尿毒症继发甲状旁腺功能亢进患者维生素D受体和增殖核抗原的免疫组化研究
作者：王笑云 孙彬 彭韬 周富华 胡建明 俞香宝
单位：王笑云(南京医科大学第一附属医院肾脏科 210029)；孙彬(南京医科大学第一附属医院肾脏科 210029)；胡建明(南京医科大学第一附属医院肾脏科 210029)；俞香宝(南京医科大学第一附属医院肾脏科 210029)；彭韬(病理学教研室)；周富华(第二附属医院肾脏科)
关键词：甲状旁腺功能亢进症，继发性；受体，维生素D；细胞增殖核抗原
中华内科杂志000710 【摘要】目的 研究维生素D受体(VDR)在继发性甲状旁腺功能亢进(SHPT)患者甲状旁腺中的表达，探讨严重SHPT患者对钙三醇抵抗的机制以及与甲状旁腺增生的关系。方法 7例严重SHPT病人的甲状旁腺 19枚，正常对照6枚，用免疫组化ABC法检测维生素D受体、细胞增殖核抗原(PCNA)表达。计算阳性细胞率。结果 SHPT组甲状旁腺总重量为正常对照的16.1倍，两组PCNA表达分别为(6.35±3.36)‰与(1.73±1.31)‰，结节性增生区增加更显著(P<0.001)，PCNA表达与甲状旁腺重量呈正相关(r=0.58,P<0.01)。SHPT组VDR阳性率(40.28±13.13)%较对照组(83.79±3.77)%明显减少，结节性较弥漫性增生更显著，为(27.14±4.12)%与(49.84±7.33)%(P值均<0.001)，VDR表达与腺体重量、PCNA阳性率均呈负相关(r=-0.46,P<0.05与r=-0.75,P< 0.001)。结论 严重SHPT患者甲状旁腺细胞VDR明显减少可能是导致对钙三醇抵抗的原因之一，且与细胞增殖有关。
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A study on vitamin D receptor and proliferation cell nuclear antigen expression in severe parathyroid hyperplasia of uremic patients with secondary hyperparathyroidism
WANG Xiaoyun,SUN Bin,PENG Tao，et al.
(Department of Nephrology,The First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University,Nanjing 210029，China)
【Abstract】Objective To study the role of vitamin D receptor (VDR) and proliferation cell nuclear antigen (PCNA) expression in parathyroid tissue of uremic patients with secondary hyperparathyroidism (SHPT).Methods VDR and PCNA expression was evaluated in 6 specimens of normal parathyroid tissue and 7 cases of SHPT(19 parathyroid glands) with immunohistochemistry (avidin-biotin complex method).Results The weight of parathyroid was 16.1 times greater in SHPT patients than normal subjects.The number of parathyroid cells increased by 1.86 times in SHPT patients.The rate of positive PCNA expression was (6.35±3.36)‰ in SHPT and (1.73±1.31)‰ in normal glands (P<0.001).The number of PCNA expression was higher in nodular hyperplasia (NH) than in diffuse hyperplasia (DH) (P<0.001).The density of positive VDR expression in parathyroid was (40.28±13.13)% in SHPT and (83.79±3.77)% in normal glands (P<0.001).VDR immunoreactivity expression was lower in NH than that in DH [(27.14±4.12)% vs (49.84±7.33)%,P<0.001].There was a significant negative correlation between VDR expression and weight of parathyroid (r=-0.46,P<0.05) and the correlation was also negative between VDR and PCNA expression (r=-0.75,P<0.001).Conclusion It is shown that VDR density of parathyroid decreased significantly in severe SHPT.There is a negative correlation between VDR and PCNA expression.This may partly explains the cause for the resistance of parathyroid cells to calcitriol.
, 百拇医药
【Key words】Hyperparathyroidism,secondary;Receptor,vitamin D;Proliferation cell nuclear antigen
继发性甲状旁腺功能亢进症 (SHPT)是慢性肾功能衰竭(CRF)常见并发症。已知磷潴留、低钙血症和1，25-(OH)2D3缺乏是导致高甲状旁腺激素(PTH)的主要原因；因此限制磷摄入、补充钙和1,25-(OH)2D3能治疗早中期SHPT，但部分长期透析的严重SHPT病人对钙三醇[1,25-(OH)2D3]抵抗，确切机制尚不清楚[1]。制作长期透析的严重SHPT 动物模型较困难，因此有关抵抗机制的文献报道甚少。严重SHPT时，人体腺体标本取材也不易。当甲状旁腺自主增生和对钙三醇抵抗时，只能用手术切除过度增生的甲状旁腺来缓解[2]。本研究采用7例严重SHPT患者被切除的腺体研究维生素D受体(VDR)、细胞增殖核抗原(PCNA)的蛋白表达，并与形态学因素作相关分析，以探讨VDR在甲状旁腺增生及对1,25-(OH)2D3抵抗中的意义。
, 百拇医药
资料与方法
一、 临床资料及甲状旁腺标本取材
SHPT组：1996～1998年长期血液透析(血透)的尿毒症病人7例，男6例，女1例，术时平均年龄(48.0±10.6)岁，血钙为(2.54±0.31)mmol/L、血磷(1.77±0.43) mmol/L，平均血透时间(6.3±3.6)年，全部病例均对内科治疗无效(含钙三醇冲击)，单光子发射计算机体层摄影(SPECT)均证实有腺体增生，作甲状旁腺全切加自体前臂移植术，共取得19枚甲状旁腺供研究。临床及病理资料见表1。对照组：6例新鲜尸体甲状旁腺标本，均为男性，年龄23～40岁。每例取1枚腺体。平均每例腺体总重量为(196.0±36.4)mg，血清全段PTH(i- PTH)为(35.0±17.1)×10-9g/L(放免试剂盒购自美国DiaSorin公司，批内变异系数<5%,批间变异系数<11.5%)。
二、 实验方法
, 百拇医药
1.甲状旁腺细胞形态及计数：标本取出后立即置于4% 多聚甲醛中固定24 h，常规石蜡包埋，HE染色。在MPIAS-500型多媒体彩色病理图文分析系统计算单位面积(8 788 μm2)甲状旁腺细胞数。
2.腺体VDR免疫组化：切片使用APES作为黏附剂，厚度4 μm。烤箱60℃，1 h。常规脱蜡至水，柠檬酸盐缓冲液中经微波行抗原修复，免疫组织化学采用ABC法，DAB显色。大鼠抗人VDR(Chemicon公司)使用时用1∶100 PBS稀释。阳性对照用乳腺癌组织。
3.腺体PCNA(Dako公司)检测：方法基本同上，用ABC法。
4.每例随机选择20个视野(×400倍)，结合HE染色片区分结节性和弥漫性增生组织，分别计算每个腺体平均阳性细胞率。
三、 统计学处理
, 百拇医药
表1 病人临床及病理资料 例号
年龄
(岁)
血透时间
(年)
i-PTHa
(×10-9g/L)
腺体总重
(mg)
甲状旁腺
组织学类
类型
, 百拇医药
分重
(mg)
部位
1
47
8
1 260
3 480
950
左上
DH
150
左上
, 百拇医药 DH
2 000
右上
DH
2
36
7
2 160
3 250
1 600
左上
NH
1650
, 百拇医药 右上
NH
3
33
8
2 400
2 250
1 200
左下
NH
4
50
0
405
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1 500
100
左下
DH
200
右上
DH
1 200
右下
NH
5
50
7
, http://www.100md.com 214
2 220
550
左上
DH
720
右上
NH
950
左上
DH
6
61
3
, 百拇医药
1 780
5 850
900
左上
NH
450
LL
DH
3 900
右上
NH
600
右下
, 百拇医药
DH
7
59
11
469
3 100
800
左下
NH
150
右上
DH
700
, 百拇医药 右下
DH
±s
48.0±10.6
6.3±3.6
1 241.1±847.1
3 092.9±1 401.5
注：i-PTHa正常值：(35.0±17.1)×10-9g/L；例5非手术者，死亡后立即取材；每例手术时所有腺体称总重，分重指供本研究所用标本之实际重量(为总重的一部分)
所有数据以均数±标准差表示，两组数据比较用t 或t′检验。以直线回归分析两组资料之间的相互关系。
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结果
一、腺体总重量和i-PTH
SHPT组血清 i-PTH明显增高，为(1 241.1±847.1) ×10-9 g/L，是对照组的35.5倍。腺体平均总重量为(3 092.9±1 401.5)mg，为对照组(192.0±36.4)mg的16.1倍。
二、腺体细胞形态及计数
正常腺体以主细胞、透明细胞为主，伴少许嗜酸细胞，细胞周围有较多脂肪组织。SHPT组甲状旁腺分为弥漫性增生(DH)和结节性增生(NH)。本组8枚腺体呈NH，11枚腺体为DH。
单位面积甲状旁腺细胞计数：SHPT组为224.7±73.1，是正常组121.1±25.5的1.86倍(P<0.001)；NH 302.32±27.23比DH 168.33±27.43细胞增殖更旺盛(P<0.001)。
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三、PCNA的表达
PCNA阳性者表现为细胞核呈不同程度的棕黄色。SHPT组表达明显增加，阳性率为(6.35±3.36)‰，正常组为(1.73±1.31)‰(P<0.001)。DH 与NH阳性率分别为(4.30±2.04)‰、(9.18±2.69)‰(P<0.001)，见图1，2。
四、VDR的表达
阳性对照用乳腺癌组织，几乎所有的癌细胞核呈棕黄色(图3)。SHPT组阳性率为(40.28±13.13)%，较对照组(83.79±3.77)%(图4)明显降低(P<0.001)。NH (27.14±4.12) %比DH(49.84±7.3%)%(图5，6)降低更明显(P<0.001)。
五、相关性分析
VDR表达与PCNA阳性率及腺体重量呈负相关(r=-0.75，P<0.001与r=-0.46，P<0.05)。而PCNA表达与腺体重量呈正相关(r=0.58,P<0.01)。
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图1 弥漫性增生，PCNA阳性细胞相对较少，PCNA阳性细胞表现为细胞核呈不同程度的棕黄染色
ABC×400
图2 结节性增生，PCNA阳性细胞明显增加 ABC×400
图3 VDR阳性对照片，乳腺癌组织癌细胞核呈细颗粒状棕黄色 ABC×400
图4 正常人甲状旁腺，VDR表达较多 ABC×400
, 百拇医药
图5 弥漫性增生，VDR表达减少 ABC×400
图6 结节性增生，VDR表达明显减少 ABC×400
讨论
SHPT影响尿毒症患者长期预后和生活质量。在CRF早期就发生钙、磷和1,25-(OH)2D3等代谢紊乱，促使PTH合成、分泌增加，长期紊乱诱发甲状旁腺细胞增生、肥大，PTH呈自主性分泌。近来腺体增生及调控机制尤其是VDR异常备受重视[3，4]。 目前认为，SHPT时1,25-(OH)2D3抵抗除与甲状旁腺细胞增生有关外，也可能与CRF时VDR存在数目、活性、功能的异常有关[5]。1,25-(OH)2D3与VDR配基结合区域(LBD)结合后，促使VDR-RAR(retinoic acid receptor)或VDR-RXR(retinoic X receptor)异二聚体或VDR-VDR同二聚体形成，二聚体化使VDR DNA结合区域(DBD)与某些靶基因的维生素D反应素(vitamin D response elements ，VDRE)结合，控制其转录。在人类主要是抑制PTH转录，增加骨钙蛋白转录[6]。Korkor发现CRF时甲状旁腺VDR结合活性下降，以往VDR在尿毒症病人、大鼠及狗甲状旁腺和肠VDR数目及活性的改变多有争论[7]。其原因可能与尿毒症时内源性蛋白溶解活性较高，影响配基结合分析法受体蛋白的测定结果。
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本研究采用免疫组化法检测甲状旁腺组织的VDR，结果表明SHPT组甲状旁腺VDR表达比正常降低1倍左右，而且NH组织下降更明显，这与 Fukuda的结果相似，但他未阐明正常甲状旁腺VDR的表达[8]。我们发现VDR表达与腺体重量、增生程度呈负相关。已知，1,25-(OH)2D3有抗增殖作用，同时需与VDR结合后才能抑制PTH转录，提示VDR表达下调不仅可能与1,25-(OH)2D3治疗抵抗相关，而且与甲状旁腺细胞克隆增殖也有关：即随着SHPT的进展，VDR减少可能促使DH发展至NH。临床发现甲状旁腺明显增大(直径>1 cm或体积>0.5 cm3)的病人1,25-(OH)2D3冲击治疗反应较差，说明高剂量1,25-(OH)2D3是否有疗效至少部分与甲状旁腺VDR密度和腺体大小相关。
此外，SHPT患者甲状旁腺总重量较正常者增加16.1倍，单位面积甲状旁腺细胞数明显增加，为正常人的1.86倍，因此腺体细胞总数增加29.9倍。与血清i-PTH水平是正常人的35.5倍相吻合，此结果支持腺体细胞数增多是导致严重SHPT的重要因素的论点[4]。在SHPT患者的19枚腺体中11枚为DH，8枚为NH，腺体重量较小者多表现为DH。组织学上呈现移行过程，两者无明显的截然分界，DH区可见小结节性生长趋势，而NH区周围又可见DH组织存在。NH细胞成分趋于一致，而DH组织则多种细胞成分混杂。此现象说明甲状旁腺增生过程有逐渐演变的趋势，即多种细胞成分的弥漫性增生→早期结节性生长趋势(腺体增殖旺盛呈克隆化生长)→多克隆的结节性增生→单克隆的单个结节形成。与Tominaga和 Takagi[9]认为结节是由单个甲状旁腺细胞增生而形成的单克隆结节的结果一致。
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PCNA为DNA聚合酶δ的辅因子，在细胞生长周期的S期表达最明显，是反映细胞增殖敏感而可靠的指标。本研究SHPT腺体中PCNA表达增加，NH区尤著，说明细胞增殖旺盛。PCNA表达程度与腺体重量成正相关，说明腺体越大增生能力越强，VDR愈少。
上述结果提示，对严重SHPT患者行甲状旁腺全切加自体移植时，应选用弥漫性增生且重量较小的组织作移植片，以防移植片增生过甚导致复发。SHPT时甲状旁腺重量、细胞增殖程度平行，VDR表达明显减少，可能是对1,25-(OH)2D3抵抗和甲状旁腺生长失控的重要原因。今后研究促进VDR表达上调的药物，可能将开辟一种新的治疗途径。
(本文图1～6见插页图第13页)
基金项目：江苏省教委基金资助(182FA9707)
参考文献
, 百拇医药
1，Llach F.Secondary hyperparathyroidism in renal failure:the trade-off hypothesis revisited.Am J Kidney Dis,1995,25:663-679.
2，王笑云,吴宏飞,胡建明,等.甲状旁腺全切加前臂移植治疗继发性甲状旁腺功能亢进.中华医学杂志,1997，77:873-874.
3，Parfitt AM.The hyperparathyroidism of chronic renal failure:a disorder of growth.Kidney Int,1997,52:3-9.
4，王笑云,周富华.肾性甲旁亢患者甲状旁腺细胞增生与凋亡.中华肾脏病杂志,1999,4:161-163.
5，Fukagawa M,Kitaoka M,Kurokawe K.Resistance of the parathyroid glands to vitamin D in real failure:implications for medical management.Kidney Int,1997,52:s60-s64.
, http://www.100md.com
6，Perret C,Colnot S,Romaganolo B,et al.Control of nuclear transcription of vitamin D-dependent genes by vitamin D.Curr Opin Nephrol Hypertens，1997,6:314-320.
7，Szabo A,Ritz E,Schmidt-Gayk H,et al.Abnormal expression and regulation of vitamin D receptor in experimental uremia.Nephrologie,1996,73:619-628.
8，Fukada N,Tanaka H,Tominaga Y，et al.Decreased 1,25-dihydroxyvitamin D3 receptor density is associated with a more severe form of parathyroid hyperplasia in chronic uremic patients.J Clin Invest,1993,92:1436-1443.
9，Tominaga Y,Takagi H.Molecular genetics of hyperparathyroidism Disease.Curr Opin Nephrol Hypertens,1996,5:336-341.
收稿日期：1999-09-03, http://www.100md.com
单位：王笑云(南京医科大学第一附属医院肾脏科 210029)；孙彬(南京医科大学第一附属医院肾脏科 210029)；胡建明(南京医科大学第一附属医院肾脏科 210029)；俞香宝(南京医科大学第一附属医院肾脏科 210029)；彭韬(病理学教研室)；周富华(第二附属医院肾脏科)
关键词：甲状旁腺功能亢进症，继发性；受体，维生素D；细胞增殖核抗原
中华内科杂志000710 【摘要】目的 研究维生素D受体(VDR)在继发性甲状旁腺功能亢进(SHPT)患者甲状旁腺中的表达，探讨严重SHPT患者对钙三醇抵抗的机制以及与甲状旁腺增生的关系。方法 7例严重SHPT病人的甲状旁腺 19枚，正常对照6枚，用免疫组化ABC法检测维生素D受体、细胞增殖核抗原(PCNA)表达。计算阳性细胞率。结果 SHPT组甲状旁腺总重量为正常对照的16.1倍，两组PCNA表达分别为(6.35±3.36)‰与(1.73±1.31)‰，结节性增生区增加更显著(P<0.001)，PCNA表达与甲状旁腺重量呈正相关(r=0.58,P<0.01)。SHPT组VDR阳性率(40.28±13.13)%较对照组(83.79±3.77)%明显减少，结节性较弥漫性增生更显著，为(27.14±4.12)%与(49.84±7.33)%(P值均<0.001)，VDR表达与腺体重量、PCNA阳性率均呈负相关(r=-0.46,P<0.05与r=-0.75,P< 0.001)。结论 严重SHPT患者甲状旁腺细胞VDR明显减少可能是导致对钙三醇抵抗的原因之一，且与细胞增殖有关。
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A study on vitamin D receptor and proliferation cell nuclear antigen expression in severe parathyroid hyperplasia of uremic patients with secondary hyperparathyroidism
WANG Xiaoyun,SUN Bin,PENG Tao，et al.
(Department of Nephrology,The First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University,Nanjing 210029，China)
【Abstract】Objective To study the role of vitamin D receptor (VDR) and proliferation cell nuclear antigen (PCNA) expression in parathyroid tissue of uremic patients with secondary hyperparathyroidism (SHPT).Methods VDR and PCNA expression was evaluated in 6 specimens of normal parathyroid tissue and 7 cases of SHPT(19 parathyroid glands) with immunohistochemistry (avidin-biotin complex method).Results The weight of parathyroid was 16.1 times greater in SHPT patients than normal subjects.The number of parathyroid cells increased by 1.86 times in SHPT patients.The rate of positive PCNA expression was (6.35±3.36)‰ in SHPT and (1.73±1.31)‰ in normal glands (P<0.001).The number of PCNA expression was higher in nodular hyperplasia (NH) than in diffuse hyperplasia (DH) (P<0.001).The density of positive VDR expression in parathyroid was (40.28±13.13)% in SHPT and (83.79±3.77)% in normal glands (P<0.001).VDR immunoreactivity expression was lower in NH than that in DH [(27.14±4.12)% vs (49.84±7.33)%,P<0.001].There was a significant negative correlation between VDR expression and weight of parathyroid (r=-0.46,P<0.05) and the correlation was also negative between VDR and PCNA expression (r=-0.75,P<0.001).Conclusion It is shown that VDR density of parathyroid decreased significantly in severe SHPT.There is a negative correlation between VDR and PCNA expression.This may partly explains the cause for the resistance of parathyroid cells to calcitriol.
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【Key words】Hyperparathyroidism,secondary;Receptor,vitamin D;Proliferation cell nuclear antigen
继发性甲状旁腺功能亢进症 (SHPT)是慢性肾功能衰竭(CRF)常见并发症。已知磷潴留、低钙血症和1，25-(OH)2D3缺乏是导致高甲状旁腺激素(PTH)的主要原因；因此限制磷摄入、补充钙和1,25-(OH)2D3能治疗早中期SHPT，但部分长期透析的严重SHPT病人对钙三醇[1,25-(OH)2D3]抵抗，确切机制尚不清楚[1]。制作长期透析的严重SHPT 动物模型较困难，因此有关抵抗机制的文献报道甚少。严重SHPT时，人体腺体标本取材也不易。当甲状旁腺自主增生和对钙三醇抵抗时，只能用手术切除过度增生的甲状旁腺来缓解[2]。本研究采用7例严重SHPT患者被切除的腺体研究维生素D受体(VDR)、细胞增殖核抗原(PCNA)的蛋白表达，并与形态学因素作相关分析，以探讨VDR在甲状旁腺增生及对1,25-(OH)2D3抵抗中的意义。
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资料与方法
一、 临床资料及甲状旁腺标本取材
SHPT组：1996～1998年长期血液透析(血透)的尿毒症病人7例，男6例，女1例，术时平均年龄(48.0±10.6)岁，血钙为(2.54±0.31)mmol/L、血磷(1.77±0.43) mmol/L，平均血透时间(6.3±3.6)年，全部病例均对内科治疗无效(含钙三醇冲击)，单光子发射计算机体层摄影(SPECT)均证实有腺体增生，作甲状旁腺全切加自体前臂移植术，共取得19枚甲状旁腺供研究。临床及病理资料见表1。对照组：6例新鲜尸体甲状旁腺标本，均为男性，年龄23～40岁。每例取1枚腺体。平均每例腺体总重量为(196.0±36.4)mg，血清全段PTH(i- PTH)为(35.0±17.1)×10-9g/L(放免试剂盒购自美国DiaSorin公司，批内变异系数<5%,批间变异系数<11.5%)。
二、 实验方法
, 百拇医药
1.甲状旁腺细胞形态及计数：标本取出后立即置于4% 多聚甲醛中固定24 h，常规石蜡包埋，HE染色。在MPIAS-500型多媒体彩色病理图文分析系统计算单位面积(8 788 μm2)甲状旁腺细胞数。
2.腺体VDR免疫组化：切片使用APES作为黏附剂，厚度4 μm。烤箱60℃，1 h。常规脱蜡至水，柠檬酸盐缓冲液中经微波行抗原修复，免疫组织化学采用ABC法，DAB显色。大鼠抗人VDR(Chemicon公司)使用时用1∶100 PBS稀释。阳性对照用乳腺癌组织。
3.腺体PCNA(Dako公司)检测：方法基本同上，用ABC法。
4.每例随机选择20个视野(×400倍)，结合HE染色片区分结节性和弥漫性增生组织，分别计算每个腺体平均阳性细胞率。
三、 统计学处理
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表1 病人临床及病理资料 例号
年龄
(岁)
血透时间
(年)
i-PTHa
(×10-9g/L)
腺体总重
(mg)
甲状旁腺
组织学类
类型
, 百拇医药
分重
(mg)
部位
1
47
8
1 260
3 480
950
左上
DH
150
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, 百拇医药 DH
2 000
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DH
2
36
7
2 160
3 250
1 600
左上
NH
1650
, 百拇医药 右上
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3
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8
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左下
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1 500
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左下
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200
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右下
NH
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2 220
550
左上
DH
720
右上
NH
950
左上
DH
6
61
3
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1 780
5 850
900
左上
NH
450
LL
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3 900
右上
NH
600
右下
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7
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11
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3 100
800
左下
NH
150
右上
DH
700
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±s48.0±10.6
6.3±3.6
1 241.1±847.1
3 092.9±1 401.5
注：i-PTHa正常值：(35.0±17.1)×10-9g/L；例5非手术者，死亡后立即取材；每例手术时所有腺体称总重，分重指供本研究所用标本之实际重量(为总重的一部分)
所有数据以均数±标准差表示，两组数据比较用t 或t′检验。以直线回归分析两组资料之间的相互关系。
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结果
一、腺体总重量和i-PTH
SHPT组血清 i-PTH明显增高，为(1 241.1±847.1) ×10-9 g/L，是对照组的35.5倍。腺体平均总重量为(3 092.9±1 401.5)mg，为对照组(192.0±36.4)mg的16.1倍。
二、腺体细胞形态及计数
正常腺体以主细胞、透明细胞为主，伴少许嗜酸细胞，细胞周围有较多脂肪组织。SHPT组甲状旁腺分为弥漫性增生(DH)和结节性增生(NH)。本组8枚腺体呈NH，11枚腺体为DH。
单位面积甲状旁腺细胞计数：SHPT组为224.7±73.1，是正常组121.1±25.5的1.86倍(P<0.001)；NH 302.32±27.23比DH 168.33±27.43细胞增殖更旺盛(P<0.001)。
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三、PCNA的表达
PCNA阳性者表现为细胞核呈不同程度的棕黄色。SHPT组表达明显增加，阳性率为(6.35±3.36)‰，正常组为(1.73±1.31)‰(P<0.001)。DH 与NH阳性率分别为(4.30±2.04)‰、(9.18±2.69)‰(P<0.001)，见图1，2。
四、VDR的表达
阳性对照用乳腺癌组织，几乎所有的癌细胞核呈棕黄色(图3)。SHPT组阳性率为(40.28±13.13)%，较对照组(83.79±3.77)%(图4)明显降低(P<0.001)。NH (27.14±4.12) %比DH(49.84±7.3%)%(图5，6)降低更明显(P<0.001)。
五、相关性分析
VDR表达与PCNA阳性率及腺体重量呈负相关(r=-0.75，P<0.001与r=-0.46，P<0.05)。而PCNA表达与腺体重量呈正相关(r=0.58,P<0.01)。
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图1 弥漫性增生，PCNA阳性细胞相对较少，PCNA阳性细胞表现为细胞核呈不同程度的棕黄染色
ABC×400
图2 结节性增生，PCNA阳性细胞明显增加 ABC×400
图3 VDR阳性对照片，乳腺癌组织癌细胞核呈细颗粒状棕黄色 ABC×400
图4 正常人甲状旁腺，VDR表达较多 ABC×400
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图5 弥漫性增生，VDR表达减少 ABC×400
图6 结节性增生，VDR表达明显减少 ABC×400
讨论
SHPT影响尿毒症患者长期预后和生活质量。在CRF早期就发生钙、磷和1,25-(OH)2D3等代谢紊乱，促使PTH合成、分泌增加，长期紊乱诱发甲状旁腺细胞增生、肥大，PTH呈自主性分泌。近来腺体增生及调控机制尤其是VDR异常备受重视[3，4]。 目前认为，SHPT时1,25-(OH)2D3抵抗除与甲状旁腺细胞增生有关外，也可能与CRF时VDR存在数目、活性、功能的异常有关[5]。1,25-(OH)2D3与VDR配基结合区域(LBD)结合后，促使VDR-RAR(retinoic acid receptor)或VDR-RXR(retinoic X receptor)异二聚体或VDR-VDR同二聚体形成，二聚体化使VDR DNA结合区域(DBD)与某些靶基因的维生素D反应素(vitamin D response elements ，VDRE)结合，控制其转录。在人类主要是抑制PTH转录，增加骨钙蛋白转录[6]。Korkor发现CRF时甲状旁腺VDR结合活性下降，以往VDR在尿毒症病人、大鼠及狗甲状旁腺和肠VDR数目及活性的改变多有争论[7]。其原因可能与尿毒症时内源性蛋白溶解活性较高，影响配基结合分析法受体蛋白的测定结果。
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本研究采用免疫组化法检测甲状旁腺组织的VDR，结果表明SHPT组甲状旁腺VDR表达比正常降低1倍左右，而且NH组织下降更明显，这与 Fukuda的结果相似，但他未阐明正常甲状旁腺VDR的表达[8]。我们发现VDR表达与腺体重量、增生程度呈负相关。已知，1,25-(OH)2D3有抗增殖作用，同时需与VDR结合后才能抑制PTH转录，提示VDR表达下调不仅可能与1,25-(OH)2D3治疗抵抗相关，而且与甲状旁腺细胞克隆增殖也有关：即随着SHPT的进展，VDR减少可能促使DH发展至NH。临床发现甲状旁腺明显增大(直径>1 cm或体积>0.5 cm3)的病人1,25-(OH)2D3冲击治疗反应较差，说明高剂量1,25-(OH)2D3是否有疗效至少部分与甲状旁腺VDR密度和腺体大小相关。
此外，SHPT患者甲状旁腺总重量较正常者增加16.1倍，单位面积甲状旁腺细胞数明显增加，为正常人的1.86倍，因此腺体细胞总数增加29.9倍。与血清i-PTH水平是正常人的35.5倍相吻合，此结果支持腺体细胞数增多是导致严重SHPT的重要因素的论点[4]。在SHPT患者的19枚腺体中11枚为DH，8枚为NH，腺体重量较小者多表现为DH。组织学上呈现移行过程，两者无明显的截然分界，DH区可见小结节性生长趋势，而NH区周围又可见DH组织存在。NH细胞成分趋于一致，而DH组织则多种细胞成分混杂。此现象说明甲状旁腺增生过程有逐渐演变的趋势，即多种细胞成分的弥漫性增生→早期结节性生长趋势(腺体增殖旺盛呈克隆化生长)→多克隆的结节性增生→单克隆的单个结节形成。与Tominaga和 Takagi[9]认为结节是由单个甲状旁腺细胞增生而形成的单克隆结节的结果一致。
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PCNA为DNA聚合酶δ的辅因子，在细胞生长周期的S期表达最明显，是反映细胞增殖敏感而可靠的指标。本研究SHPT腺体中PCNA表达增加，NH区尤著，说明细胞增殖旺盛。PCNA表达程度与腺体重量成正相关，说明腺体越大增生能力越强，VDR愈少。
上述结果提示，对严重SHPT患者行甲状旁腺全切加自体移植时，应选用弥漫性增生且重量较小的组织作移植片，以防移植片增生过甚导致复发。SHPT时甲状旁腺重量、细胞增殖程度平行，VDR表达明显减少，可能是对1,25-(OH)2D3抵抗和甲状旁腺生长失控的重要原因。今后研究促进VDR表达上调的药物，可能将开辟一种新的治疗途径。
(本文图1～6见插页图第13页)
基金项目：江苏省教委基金资助(182FA9707)
参考文献
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收稿日期：1999-09-03, http://www.100md.com