充血性心力衰竭患者尿液水通道蛋白-2的改变
作者：许顶立 殷晓燕 邓英姿 惠海鹏
单位：第一军医大学南方医院心血管内科 广州，510515
关键词：
中华内科杂志000713 我们已经报告了肾脏水通道蛋白(aquaporin，AQP)-2基因表达增加在充血性心力衰竭(心衰)的水潴留中起的作用[1，2]。现应用Western蛋白印迹的方法，检测尿液AQP-2水平，初步观察了充血性心衰患者尿液AQP-2浓度的变化。
1.对象与方法： 我科的1998年10～12月住院的心衰患者10例。年龄37～68岁，平均(61±13)岁。其中原发性扩张性心肌病7例，陈旧性心肌梗死3例；按美国纽约心脏学会(NYHA)心功能分级标准：Ⅱ级2例，Ⅲ级5例，Ⅳ级3例；正常血钠4例，低钠血症 (<135 mmol/L) 6例。6名健康志愿者作为对照，年龄 40～70岁。所有患者在入选前1周内均未服用利尿剂。患者12小时尿液样本于晚餐后19∶00至次日7∶00，收集于同一容器中，记录总尿量；2h尿液样本于晨7∶00～9∶00收集。取15 ml尿液样本以1 000 r/min，4℃下离心10 min ；取上清液，用Millipore centriplus-10浓缩管，以2 000 g，4℃下离心75 min ，使尿液浓缩至0.5ml左右。然后用细胞裂解液(50 mmol/L β-glycerophosphate,100 mmol/L Na2VO4,2 mmol/L MgCl2,1 mmol/L EGTA,0.5% Triton-X100,1 mmol/L DTT)将尿液浓缩倍数调整至浓缩8倍的比例。置-20℃保存。应用AQP蛋白质C末端的多肽片段CELHSPQSLPRGSKA(由美国Genemed Biotechnologies公司制备兔抗AQP-2多克隆抗体，效价为1∶100 000[1]，主要试剂除标明者外，均购自Sigma公司)取浓缩尿液10μl进行蛋白印迹(Western Blot)分析[1-3]；采用ECL(Amersham公司)方法显影；肾脏内髓质总蛋白的提取采用细胞裂解液法[3]，用5μg总蛋白电泳以确定AQP-2蛋白的位置并作为阳性对照，用图像分析仪测定杂交信号的吸光度(用杂交带面积乘以密度表示)。
, http://www.100md.com
统计学结果以均数±标准差表示，两组间比较采用未配对t检验。
2.结果：尿液AQP浓度的检测除29 000和36 000～43 000杂交带外，还可见约70 000的杂交带，推测可能是糖基化的AQP-2，实验显示2 h尿样标本检测AQP-2浓度与12 h尿样标本检测有良好的相关性，充血性心衰患者尿液AQP-2浓度较健康人明显增加(图1)，10例患者尿液AQP-2光密度水平较6例健康人增高(358±228 比 101±55，P<0.05)；伴有低钠血症的充血性心衰患者(6例)较正常血钠的充血性心衰患者(4例)尿液AQP-2光密度水平明显为高(383±106比 196±63，P<0.05)。
图1 充血性心衰患者尿液AQP-2浓度及水平的比较
讨论 AQP-2基因是在1993年被克隆确认的水通道蛋白家族中的一种，被认为是维持体内水平衡调节的必需物质和调节肾脏集合管对水通透性的关键水通道蛋白[4]。AQP-2基因在充血性心衰水潴留中起有十分重要的作用，我们已经观察到在充血性心衰动物模型肾脏AQP-2基因mRNA和蛋白质的表达是明显增加的[1，2]。然而，肾脏AQP-2的检测由于具有创伤性故不易在临床推广。由于部分位于集合管主细胞小管侧细胞膜上的AQP-2蛋白可脱落于小管腔而被尿液冲出，在对大鼠的研究中发现排入尿液 中AQP-2的量约为 肾脏含量的3%，监测尿液AQP-2水平可以反映肾脏AQP-2基因表达的水平[5]。在本研究中应用Western蛋白印迹法显示：在未用利尿剂的情况下，充血性心衰患者尿液AQP-2浓度较健康对照组明显增加，且在伴有低钠血症的充血性心力衰竭患者尿液AQP-2增加更明显。支持我们提出的AQP-2基因表达在充血性心力衰竭的水潴留和低钠血症中起有关键的作用假说[1，2]。上午2 h尿液样本法可以较准确地反映尿液AQP-2排出的水平，提示尿液AQP-2浓度可能作为临床监测充血性心衰时水重吸收状态的重要指标。
, 百拇医药
但本研究目前尚为AQP-2的定性和半定量研究，且AQP-2与充血性心力衰竭患者严重度的关系等问题尚需要更大样本的临床研究才能确定，这些工作都是值得我们去深入进行探讨的。
基金项目：广东省自然科学基金资助项目(970355)
参考文献
1，Xu DL,Martin PY,Ohara M,et al.Upregulation of aquaporin-2 water channel expression in chronic heart failure.J Clin Invest，1997,99:1500-1505.
2，许顶立,任昊,Martin PY，等.充血性心力衰竭大鼠肾脏Aquaporin2水通道蛋白基因的表达.中华医学杂志，1998,78:118-120.
, http://www.100md.com
3，许顶立，任昊，邓英姿，等.肾脏Aquaporin2水通道蛋白的检测及其在充血性心力衰竭的应用.肾脏病与透析肾移植杂志，1998,7:196-198.
4，Frokiaer J,Marples D,Knepper MA,et al.Pathophysiology of aquaporin-2 in water balance disorders.Am J Med Sci，1998,316:291-299.
5，Rai T,Sekine K,Kanno K,et al.Urinary excretion of Aquaporin-2 water channel protein in human and rat.J Am Soc Nephrol，1997,8:1357-1362.
收稿日期:1999-07-25, 百拇医药
单位：第一军医大学南方医院心血管内科 广州，510515
关键词：
中华内科杂志000713 我们已经报告了肾脏水通道蛋白(aquaporin，AQP)-2基因表达增加在充血性心力衰竭(心衰)的水潴留中起的作用[1，2]。现应用Western蛋白印迹的方法，检测尿液AQP-2水平，初步观察了充血性心衰患者尿液AQP-2浓度的变化。
1.对象与方法： 我科的1998年10～12月住院的心衰患者10例。年龄37～68岁，平均(61±13)岁。其中原发性扩张性心肌病7例，陈旧性心肌梗死3例；按美国纽约心脏学会(NYHA)心功能分级标准：Ⅱ级2例，Ⅲ级5例，Ⅳ级3例；正常血钠4例，低钠血症 (<135 mmol/L) 6例。6名健康志愿者作为对照，年龄 40～70岁。所有患者在入选前1周内均未服用利尿剂。患者12小时尿液样本于晚餐后19∶00至次日7∶00，收集于同一容器中，记录总尿量；2h尿液样本于晨7∶00～9∶00收集。取15 ml尿液样本以1 000 r/min，4℃下离心10 min ；取上清液，用Millipore centriplus-10浓缩管，以2 000 g，4℃下离心75 min ，使尿液浓缩至0.5ml左右。然后用细胞裂解液(50 mmol/L β-glycerophosphate,100 mmol/L Na2VO4,2 mmol/L MgCl2,1 mmol/L EGTA,0.5% Triton-X100,1 mmol/L DTT)将尿液浓缩倍数调整至浓缩8倍的比例。置-20℃保存。应用AQP蛋白质C末端的多肽片段CELHSPQSLPRGSKA(由美国Genemed Biotechnologies公司制备兔抗AQP-2多克隆抗体，效价为1∶100 000[1]，主要试剂除标明者外，均购自Sigma公司)取浓缩尿液10μl进行蛋白印迹(Western Blot)分析[1-3]；采用ECL(Amersham公司)方法显影；肾脏内髓质总蛋白的提取采用细胞裂解液法[3]，用5μg总蛋白电泳以确定AQP-2蛋白的位置并作为阳性对照，用图像分析仪测定杂交信号的吸光度(用杂交带面积乘以密度表示)。
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统计学结果以均数±标准差表示，两组间比较采用未配对t检验。
2.结果：尿液AQP浓度的检测除29 000和36 000～43 000杂交带外，还可见约70 000的杂交带，推测可能是糖基化的AQP-2，实验显示2 h尿样标本检测AQP-2浓度与12 h尿样标本检测有良好的相关性，充血性心衰患者尿液AQP-2浓度较健康人明显增加(图1)，10例患者尿液AQP-2光密度水平较6例健康人增高(358±228 比 101±55，P<0.05)；伴有低钠血症的充血性心衰患者(6例)较正常血钠的充血性心衰患者(4例)尿液AQP-2光密度水平明显为高(383±106比 196±63，P<0.05)。
图1 充血性心衰患者尿液AQP-2浓度及水平的比较
讨论 AQP-2基因是在1993年被克隆确认的水通道蛋白家族中的一种，被认为是维持体内水平衡调节的必需物质和调节肾脏集合管对水通透性的关键水通道蛋白[4]。AQP-2基因在充血性心衰水潴留中起有十分重要的作用，我们已经观察到在充血性心衰动物模型肾脏AQP-2基因mRNA和蛋白质的表达是明显增加的[1，2]。然而，肾脏AQP-2的检测由于具有创伤性故不易在临床推广。由于部分位于集合管主细胞小管侧细胞膜上的AQP-2蛋白可脱落于小管腔而被尿液冲出，在对大鼠的研究中发现排入尿液 中AQP-2的量约为 肾脏含量的3%，监测尿液AQP-2水平可以反映肾脏AQP-2基因表达的水平[5]。在本研究中应用Western蛋白印迹法显示：在未用利尿剂的情况下，充血性心衰患者尿液AQP-2浓度较健康对照组明显增加，且在伴有低钠血症的充血性心力衰竭患者尿液AQP-2增加更明显。支持我们提出的AQP-2基因表达在充血性心力衰竭的水潴留和低钠血症中起有关键的作用假说[1，2]。上午2 h尿液样本法可以较准确地反映尿液AQP-2排出的水平，提示尿液AQP-2浓度可能作为临床监测充血性心衰时水重吸收状态的重要指标。
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但本研究目前尚为AQP-2的定性和半定量研究，且AQP-2与充血性心力衰竭患者严重度的关系等问题尚需要更大样本的临床研究才能确定，这些工作都是值得我们去深入进行探讨的。
基金项目：广东省自然科学基金资助项目(970355)
参考文献
1，Xu DL,Martin PY,Ohara M,et al.Upregulation of aquaporin-2 water channel expression in chronic heart failure.J Clin Invest，1997,99:1500-1505.
2，许顶立,任昊,Martin PY，等.充血性心力衰竭大鼠肾脏Aquaporin2水通道蛋白基因的表达.中华医学杂志，1998,78:118-120.
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3，许顶立，任昊，邓英姿，等.肾脏Aquaporin2水通道蛋白的检测及其在充血性心力衰竭的应用.肾脏病与透析肾移植杂志，1998,7:196-198.
4，Frokiaer J,Marples D,Knepper MA,et al.Pathophysiology of aquaporin-2 in water balance disorders.Am J Med Sci，1998,316:291-299.
5，Rai T,Sekine K,Kanno K,et al.Urinary excretion of Aquaporin-2 water channel protein in human and rat.J Am Soc Nephrol，1997,8:1357-1362.
收稿日期:1999-07-25, 百拇医药