慢性丙型肝炎的自身免疫现象
作者：刘文恩 张铮 谭德明 范学工 欧阳颗
单位：张铮 谭德明 范学工 欧阳颗(长沙，湖南医科大学附属湘雅医院传染科 410008)；刘文恩(现在检验科)
关键词：
中华内科杂志000825 有研究表明，Fas系统基因变异或Fas信号传导障碍或血清可溶性Fas(sFas)水平增高均可使Fas诱导的淋巴细胞凋亡减少导致自身免疫[1，2]。 我们对一批慢性HCV感染者进行有关血清自身抗体、sFas及外周血淋巴细胞亚群及其凋亡检测,试图探讨慢性HCV感染诱导自身免疫现象的发病机制。
一、资料与方法
1.对象： 66例慢性HCV感染者系我科1997年3月至1998年6月的门诊和住院病人，男42例，女24例，平均年龄48岁，诊断符合1995年5月全国第五次传染病寄生虫病学术会议修订的诊断标准。所有病例近3个月内未使用过免疫调节剂；39例健康献血员作为正常对照，37例我科同期住院的慢性HBV感染者作为病人对照。对其中57例慢性HCV感染者及30例正常献血员进行血清sFas检测。对其中18例慢性HCV感染者及16例健康献血员进行外周血淋巴细胞亚群及其凋亡检测。
, 百拇医药
2.方法：(1)自身抗体测定：抗GOR抗体测定采用ELISA方法，GOR多肽购自中国科学院上海生物化学研究所。抗核抗体(ANA)测定采用间接免疫荧光法，大鼠肝抗原片由本院免疫室制备。抗甲状腺球蛋白抗体(TGA)及抗甲状腺微粒体抗体(TMA)测定采用放射免疫法，试剂购自卫生部上海生物制品研究所。(2)sFas检测方法：双抗体夹心ELISA法，人sAPO-1/Fas(CD95)ELISA试剂盒为美国Genzyme公司产品。(3)T细胞亚群及其凋亡检测： 用淋巴细胞分离液分离外周血单个核细胞(PBMCs),细胞重悬于10% RPMI 1640完全培养基中，调整细胞浓度至1×106/ml，置24孔细胞培养板，加入美洲商陆(PWM，Sigma)终浓度为5 mg/L，37℃ 5% CO2湿润空气的培养箱中48 h，每管取细胞1×106分别加入10 μl抗CD3/FITC+抗CD19/RPE及抗CD4/FITC+抗CD8/RPE双色标记的单克隆抗体(DAKO)使细胞染色。为了去除背景染色，同时取1×106细胞加入10 μl鼠IgG1 FITC+IgM1 PE双色标志物(DAKO)进行背景染色。再取1ml 7AAD/PBS(含7AAD 20 μg，Sigma)使凋亡细胞染色，置流式细胞仪(Becton. Dicknson. US.FACS)检测PBMCs中淋巴细胞亚群及其凋亡百分率。
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3.统计学处理: 自身抗体采用卡方检验。sFas、淋巴细胞亚群及其凋亡以
±s表示，采用t检验。
二、结果
1. 66份慢性 HCV感染者的血清抗GOR 、ANA和TMA和(或)TGA阳性率分别为53.03%(35/66)、42.4% (28/66)、13.6% (9/66)，与正常对照组的5.1%(2/39)、2.6%(1/39)、0比较，差异具有显著性(P<0.005, χ2=24.649； P2=19.49；, P<0.01， χ2=5.82)；与慢性HBV感染者的8.1%(3/37)、21.6%(8/37)、2.7%(1/37)比较，慢性HCV感染者抗GOR、ANA阳性率显著增高(P<0.005 ，χ2=20.550；P<0.05， χ2=4.513)。
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2. 57份慢性HCV感染者血清标本sFas浓度为(22.59±7.92) μg/L，30份正常血清sFas浓度为(9.56±3.85) μg/L，两者比较差异有显著性(t=5.410,P<0.001)。抗GOR抗体阳性者血清sFas水平有增高的趋势(t=1.813，P=0.123),但差异无显著性。血清sFas水平与ANA、TMA和(或)TGA均未发现相关关系。
3.慢性HCV感染者淋巴细胞亚群凋亡百分率与正常对照组比较见表1。 慢性HCV感染者中抗GOR阳性组CD+4T细胞及CD+19B细胞凋亡减少,与抗GOR阴性组比较差异有显著性(表2)。
表1 慢性HCV感染者淋巴细胞亚群凋亡百分率(%，±s) 组别
, 百拇医药
例数
PBMCs
CD+3
CD+4
CD+8
HCV组
18
59.47±
13.31*
64.19±
13.53*
, 百拇医药
63.5±
15.11
45.4±
16.05
正常组
16
47.05±
14.99
51.42±
15.62
56.0±
15.66
42.0±
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12.35
注：与正常组比较，*P<0.05，t=2.442表2 慢性HCV感染者抗GOR阳性与阴性者
淋巴细胞亚群凋亡百分率(%，±s)
例数
PBMC
CD+3
CD+4
CD+8
CD+19B
, 百拇医药
抗GOR(+)
12
56.7±
14.58
63.2±
16.05
55.43±
12.3*
46.6±
17.45
33.27±
15.99**
, 百拇医药
抗GOR(-)
6
64.66±
8.4
66.09±
5.37
73.2±
5.3
42.8±
12.39
52.80±
15.28
注：与抗GOR (-)者比较，*P<0.01，t=3.17；**P<0.05，t=2.294
, 百拇医药
讨论 本研究结果显示，慢性HCV感染者血清抗GOR、ANA、TMA和(或)TGA的阳性率均显著高于正常组，说明慢性HCV 感染者存在自身免疫现象。 Jodo等[3]及Seishima等[4]发现，慢性HCV感染所致肝纤维化和肝细胞肝癌患者血清sFas水平增高，但与自身免疫的关系未做进一步研究。 本研究对一批慢性HCV感染者检测血清sFas，结果显示，慢性HCV感染组sFas明显高于正常对照组(t=5.410,P<0.001),且抗GOR阳性者血清sFas水平有增高的趋势。sFas可竞争FasL与Fas结合，使Fas介导的凋亡减少。上述结果提示慢性HCV感染诱导的自身免疫可能与sFas增高有关，但血清sFas水平与ANA及TMA和(或)TGA均无相关关系，考虑慢性HCV感染诱导的自身免疫尚与别的因素有关。
本研究结果还显示，慢性HCV感染者PBMCs及CD+3 T细胞凋亡比正常组显著增加，可能由于PBMCs中存在HCV感染，使T细胞Fas表达增加所致。进一步分析发现，慢性HCV感染者抗GOR阳性组CD+4T及CD+19B细胞凋亡比抗GOR阴性组显著减少。CD+4T细胞含有自身反应性T细胞，当细胞凋亡减少时，不能有效清除自身反应性T细胞，自身反应性T细胞相对增加，CD+4 T细胞可辅助B细胞产生自身抗体，导致自身免疫[5]。因此慢性HCV感染抗GOR阳性组CD+4 T及CD+19 B淋巴细胞亚群之间的细胞凋亡不均衡现象与慢性HCV感染者的自身免疫密切相关，特别是CD+4 T细胞CD+19 B细胞凋亡减少，在慢性HCV感染诱导自身免疫反应中起重要作用。但由于淋巴细胞亚群及其凋亡检测例数较少，可能影响结果正确性，有待于扩大病例数进一步研究。 参考文献
, 百拇医药
1，Bettinardi A, Brugnoni D, Quiros-Roldan E, et al. Missense mutations in the Fas gene resulting in autoimmune lymphoproliferative syndrome: a molecular and immunological analysis. Blood , 1997, 89:902-909.
2，Dianzani U, Bragardo M, DiFranco D,et al. Deficiency of the Fas apoptosis pathway without Fas gene mutation in pediatric patients with autoimmunity /lymphoproliferation. Blood, 1997, 89:2871-2879.
3，Jodo S, Kobayashi S, Nakajima Y, et al. Elevated serum levels of soluble Fas/APO-1(CD95) in patients with hepatocellular carcinoma. Clin Exp Immunol , 1998, 112:166-171.
, 百拇医药
4，Seishima M, Takemura M, Saito K, et al. Increased serum soluble Fas(sFas) concentrations in HCV-positive patients with liver cirrhosis. J Hepatol, 1997, 27: 424-425.
5，Krammer PH, Dhein J, Walczak H, et al. The role of APO-1- mediated apoptosis in the immune system. Immunol Rev, 1994,142:175-191.
(收稿日期：1999-09-02), 百拇医药
单位：张铮 谭德明 范学工 欧阳颗(长沙，湖南医科大学附属湘雅医院传染科 410008)；刘文恩(现在检验科)
关键词：
中华内科杂志000825 有研究表明，Fas系统基因变异或Fas信号传导障碍或血清可溶性Fas(sFas)水平增高均可使Fas诱导的淋巴细胞凋亡减少导致自身免疫[1，2]。 我们对一批慢性HCV感染者进行有关血清自身抗体、sFas及外周血淋巴细胞亚群及其凋亡检测,试图探讨慢性HCV感染诱导自身免疫现象的发病机制。
一、资料与方法
1.对象： 66例慢性HCV感染者系我科1997年3月至1998年6月的门诊和住院病人，男42例，女24例，平均年龄48岁，诊断符合1995年5月全国第五次传染病寄生虫病学术会议修订的诊断标准。所有病例近3个月内未使用过免疫调节剂；39例健康献血员作为正常对照，37例我科同期住院的慢性HBV感染者作为病人对照。对其中57例慢性HCV感染者及30例正常献血员进行血清sFas检测。对其中18例慢性HCV感染者及16例健康献血员进行外周血淋巴细胞亚群及其凋亡检测。
, 百拇医药
2.方法：(1)自身抗体测定：抗GOR抗体测定采用ELISA方法，GOR多肽购自中国科学院上海生物化学研究所。抗核抗体(ANA)测定采用间接免疫荧光法，大鼠肝抗原片由本院免疫室制备。抗甲状腺球蛋白抗体(TGA)及抗甲状腺微粒体抗体(TMA)测定采用放射免疫法，试剂购自卫生部上海生物制品研究所。(2)sFas检测方法：双抗体夹心ELISA法，人sAPO-1/Fas(CD95)ELISA试剂盒为美国Genzyme公司产品。(3)T细胞亚群及其凋亡检测： 用淋巴细胞分离液分离外周血单个核细胞(PBMCs),细胞重悬于10% RPMI 1640完全培养基中，调整细胞浓度至1×106/ml，置24孔细胞培养板，加入美洲商陆(PWM，Sigma)终浓度为5 mg/L，37℃ 5% CO2湿润空气的培养箱中48 h，每管取细胞1×106分别加入10 μl抗CD3/FITC+抗CD19/RPE及抗CD4/FITC+抗CD8/RPE双色标记的单克隆抗体(DAKO)使细胞染色。为了去除背景染色，同时取1×106细胞加入10 μl鼠IgG1 FITC+IgM1 PE双色标志物(DAKO)进行背景染色。再取1ml 7AAD/PBS(含7AAD 20 μg，Sigma)使凋亡细胞染色，置流式细胞仪(Becton. Dicknson. US.FACS)检测PBMCs中淋巴细胞亚群及其凋亡百分率。
, http://www.100md.com
3.统计学处理: 自身抗体采用卡方检验。sFas、淋巴细胞亚群及其凋亡以
±s表示，采用t检验。二、结果
1. 66份慢性 HCV感染者的血清抗GOR 、ANA和TMA和(或)TGA阳性率分别为53.03%(35/66)、42.4% (28/66)、13.6% (9/66)，与正常对照组的5.1%(2/39)、2.6%(1/39)、0比较，差异具有显著性(P<0.005, χ2=24.649； P
, http://www.100md.com
2. 57份慢性HCV感染者血清标本sFas浓度为(22.59±7.92) μg/L，30份正常血清sFas浓度为(9.56±3.85) μg/L，两者比较差异有显著性(t=5.410,P<0.001)。抗GOR抗体阳性者血清sFas水平有增高的趋势(t=1.813，P=0.123),但差异无显著性。血清sFas水平与ANA、TMA和(或)TGA均未发现相关关系。
3.慢性HCV感染者淋巴细胞亚群凋亡百分率与正常对照组比较见表1。 慢性HCV感染者中抗GOR阳性组CD+4T细胞及CD+19B细胞凋亡减少,与抗GOR阴性组比较差异有显著性(表2)。
表1 慢性HCV感染者淋巴细胞亚群凋亡百分率(%，
±s) 组别, 百拇医药
例数
PBMCs
CD+3
CD+4
CD+8
HCV组
18
59.47±
13.31*
64.19±
13.53*
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63.5±
15.11
45.4±
16.05
正常组
16
47.05±
14.99
51.42±
15.62
56.0±
15.66
42.0±
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12.35
注：与正常组比较，*P<0.05，t=2.442表2 慢性HCV感染者抗GOR阳性与阴性者
淋巴细胞亚群凋亡百分率(%，
±s)例数
PBMC
CD+3
CD+4
CD+8
CD+19B
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抗GOR(+)
12
56.7±
14.58
63.2±
16.05
55.43±
12.3*
46.6±
17.45
33.27±
15.99**
, 百拇医药
抗GOR(-)
6
64.66±
8.4
66.09±
5.37
73.2±
5.3
42.8±
12.39
52.80±
15.28
注：与抗GOR (-)者比较，*P<0.01，t=3.17；**P<0.05，t=2.294
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讨论 本研究结果显示，慢性HCV感染者血清抗GOR、ANA、TMA和(或)TGA的阳性率均显著高于正常组，说明慢性HCV 感染者存在自身免疫现象。 Jodo等[3]及Seishima等[4]发现，慢性HCV感染所致肝纤维化和肝细胞肝癌患者血清sFas水平增高，但与自身免疫的关系未做进一步研究。 本研究对一批慢性HCV感染者检测血清sFas，结果显示，慢性HCV感染组sFas明显高于正常对照组(t=5.410,P<0.001),且抗GOR阳性者血清sFas水平有增高的趋势。sFas可竞争FasL与Fas结合，使Fas介导的凋亡减少。上述结果提示慢性HCV感染诱导的自身免疫可能与sFas增高有关，但血清sFas水平与ANA及TMA和(或)TGA均无相关关系，考虑慢性HCV感染诱导的自身免疫尚与别的因素有关。
本研究结果还显示，慢性HCV感染者PBMCs及CD+3 T细胞凋亡比正常组显著增加，可能由于PBMCs中存在HCV感染，使T细胞Fas表达增加所致。进一步分析发现，慢性HCV感染者抗GOR阳性组CD+4T及CD+19B细胞凋亡比抗GOR阴性组显著减少。CD+4T细胞含有自身反应性T细胞，当细胞凋亡减少时，不能有效清除自身反应性T细胞，自身反应性T细胞相对增加，CD+4 T细胞可辅助B细胞产生自身抗体，导致自身免疫[5]。因此慢性HCV感染抗GOR阳性组CD+4 T及CD+19 B淋巴细胞亚群之间的细胞凋亡不均衡现象与慢性HCV感染者的自身免疫密切相关，特别是CD+4 T细胞CD+19 B细胞凋亡减少，在慢性HCV感染诱导自身免疫反应中起重要作用。但由于淋巴细胞亚群及其凋亡检测例数较少，可能影响结果正确性，有待于扩大病例数进一步研究。 参考文献
, 百拇医药
1，Bettinardi A, Brugnoni D, Quiros-Roldan E, et al. Missense mutations in the Fas gene resulting in autoimmune lymphoproliferative syndrome: a molecular and immunological analysis. Blood , 1997, 89:902-909.
2，Dianzani U, Bragardo M, DiFranco D,et al. Deficiency of the Fas apoptosis pathway without Fas gene mutation in pediatric patients with autoimmunity /lymphoproliferation. Blood, 1997, 89:2871-2879.
3，Jodo S, Kobayashi S, Nakajima Y, et al. Elevated serum levels of soluble Fas/APO-1(CD95) in patients with hepatocellular carcinoma. Clin Exp Immunol , 1998, 112:166-171.
, 百拇医药
4，Seishima M, Takemura M, Saito K, et al. Increased serum soluble Fas(sFas) concentrations in HCV-positive patients with liver cirrhosis. J Hepatol, 1997, 27: 424-425.
5，Krammer PH, Dhein J, Walczak H, et al. The role of APO-1- mediated apoptosis in the immune system. Immunol Rev, 1994,142:175-191.
(收稿日期：1999-09-02), 百拇医药