幽门螺杆菌与胃上皮细胞相互作用的电镜观察
作者：杨艺 邓长生 姚学军 刘汉燕 陈默
单位：杨艺(湖北医科大学附属第二医院消化内科 武汉，430071)；邓长生(湖北医科大学附属第二医院消化内科 武汉，430071)；姚学军(湖北医科大学病毒研究所)；刘汉燕(湖北医科大学病毒研究所)；陈默(湖北医科大学病毒研究所)
关键词：螺杆菌，幽门；上皮细胞；显微镜检查，电子，扫描透射
中华内科杂志000707 【摘要】目的 研究幽门螺杆菌(Hp)在体外与胃上皮细胞相互作用后的形态变化。方法 采用Hp与细胞体外共培养技术，结合透射电镜观察Hp活菌与人胃腺癌细胞系SGC-7901相互作用后的超微结构变化。结果 Hp以多种不同的方式黏附于胃上皮细胞。高浓度的Hp(107 CFU/ml)可使体外培养的胃上皮细胞发生明显病变：微绒毛丢失与胞浆内出现空泡样变等。反之，胃上皮细胞也可作用于Hp，除了使其发生球形变和空泡样变外，还可将它吞噬降解，且共同孵育时间越长，作用越明显。结论 Hp与胃上皮细胞既相互作用又相互适应，这在一定程度上可解释人体感染Hp后所表现出的多样化结局和Hp感染的难治性。
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Electron microscopic observation after interaction between Helicobacter pylori and gastric epithelial cells
YANG Yi
(Department of Gastroenterology，The Second Affiliated Hospital，Hubei Medical University，Wuhan 430071，China)
DENG Changsheng,YAO Xuejun,et al.
【Abstract】Objective To observe the morphologic changes after interaction between Helicobacter pylori (Hp)and gastric epithelial cells in vitro.Methods Hp was coincubated with human gastric cancer cell line SGC-7901 for up to 72 hours and their ultrastructural changes were investigated with transmission electron microscopy.Results After coincubation of the Hp and cells,the following morphologic alterations were found：(1) Various patterns of attachment of the Hp to the cell membrane;(2) A number of Hp appeared to be degenerating and showed coccoid forms; (3) Cytoplasmic vacuolation of the cells appeared; (4) Many Hps were engulfed and degraded by the cells.These changes became more apparent with prolongation of coincubation time.Conclusion Hp and gastric epithelial cell can interact and mutually adapt when they both coexist.The results might be useful to explain that multiple outcomes are manifested after Hp infection.
, 百拇医药
【Key words】Helicobacter pylori；Epithelial cells；Microscopy，electron，scanning transmission
幽门螺杆菌(Hp)是慢性胃炎及消化性溃疡的主要致病因子[1]，并与胃癌的发生密切相关[2]。Hp产生的毒素和有毒性作用的酶能破坏胃黏膜屏障，它还能使机体产生炎症和免疫反应，最终导致一系列病变的形成。但人体感染Hp后，其临床结局却存在很大差异，这可能和Hp与胃上皮细胞相互作用后的消长有关。关于Hp单方面在体内外对胃黏膜影响的报道较为多见[3]，然而，胃上皮细胞在体内外对Hp的直接作用却鲜见报道。我们在细胞培养的基础上，结合透射电镜技术对Hp与胃上皮细胞在体外的相互作用进行了形态学观察。
材料与方法
一、Hp活菌悬液的制备
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Hp国际标准菌株NCTC11637接种于含5%羊血的厌氧菌培养基平板,置于37℃微需氧环境中(5% O2、10% CO2、5% H2、80% N2)培养，3 d后收集细菌，用PBS制成细菌悬液，在分光光度计上确定Hp的浓度(1A660=1×108 CFU/ml)。
二、 人胃腺癌细胞系SGC-7901的培养
人胃腺癌细胞系SGC-7901购自上海细胞生物学研究所，细胞培养在RPMI1640培养液中(含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 U/ml链霉素)，置于37℃含5% CO2的培养箱内培养，每2天传代1次。
三、 Hp与细胞的共同孵育
细胞以2.5×106/ml密度接种于100 ml T型培养瓶中，置于37℃恒温箱内培养，24 h后弃去原有细胞培养液，加入浓度为107 CFU/ml的细菌悬液(用无抗生素、含2%胎牛血清的RPMI1640稀释)，以Hp 与细胞分别单独培养在无抗生素、含2%胎牛血清的RPMI1640中作为对照。
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四、 透射电镜标本的制备
1.细胞培养的标本制备：分别于Hp与细胞共同孵育后的24、48及72 h，用自制的橡皮刮子收集细胞，2.5%戊二醛固定细胞团块2 h，再用1%四氧化锇后固定30 min，固定好的细胞团块用丙酮逐级脱水，环氧树脂包埋，超薄切片机切片，醋酸铀和枸橼酸铅双重染色。
2.Hp负染标本制备：将新鲜培养的细菌悬液滴在载网上，让悬滴保持3～5 min后，用滤纸吸干，再用2%磷酸钨负染15 min，自然干燥后待检。
结果
一、未经共育处理的 Hp的超微结构
Hp负染标本显示其一端或两端带有2～6条鞭毛，长度长于菌体，鞭毛外周均有明显的鞘被复(图1a)。在4d以内的培养物中极少有球形菌。生长在含2%胎牛血清RPMI1640中的Hp也多呈螺旋形，少数呈球形。
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二、未感染Hp的胃腺癌细胞系SGC-7901的超微结构
每个细胞均有数量不等的微绒毛，它不规则地分布在整个细胞表面，粗细长短不一。浆内可见丰富的细胞器。细胞核大，偏于一侧，核膜有切迹，核内有1～3个核仁(图1b)。
三、 Hp与细胞共同孵育后Hp和细胞的超微结构改变
Hp与细胞共同孵育24 h后，细菌和细胞与对照组均无明显差异；当Hp与细胞共同培养至48 h时，一部分细菌发生球形样改变，这种球形体体积较小，有完整的细胞壁与细胞膜，细胞质电子密度较高，细胞则表现为胞浆内出现小的空泡(图2)；当继续培养至72 h，多数细菌均变为球形体，其体积较前膨大，细胞质内出现空泡样变，甚至濒临解体，少数细菌保持了完整的结构，细胞也出现明显病变：胞浆内充满大小不一的空泡，部分细胞的胞浆内和空泡中可见到被吞噬的Hp ，胞核未见明显异常(图3)。
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四、Hp黏附于胃上皮细胞的形态观察
当Hp与细胞共育24 h或48 h后，细菌多以与细胞紧密接触的方式黏附于上皮细胞，而细胞膜轮廓无明显改变或稍突起。当共育至72 h后，可见多种黏附形态： Hp伸出黏附足与细胞相连；细菌被细胞膜和其绒毛包绕，细胞膜与细菌膜融合在一起(图4a)；以及Hp被细胞吞噬，被吞噬的Hp多为球形体，有的结构完整，有的却呈空泡样变，还可见到Hp被降解的残余小体(图4b)。
讨论
我们用透射电镜技术观察了Hp活菌与体外培养的人胃腺癌细胞系SGC-7901共同培养后的形态变化。在本实验条件下，Hp仍能保持生长繁殖，与SGC-7901细胞处于共生状态而又互有影响，成功地建立了Hp活菌感染胃上皮细胞的体外模型。实验结果表明，高浓度的Hp可使体外培养的胃上皮细胞发生明显病变；反过来，胃上皮细胞也可作用于Hp，除了使之发生球形变和空泡样变外，它还可吞噬降解Hp，共同孵育时间越长，其作用越明显。Noach等[4]观察了Hp在体内对人胃上皮细胞超微结构的影响，结果表明，黏附有Hp的上皮细胞常表现出多种退行性变：微绒毛丢失、胞浆内空泡形成和细胞骨架的破坏。这与我们在体外观察到的现象一致，表明Hp除了通过机体内炎症、免疫等因素损伤胃黏膜外，Hp自身直接的致病作用在上消化道疾病的发病中占有重要的地位。
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Noach等[4]还观察到Hp在体内以5种不同的方式黏附于胃上皮细胞：Hp占据了细胞膜的隐窝；Hp与细胞膜相毗连；细菌膜之间因膜的液化而融合在一起；Hp的细胞胞浆内在化，即Hp侵入细胞内。上述几种黏附方式是由不同的机制介导或为Hp被细胞吞噬过程中的不同阶段尚不清楚。我们也观察到了这几种黏附方式，且还见到Hp在细胞内被降解的过程，故认为这几种黏附方式可能是上皮细胞吞噬Hp的几个不同阶段。本实验中Hp在体外与胃上皮细胞共同孵育后，不仅向球形转变，且部分细菌细胞质电子密度也明显降低，出现空泡样变，甚至濒临解体，这在国内外罕见报道 。Hp存在螺旋体和圆球体2种形态，其在不利环境中，如暴露于抗生素、营养缺乏及延长培养时间等情况下可转为球形体[5]。Hp在本实验中的圆球体改变说明胃上皮细胞自身或其释放的某种因子也能直接作用于Hp，造成不利于Hp生长的环境，使Hp球形变。Kusters等[6]的研究表明,Hp圆球体是一种退化形式而不具备传染性，而Bode等[7]认为Hp球形体是一种休眠形式，在一定情况下可以转化为螺旋体而致病，在Hp的传播过程中起重要作用。本实验中，Hp在对抗胃上皮细胞作用时，一部分球形细菌解体死亡，而另一部分球形细菌仍保持了完整的结构，如果它是一种休眠形式，而体内也存在类似情况，则可部分解释抗生素治疗后的Hp复发。总之，本研究关于Hp在体外对胃上皮细胞形态的影响与体内所见的报道基本一致。在体外胃上皮细胞与Hp共同培养时，细胞对Hp也有直接作用。这表明胃上皮细胞与Hp本身即是一对矛盾的两个方面，既相互作用又相互适应，这在一定程度上可解释人体感染Hp后所表现出的多样化结局。
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图1 Hp和SGC-7901 细胞在共育前的超微结构。a： Hp的负染标本 ×16 000。b：富含细胞器的SGC-7901 细胞 ×10 000
图2 Hp与SGC-7901细胞共育48h后的超微结构变化，部分Hp变为球形而细胞的胞浆内出现小的空泡 × 25 000
图3 Hp与SGC-7901细胞共育72h后的超微结构变化，显示细胞的退形性变和胞浆内被吞噬的Hp，箭头示被吞噬的Hp ×20 000
图4 Hp与SGC-7901细胞共育后的黏附形态。a：Hp被细胞的微绒毛和质膜包绕，细菌膜与细胞膜融合在一起，箭头示被包绕的Hp。b+：Hp被细胞吞噬和降解，箭头示不同降解过程的Hp ×20 000
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参考文献
1，Nardone G,Staibano S,Rocco A,et al.Effect of Helicobacter pylori infection and its eradication on cell proliferation,DNA status,and oncogene expression in patients with chronic gastritis.Gut,1999,44:789-799.
2，Takashi W,Mayumi T,Hirofumi N,et al.Helicobacter pylori infection induce gastric cancer in mongolian Gerbils.Gastroenterology,1998,115:642-648.
3，Su B,Johansson S,Fallman M,et al.Signal transduction-mediated adherence and entry of Helicobacter pylori into cultured cells.Gastroenterology,1999,117:595-604.
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4，Noach LA,Rolf TM,Tytgat GNJ.Electron microscopic study of associated between Helicobacter pylori and gastric and duodenal mucosa.J Clin Pathol,1994,47:699-704.
5，郑鹏远，唐芙爱，华杰松，等.幽门螺杆菌二种形态的研究.中华消化杂志，1999，19：230-232.
6，Kusters JG,Gerrits MM,Vandenbrouke-Grauls CMJE.Coccoid forms of Helicobacter pylori are the morphological manifestation of cell death.Infect Immun,1997,9: 3672-3679.
7，Bode G,Mauch F,Malfertheiner P.The coccoid form of Helicobacter pylori.Criteria for their viability.Epidemiol Infect,1993,111:483-490.
收稿日期：1999-12-03, 百拇医药
单位：杨艺(湖北医科大学附属第二医院消化内科 武汉，430071)；邓长生(湖北医科大学附属第二医院消化内科 武汉，430071)；姚学军(湖北医科大学病毒研究所)；刘汉燕(湖北医科大学病毒研究所)；陈默(湖北医科大学病毒研究所)
关键词：螺杆菌，幽门；上皮细胞；显微镜检查，电子，扫描透射
中华内科杂志000707 【摘要】目的 研究幽门螺杆菌(Hp)在体外与胃上皮细胞相互作用后的形态变化。方法 采用Hp与细胞体外共培养技术，结合透射电镜观察Hp活菌与人胃腺癌细胞系SGC-7901相互作用后的超微结构变化。结果 Hp以多种不同的方式黏附于胃上皮细胞。高浓度的Hp(107 CFU/ml)可使体外培养的胃上皮细胞发生明显病变：微绒毛丢失与胞浆内出现空泡样变等。反之，胃上皮细胞也可作用于Hp，除了使其发生球形变和空泡样变外，还可将它吞噬降解，且共同孵育时间越长，作用越明显。结论 Hp与胃上皮细胞既相互作用又相互适应，这在一定程度上可解释人体感染Hp后所表现出的多样化结局和Hp感染的难治性。
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Electron microscopic observation after interaction between Helicobacter pylori and gastric epithelial cells
YANG Yi
(Department of Gastroenterology，The Second Affiliated Hospital，Hubei Medical University，Wuhan 430071，China)
DENG Changsheng,YAO Xuejun,et al.
【Abstract】Objective To observe the morphologic changes after interaction between Helicobacter pylori (Hp)and gastric epithelial cells in vitro.Methods Hp was coincubated with human gastric cancer cell line SGC-7901 for up to 72 hours and their ultrastructural changes were investigated with transmission electron microscopy.Results After coincubation of the Hp and cells,the following morphologic alterations were found：(1) Various patterns of attachment of the Hp to the cell membrane;(2) A number of Hp appeared to be degenerating and showed coccoid forms; (3) Cytoplasmic vacuolation of the cells appeared; (4) Many Hps were engulfed and degraded by the cells.These changes became more apparent with prolongation of coincubation time.Conclusion Hp and gastric epithelial cell can interact and mutually adapt when they both coexist.The results might be useful to explain that multiple outcomes are manifested after Hp infection.
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【Key words】Helicobacter pylori；Epithelial cells；Microscopy，electron，scanning transmission
幽门螺杆菌(Hp)是慢性胃炎及消化性溃疡的主要致病因子[1]，并与胃癌的发生密切相关[2]。Hp产生的毒素和有毒性作用的酶能破坏胃黏膜屏障，它还能使机体产生炎症和免疫反应，最终导致一系列病变的形成。但人体感染Hp后，其临床结局却存在很大差异，这可能和Hp与胃上皮细胞相互作用后的消长有关。关于Hp单方面在体内外对胃黏膜影响的报道较为多见[3]，然而，胃上皮细胞在体内外对Hp的直接作用却鲜见报道。我们在细胞培养的基础上，结合透射电镜技术对Hp与胃上皮细胞在体外的相互作用进行了形态学观察。
材料与方法
一、Hp活菌悬液的制备
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Hp国际标准菌株NCTC11637接种于含5%羊血的厌氧菌培养基平板,置于37℃微需氧环境中(5% O2、10% CO2、5% H2、80% N2)培养，3 d后收集细菌，用PBS制成细菌悬液，在分光光度计上确定Hp的浓度(1A660=1×108 CFU/ml)。
二、 人胃腺癌细胞系SGC-7901的培养
人胃腺癌细胞系SGC-7901购自上海细胞生物学研究所，细胞培养在RPMI1640培养液中(含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 U/ml链霉素)，置于37℃含5% CO2的培养箱内培养，每2天传代1次。
三、 Hp与细胞的共同孵育
细胞以2.5×106/ml密度接种于100 ml T型培养瓶中，置于37℃恒温箱内培养，24 h后弃去原有细胞培养液，加入浓度为107 CFU/ml的细菌悬液(用无抗生素、含2%胎牛血清的RPMI1640稀释)，以Hp 与细胞分别单独培养在无抗生素、含2%胎牛血清的RPMI1640中作为对照。
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四、 透射电镜标本的制备
1.细胞培养的标本制备：分别于Hp与细胞共同孵育后的24、48及72 h，用自制的橡皮刮子收集细胞，2.5%戊二醛固定细胞团块2 h，再用1%四氧化锇后固定30 min，固定好的细胞团块用丙酮逐级脱水，环氧树脂包埋，超薄切片机切片，醋酸铀和枸橼酸铅双重染色。
2.Hp负染标本制备：将新鲜培养的细菌悬液滴在载网上，让悬滴保持3～5 min后，用滤纸吸干，再用2%磷酸钨负染15 min，自然干燥后待检。
结果
一、未经共育处理的 Hp的超微结构
Hp负染标本显示其一端或两端带有2～6条鞭毛，长度长于菌体，鞭毛外周均有明显的鞘被复(图1a)。在4d以内的培养物中极少有球形菌。生长在含2%胎牛血清RPMI1640中的Hp也多呈螺旋形，少数呈球形。
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二、未感染Hp的胃腺癌细胞系SGC-7901的超微结构
每个细胞均有数量不等的微绒毛，它不规则地分布在整个细胞表面，粗细长短不一。浆内可见丰富的细胞器。细胞核大，偏于一侧，核膜有切迹，核内有1～3个核仁(图1b)。
三、 Hp与细胞共同孵育后Hp和细胞的超微结构改变
Hp与细胞共同孵育24 h后，细菌和细胞与对照组均无明显差异；当Hp与细胞共同培养至48 h时，一部分细菌发生球形样改变，这种球形体体积较小，有完整的细胞壁与细胞膜，细胞质电子密度较高，细胞则表现为胞浆内出现小的空泡(图2)；当继续培养至72 h，多数细菌均变为球形体，其体积较前膨大，细胞质内出现空泡样变，甚至濒临解体，少数细菌保持了完整的结构，细胞也出现明显病变：胞浆内充满大小不一的空泡，部分细胞的胞浆内和空泡中可见到被吞噬的Hp ，胞核未见明显异常(图3)。
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四、Hp黏附于胃上皮细胞的形态观察
当Hp与细胞共育24 h或48 h后，细菌多以与细胞紧密接触的方式黏附于上皮细胞，而细胞膜轮廓无明显改变或稍突起。当共育至72 h后，可见多种黏附形态： Hp伸出黏附足与细胞相连；细菌被细胞膜和其绒毛包绕，细胞膜与细菌膜融合在一起(图4a)；以及Hp被细胞吞噬，被吞噬的Hp多为球形体，有的结构完整，有的却呈空泡样变，还可见到Hp被降解的残余小体(图4b)。
讨论
我们用透射电镜技术观察了Hp活菌与体外培养的人胃腺癌细胞系SGC-7901共同培养后的形态变化。在本实验条件下，Hp仍能保持生长繁殖，与SGC-7901细胞处于共生状态而又互有影响，成功地建立了Hp活菌感染胃上皮细胞的体外模型。实验结果表明，高浓度的Hp可使体外培养的胃上皮细胞发生明显病变；反过来，胃上皮细胞也可作用于Hp，除了使之发生球形变和空泡样变外，它还可吞噬降解Hp，共同孵育时间越长，其作用越明显。Noach等[4]观察了Hp在体内对人胃上皮细胞超微结构的影响，结果表明，黏附有Hp的上皮细胞常表现出多种退行性变：微绒毛丢失、胞浆内空泡形成和细胞骨架的破坏。这与我们在体外观察到的现象一致，表明Hp除了通过机体内炎症、免疫等因素损伤胃黏膜外，Hp自身直接的致病作用在上消化道疾病的发病中占有重要的地位。
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Noach等[4]还观察到Hp在体内以5种不同的方式黏附于胃上皮细胞：Hp占据了细胞膜的隐窝；Hp与细胞膜相毗连；细菌膜之间因膜的液化而融合在一起；Hp的细胞胞浆内在化，即Hp侵入细胞内。上述几种黏附方式是由不同的机制介导或为Hp被细胞吞噬过程中的不同阶段尚不清楚。我们也观察到了这几种黏附方式，且还见到Hp在细胞内被降解的过程，故认为这几种黏附方式可能是上皮细胞吞噬Hp的几个不同阶段。本实验中Hp在体外与胃上皮细胞共同孵育后，不仅向球形转变，且部分细菌细胞质电子密度也明显降低，出现空泡样变，甚至濒临解体，这在国内外罕见报道 。Hp存在螺旋体和圆球体2种形态，其在不利环境中，如暴露于抗生素、营养缺乏及延长培养时间等情况下可转为球形体[5]。Hp在本实验中的圆球体改变说明胃上皮细胞自身或其释放的某种因子也能直接作用于Hp，造成不利于Hp生长的环境，使Hp球形变。Kusters等[6]的研究表明,Hp圆球体是一种退化形式而不具备传染性，而Bode等[7]认为Hp球形体是一种休眠形式，在一定情况下可以转化为螺旋体而致病，在Hp的传播过程中起重要作用。本实验中，Hp在对抗胃上皮细胞作用时，一部分球形细菌解体死亡，而另一部分球形细菌仍保持了完整的结构，如果它是一种休眠形式，而体内也存在类似情况，则可部分解释抗生素治疗后的Hp复发。总之，本研究关于Hp在体外对胃上皮细胞形态的影响与体内所见的报道基本一致。在体外胃上皮细胞与Hp共同培养时，细胞对Hp也有直接作用。这表明胃上皮细胞与Hp本身即是一对矛盾的两个方面，既相互作用又相互适应，这在一定程度上可解释人体感染Hp后所表现出的多样化结局。
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图1 Hp和SGC-7901 细胞在共育前的超微结构。a： Hp的负染标本 ×16 000。b：富含细胞器的SGC-7901 细胞 ×10 000
图2 Hp与SGC-7901细胞共育48h后的超微结构变化，部分Hp变为球形而细胞的胞浆内出现小的空泡 × 25 000
图3 Hp与SGC-7901细胞共育72h后的超微结构变化，显示细胞的退形性变和胞浆内被吞噬的Hp，箭头示被吞噬的Hp ×20 000
图4 Hp与SGC-7901细胞共育后的黏附形态。a：Hp被细胞的微绒毛和质膜包绕，细菌膜与细胞膜融合在一起，箭头示被包绕的Hp。b+：Hp被细胞吞噬和降解，箭头示不同降解过程的Hp ×20 000
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参考文献
1，Nardone G,Staibano S,Rocco A,et al.Effect of Helicobacter pylori infection and its eradication on cell proliferation,DNA status,and oncogene expression in patients with chronic gastritis.Gut,1999,44:789-799.
2，Takashi W,Mayumi T,Hirofumi N,et al.Helicobacter pylori infection induce gastric cancer in mongolian Gerbils.Gastroenterology,1998,115:642-648.
3，Su B,Johansson S,Fallman M,et al.Signal transduction-mediated adherence and entry of Helicobacter pylori into cultured cells.Gastroenterology,1999,117:595-604.
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5，郑鹏远，唐芙爱，华杰松，等.幽门螺杆菌二种形态的研究.中华消化杂志，1999，19：230-232.
6，Kusters JG,Gerrits MM,Vandenbrouke-Grauls CMJE.Coccoid forms of Helicobacter pylori are the morphological manifestation of cell death.Infect Immun,1997,9: 3672-3679.
7，Bode G,Mauch F,Malfertheiner P.The coccoid form of Helicobacter pylori.Criteria for their viability.Epidemiol Infect,1993,111:483-490.
收稿日期：1999-12-03, 百拇医药