏附机制可能是介导和参与肾炎时细胞浸润、细胞外基质扩张乃致肾小球硬化的分子基础[1]。系膜增生性肾小球肾炎(MsPGN)是肾小球肾炎最常见的病理类型，以系膜细胞增殖和细胞外基质增多为主要病理特征，因此，抑制MC增殖是延缓肾小球肾炎进展的关键环节之一。MMF水解产生活性成分霉酚酸，通过抑制次黄嘌呤单磷酸脱氢酶活性而抑制嘌呤合成，亦能抑制黏附分子的糖化而抑制活化的淋巴细胞与活化的内皮细胞结合。叶文玲等[2]应用大鼠抗Thy-1肾炎模型，观察MMF不同剂量以及MMF于不同时间点对肾炎模型的作用，结果显示MMF可明显减轻MsPGN的病理改变。本研究结果表明，MMF可抑制TNFα诱导后MC与巨噬细胞黏附，提示MMF在炎症性肾小球疾病的防治中可能有一定的意义。
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参考文献
1，Anderson JA,Lentsch AB,Hadjiminas DJ,et al.The role of cytokines,adhesion molecules,chemokines in interleukin-2-induced lymphocytic infiltration in C57BL/6 mice.J Clin Invest,1996,97:1952-1959.
2，叶文玲，黄庆元，郑法雷.霉酚酸酯对大鼠抗Thy-1系膜增殖性肾小球肾炎模型的作用.中华内科杂志，1999，38：334-335.
收稿日期：1999-09-20, http://www.100md.com
单位：第二军医大学附属长海医院肾内科 上海，200433
关键词：
中华内科杂志000724 为探讨细胞间黏附分子-1(ICAM-1)在肾小球炎症过程中的作用，我们观察肿瘤坏死因子α(TNFα)对MC与巨噬细胞黏附的影响，以及新型免疫抑制剂霉酚酸酯(MMF)的保护效应。
一、材料和方法
1.材料：采用雄性SD大鼠，体重200～250 g，购自上海西普尔必凯实验有限公司；抗ICAM-1单克隆抗体由美国Rabb教授惠赠；MMF由罗氏公司惠赠。
2.系膜细胞、巨噬细胞培养：按经典方法培养、鉴定大鼠肾小球系膜细胞和巨噬细胞，选4～6代细胞用于本实验。
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3.细胞增殖的测定：采用细胞增殖测定试剂盒，通过四唑盐MTS经细胞线粒体的代谢率来反映存活的细胞数。
4.TNFα对MC与巨噬细胞黏附的影响：生长致密的MC经消化制成细胞悬液，以1.0×104个/L接种于96孔培养板内，置37℃、5% CO2孵箱内孵育48 h，生成致密单层。加入不同剂量TNFα(5、50、100、250 IU)继续孵育不同时间(8、16、24、48h)后取出。用Hank液冲洗3次后，每孔加入巨噬细胞悬液100 μl(1.0×104个/孔)置37 ℃、5% CO2孵箱内孵育30 min。小心吸出未结合的巨噬细胞，并用含0.1% BSA的磷酸缓冲液轻轻荡洗，用Bath等建立的测定髓过氧化物酶(MPO)活性的方法对结合的巨噬细胞进行定量测定。
5.MMF对MC与巨噬细胞黏附的影响：MC单层先与不同浓度的MMF(0、0.1、1.0、10.0 mmol/L)共同孵育4 h后，再用浓度为100 IU的TNFα刺激24 h，加入巨噬细胞悬液，测定MPO活性，并计算MMF抑制率。
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抑制率=(TNFα黏附率-MMF黏附率)/(TNFα黏附率-基础黏附率)×100%
6.统计学分析：实验数据以
±s表示，各组间比较采用方差分析，统计过程在SPLM统计软件上完成。二、结果
1.TNFα刺激MC与巨噬细胞黏附的时效、量效结果：TNFα 100 IU刺激MC 8 h，即可明显诱导MC与巨噬细胞黏附，黏附率为(54.7±2.3) %，基础黏附率为(45.2±1.6) %，16 h黏附率为(57.3±2.8)%,24 h黏附率达到高峰，为(68.8%±1.2)%，48 h黏附率为(63.5%±2.9)%，与24 h相比略有下降，但差别不明显，故选择24 h作为TNFα刺激时间。
TNFα刺激MC单层24 h后，加入巨噬细胞。结果表明：TNFα浓度为0、5、50、100、250 IU时，MC与巨噬细胞的黏附率分别为(42.3±2.1)%、(48.1±3.2)%、(54.7±1.9)%、(63.6±3.1)%、(58.7±2.5)%(P<0.01)。
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2.MMF对TNFα诱导后MC与巨噬细胞黏附的影响： MMF浓度为0.1～10.0 mmol/L时，呈剂量依赖性显著抑制TNFα诱导MC与巨噬细胞黏附，且MMF浓度为0.1、1.0、10.0 mmol/L时，其抑制率分别为24.6%、51.2%及86.9%(表1)。
表1 不同浓度的霉酚酸酯对TNFα诱导后肾小球
系膜细胞与巨噬细胞黏附的影响 霉酚酸酯浓度
(mmol/L)
肿瘤坏死因子
(IU)
黏附率
(%)
抑制率
, 百拇医药
(%)
0
0
41.2±5.2
0
100
54.5±1.3
0.1
100
50.4±2.2
24.6
1.0
100
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46.8±3.1
51.2
10.0
100
42.5±4.6
86.9
讨论 最近发现，细胞黏附分子及其黏附机制可能是介导和参与肾炎时细胞浸润、细胞外基质扩张乃致肾小球硬化的分子基础[1]。系膜增生性肾小球肾炎(MsPGN)是肾小球肾炎最常见的病理类型，以系膜细胞增殖和细胞外基质增多为主要病理特征，因此，抑制MC增殖是延缓肾小球肾炎进展的关键环节之一。MMF水解产生活性成分霉酚酸，通过抑制次黄嘌呤单磷酸脱氢酶活性而抑制嘌呤合成，亦能抑制黏附分子的糖化而抑制活化的淋巴细胞与活化的内皮细胞结合。叶文玲等[2]应用大鼠抗Thy-1肾炎模型，观察MMF不同剂量以及MMF于不同时间点对肾炎模型的作用，结果显示MMF可明显减轻MsPGN的病理改变。本研究结果表明，MMF可抑制TNFα诱导后MC与巨噬细胞黏附，提示MMF在炎症性肾小球疾病的防治中可能有一定的意义。
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参考文献
1，Anderson JA,Lentsch AB,Hadjiminas DJ,et al.The role of cytokines,adhesion molecules,chemokines in interleukin-2-induced lymphocytic infiltration in C57BL/6 mice.J Clin Invest,1996,97:1952-1959.
2，叶文玲，黄庆元，郑法雷.霉酚酸酯对大鼠抗Thy-1系膜增殖性肾小球肾炎模型的作用.中华内科杂志，1999，38：334-335.
收稿日期：1999-09-20, http://www.100md.com