进行性肌营养不良症基因诊断及家系分析
作者：蔡竖平 王忠孝 沈定国 苏凤霞
单位：沈定国 苏凤霞(北京 ，解放军总医院肌病研究室 100853)；竖平(现在解放军总医院老年医学研究所)；王忠孝(药材处)
关键词：肌营养不良；多态性,限制性片段长度；遗传性疾病
中华内科杂志000810 【摘要】 目的 在假肥大型进行性肌营养不良症家系中进行基因诊断与遗传咨询。方法 用多重聚合酶链反应方法扩增dystrophin基因9对外显子,检测有无外显子缺失,用聚合酶链反应方法扩增位于dystrophin基因内含子及5′、3′端的短串联重复顺序,所得产物进行等位片段长度多态性连锁分析。结果 在2个肌营养不良家系中检测到外显子及重复顺序片段缺失,在1个家系中仅发现重复顺序片段缺失，在1例散发家系中未发现缺失。通过分析均得到正常染色体、致病染色体与有再发风险的染色体单体型。结论 多重聚合酶链反应与短串联重复顺序多态性分析方法,可在Duchenne型和Becker型肌营养不良家系进行基因诊断、携带者检测及遗传咨询。
, 百拇医药
Gene diagnosis and pedigree analysis in families of Duchenne and Becker muscular dystrophy
CAI Shuping WANG Zhongxiao SHEN Dingguo et al
(Division of Neuromuscular Disorders Research, The General Hospital of PLA, Beijing 100853, China)
【Abstract】 Objective Gene diagnosis and pedigree analysis were carried out in families of Duchenne and Becker muscular dystrophy(DMD and BMD) in order to determine haplotypes in the patients, carriers and normal offspring. Methods Deletion analysis of the patients was performed using multiplex polymerase chain reaction of amplification with 9 dystrophin exons described by Chamberlain et al. Allelic fragment length polymorphism analysis was made on DNA with PCR amplification using primers of intragenic short tandem repeat (STR) sequences (STR44、 STR45、 STR49 and STR50), primers of 5′ end (5′DYS-II) and primers of 3′end (MZ18、 MZ19) in the members of the families. Results Deletions of exons as well as deletions of STR allelic fragments adjacent to the exon deletions were determined in two patients, hemizygosity at those loci was detected and carrier status ascertained in the mothers of the patients. The normal haplotypes were determined in some relatives of the patients. Deletion of allelic fragment of STR49 was found in a patient of the anather family with DMD and carrier status ascertained in the mother of the patient. No deletion was detected in the sporadic BMD family，but risk haplotype was determined. Conclusion The method of linkage analysis of STR sequence polymorphism can determine haplotypes at normal status or at risk status. It may be used in gene diagnosis, prenatal diagnosis and carrier detection in the families of Duchenne and Becker muscular dystrophy.
, 百拇医药
【Key words】 Muscular dystrophy; Polymorphism, restriction fragment length; Hereditary diseases
假肥大型进行性肌营养不良症(分Duchenne muscular dystrophy,DMD 型和Becker muscular dystrophy,BMD型)是X-染色体隐性遗传的等位基因病,其致病基因位于Xp21。近10年来运用分子生物学技术完成了该病的基因定位、cDNA克隆、外显子全序列测定等关键工作。大量家系的研究显示，约60% 的DMD/BMD患者有基因缺失，目前围绕基因缺失的“热点”区域，已设计了18对引物以检测外显子缺失,研制出RT-PCR、套式-PCR方法及内外引物以提高检测的精确度与灵敏度;合成了12对引物以分析DMD基因5′端、3′端以及缺失"热点"内含子的短串联重复顺序(short tandem repeat , STR)多态性。本实验运用9对外显子引物，6对短串联重复顺序引物在4个DMD/BMD家系用PCR方法检测患者的基因缺失，识别携带者，判断正常及风险染色体的单体型，有效地进行了临床诊断及遗传咨询。
, 百拇医药
材料与方法
一、临床资料
受检的4个DMD/BMD家系均来自解放军总医院肌病门诊，病例收集时间为1993年12月至1995年2月。患者具有典型的临床表现，其中3个家族中有两个以上同样患者，1个家族只有1例患者。肌电图示肌原性受损。磷酸肌酸激酶(CK)1 445～3 813 IU/L,乳酸脱氢酶(LDH)151.0～640.9 IU/L。
二、方法
1.DNA标本：抽取静脉血5 ml，常规分离白细胞，酚/氯仿法抽提白细胞核DNA,溶于Tris-EDTA(TE)溶液中-20 ℃保存备用。
2.PCR方法及条件：多重聚合酶链反应采用Chamberlain等[1]报告的9对引物。反应总体积50 μl，含10×反应缓冲液5 μl,dNTP各0.2 mmol/L, MgCl2 2.0 mmol/L,每种引物25 pmol, 模板DNA 0.5～1.0 μg, Taq 多聚酶4 U (军事医学科学院研制)。扩增条件:95 ℃预变性4 min, 94 ℃变性 45 s,55 ℃复性50 s,70 ℃延伸2 min,30个循环,最后延伸7 min。内含子短串联重复顺序(STR)引物位于dystrophin基因第44、45、49、50号内含子[2], 反应总体积30 μl,含10×反应缓冲液3 μl,dNTP各 0.2 mmol/L, MgCl2 1.5 mmol/L, 每种引物30 pmol,模板DNA 0.2～0.5 μg，Taq 多聚酶1.5 U。扩增条件: 94 ℃预变性 3 min, 94 ℃变性45 s,55 ℃复性50 s,67 ℃延伸90 s,30个循环,最后延伸10 min。 5′端引物(5′DYS-II)位于dystrophin脑启动子区[3],延伸条件改为63 ℃，延伸3 min,30个循环，最后延伸10 min。3′端引物(MZ18,MZ19)位于3′端不翻译区[4]，扩增条件：94 ℃预变性3 min，94 ℃ 变性40 s，62 ℃复性50 s，65 ℃延伸90 s，30个循环，最后延伸10 min。
, 百拇医药
3.电泳：多重PCR产物经2% 琼脂糖凝胶电泳在紫外灯下观察。电压70 V,时间0.5～1.0 h。STR扩增产物经琼脂糖电泳初步观察后，用6%～8%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分型，以PBR322/MspI作分子量标准。电压600 V,时间1～2 h。0.2%硝酸银染色[5]。
4.等位片段标记、识别方法：使用北京航空航天大学编辑的凝胶电泳图象分析软件标记在凝胶电泳中分型的 DNA片段，自动计算该片段的分子量。以英文大写字母A、B、C、D、X、Y分别代表STR44、STR45、STR49、STR50以及5′端、3′端位点所得到的DNA片段，以阿拉伯数字1、2、3...从小到大依次代表计算机实测的DNA片段的分子量。
结果
本组实验所测得STR-PCR等位片段数量及大小:见表1。
表1 短串联重复顺序多态性片段数量与分子量
, 百拇医药
等位片
段标记
分子量
(bp)
等位片
段标记
分子量
(bp)
5′(DYS-II)
X1
186
3′(MZ-18/19)
Y1
, 百拇医药
128
X2
190
Y2
132
X3
200
Y3
136
STR44
A1
148
STR49
, 百拇医药
C1
200
A2
156
C2
206
A3
160
C3
212
A4
166
C4
, 百拇医药 220
A5
172
C5
240
A6
180
C6
246
STR45
B1
120
C7
264
, 百拇医药
B2
124
STR50
D1
212
B3
128
D2
218
B4
136
D3
238
, http://www.100md.com B5
140
D4
246
4个家系分析如下：
家系1：为家族性DMD,在两代人中有4例男性发病(Ⅲ-7 ， IV-6，IV-8， IV-9)，多重PCR检查发现先证者(IV-6)第51号外显子缺失,STR-PCR发现第51号外显子近端的STR49、STR50位点的多态性片段缺失，其母亲(Ⅲ-2)的相应位点为半合子，显示为缺失基因的携带者。Ⅲ-6携带1条与Ⅲ-2相同的来自父亲的X-染色体及1条与Ⅲ-2不同的来自母亲的正常X-染色体，所以排除了其携带致病基因的危险。单体型分析结果及系谱图见图1。 II-2在其6次妊娠中，3次将其致病的染色体传递给后代(Ⅲ-2,Ⅲ-4,Ⅲ-7)，这个频率大大高于DMD基因的突变率(10.9×10ˉ5 基因/代)，因而排除了II-2的卵母细胞减数分裂时发生突变的可能性。如果II-2的体细胞(血细胞、皮肤细胞等)基因分析显示与先证者相同的单体型，那麽 II-2是缺失携带者；如果其体细胞显示突变型与野生型DNA片段共存的现象[6]，则支持II-2在囊胚期的新生突变，此时生殖细胞全部为突变型，而体细胞呈嵌合型。这两种状态对于后代的遗传影响是同样的。
, 百拇医药
Del:为缺失的STR位点
图1 家系1的系谱图及单体型分析
家系2：调查了4代人，仅第4代两个表兄弟患DMD，多重PCR没有发现外显子缺失，STR-PCR及电泳发现STR 49片段缺失。由于有些基因内部的同源重复顺序可能成为染色体重组的热点，导致部分基因片段的缺失或插入，可以认为由于内含子49的突变影响了内含子-外显子接头，并引起“阅读框架”的移码突变，表现为DMD。多态性片段分析结果显示(X1-A5-B4-del-D4 )为致病染色体单体型， Ⅲ-3为基因携带者(图2)。由于该家系第二代及其相关亲属未发现同样患者，而II-2又生产了两个携带DMD基因的女性(Ⅲ-3,Ⅲ-6)，所以首要考虑II-2在胚胎发育期生殖细胞突变引起嵌合的可能性，这种情况可导致1个以上的后代携带突变基因。
Del:为缺失的STR位点
, http://www.100md.com
图2 家系2的系谱图及单体型分析
家系3：为散发型BMD 。多重PCR检查未发现外显子缺失， STR-PCR发现患者(II-2)与其胞兄(II-1)在STR45、STR49、STR50及3′端4个位点等位片段的大小不能区别，患者的母亲在这4个内含子位点的多态性片段纯合，仅在STR44、5′端发现患者与其正常的兄弟得到了不同大小的DNA片段。因而可以推断这个家系中风险染色体的单体型为X1-A3-B4-C6-D3 -Y3(图3)。现有检查未证明该散发患者的染色体发生重组，所以不能确定患者为新生突变，又由于先证者为非缺失型BMD，也难以确定其母与先证者相同的X-染色体是否为致病染色体 ，只能认为这个染色体的单体型为风险单体型，有再发风险。患者之母血清CPK升高将有助于其携带者身份的确定。
图3 家系3的系谱图及单体型分析
, 百拇医药
家系4：分析了1个少见的一代多患者发病的BMD家系(图4)。多重PCR显示第17、19、45号外显子缺失。STR-PCR发现患者(II-5、II-7)的STR44、STR45位点多态性片段缺失，其母亲(I-2)相应位点为半合子，其姐(II-3)获得了来自母亲的一条正常X染色体及来自父亲的一条X染色体，为家族中的 正常后代。这类家系的发病机制较为复杂，它可能是隐蔽的家族性BMD，致病基因由女性携带，在以前的几代中未能表现；或者是发生在先证者母亲胚胎早期的新生突变，由于突变发生在外胚层、中胚层及内胚层分化以前，可能导致生殖细胞全部为突变细胞，而体细胞是嵌合型，第3种可能为新生突变发生在先证者的外祖父母，母亲为致病基因携带者。本实验等位片段长度多态性分析表明，I-2的体细胞显示为缺失杂合子，符合第三种发病机制。在这种一代家系中，致病基因可多次传递最终导致家族性DMD。
Del:为缺失的STR位点
, 百拇医药
图4 家系4的系谱图及单体型分析
讨论
在本组实验中，我们使用多重PCR方法扩增dystrophin 基因缺失“热点”的9个外显子，使用STR-PCR方法扩增位于 dystrophin基因5′端脑启动子，3′端不翻译区及第44、45、49、50号内含子的短串联重复顺序，在4个不同类型的 DMD/BMD家系中均发现了有诊断意义的基因缺陷。家系分析也表明，如果要更准确地判断致病染色体的来源及突变发生的确切阶段，一定要得到尽可能多的患者亲属的临床资料及DNA标本，以分析DMD发病的共性与特点[7]。
本实验使用6%～8%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，在6个STR位点分别测出3～7个等位片段，片段大小与文献报告的范围有重叠，但不尽一致。例如文献报告STR 50位点片段范围在233～251 bp，而本组报告的 范围为212～246 bp，这可能由于中国汉族与其他人种之间的种族差异所致。本实验采用北京航空航天大学编辑的凝胶电泳图象分析软件标记在凝胶电泳中分型的 DNA片段，避免了手工测量的误差，提高了测量的精确性。由于未进行序列分析，所测片段大小不能精确到单个碱基。
, http://www.100md.com
实验还表明，我们所使用的短串联重复顺序具有高度的多态性，并且遵循Mendel定律遗传给后代，是家系中一种明显的遗传标记。运用多态性片段连锁分析方法可以区分患者、携带者和正常后代的单体型，阐明染色体的父母来源，为遗传咨询提供帮助。在高风险家族，如果已知先证者的单体型，可进行携带者妊娠的产前诊断。由于这些STR位点具有高度的多态性并可进行多位点分析，可以识别基因内重组并能在几乎所有DMD/BMD家系提供所需的诊断信息，从而显示了本方法在携带者诊断、产前诊断及遗传咨询方面良好的应用前景[8]。
志谢 本研究工作曾得到协和医科大学基础医学院医学遗传学室黄尚志教授和李辉技师的热情指导与大力协助
基金项目：本课题受国家自然科学基金资助(39370258)
参考文献
1，Chamberlain JS, Gibbs RA,Ranier JE, et al. Multiplex PCR for the diagnosis of Duchenne muscular dystrophy. In: Innis MA, Gelfand DH, Sninsky JJ, et al.eds. PCR protocols: a guide to methods and applications. New york : Academic Press, 1990. 272-281.
, 百拇医药
2，Clemens PR, Fenwick RG, Chamberlain JS, et al. Carrier detection and prenatal diagnosis in Duchenne and Becker muscular dystrophy families, using dinucleotide epeat polymorphisms. Am J Hum Genet, 1991, 49: 951-960.
3，Feener CA, Boyce FM, Kunkel LM. Rapid detection of CA polymorphisms in cloned DNA: application to the 5′ region of the dystrophin gene. Am J Hum Genet, 1991,48:621-627.
4，Oudet C, Heilig R, Mandel JL. An informative polymorphism detectable by polymerase chain reaction at the 3′ end of the dystrophin gene. Hum Genet, 1990, 84:283-285.
, http://www.100md.com
5，黄尚志，李辉.垂直电泳槽凝胶水平灌制法. 中华医学遗传学杂志， 1995，12：179.
6，Bunyan DJ, Robinson DO, Collins AL, et al. Germline and somatic mosaicism in a female carrier of Duchenne muscular dystrophy. Hum Genet, 1994, 93:541-544.
7，Zatz M, Sumita D, Campiotto S, et al. Paternal inheritance or different mutations in maternally related patients occur in about 3% of Duchenne familial cases. Am J Med Genet ,1998, 78: 361-365.
8，Dincer P, Topaloglu H, Ayter S. DNA diagnostic teste in Xp21 dystrophy families for prenatal diagnosis. Turk J Pediatri, 1998, 40:347-355.
(收稿日期：1999-07-21), 百拇医药
单位：沈定国 苏凤霞(北京 ，解放军总医院肌病研究室 100853)；竖平(现在解放军总医院老年医学研究所)；王忠孝(药材处)
关键词：肌营养不良；多态性,限制性片段长度；遗传性疾病
中华内科杂志000810 【摘要】 目的 在假肥大型进行性肌营养不良症家系中进行基因诊断与遗传咨询。方法 用多重聚合酶链反应方法扩增dystrophin基因9对外显子,检测有无外显子缺失,用聚合酶链反应方法扩增位于dystrophin基因内含子及5′、3′端的短串联重复顺序,所得产物进行等位片段长度多态性连锁分析。结果 在2个肌营养不良家系中检测到外显子及重复顺序片段缺失,在1个家系中仅发现重复顺序片段缺失，在1例散发家系中未发现缺失。通过分析均得到正常染色体、致病染色体与有再发风险的染色体单体型。结论 多重聚合酶链反应与短串联重复顺序多态性分析方法,可在Duchenne型和Becker型肌营养不良家系进行基因诊断、携带者检测及遗传咨询。
, 百拇医药
Gene diagnosis and pedigree analysis in families of Duchenne and Becker muscular dystrophy
CAI Shuping WANG Zhongxiao SHEN Dingguo et al
(Division of Neuromuscular Disorders Research, The General Hospital of PLA, Beijing 100853, China)
【Abstract】 Objective Gene diagnosis and pedigree analysis were carried out in families of Duchenne and Becker muscular dystrophy(DMD and BMD) in order to determine haplotypes in the patients, carriers and normal offspring. Methods Deletion analysis of the patients was performed using multiplex polymerase chain reaction of amplification with 9 dystrophin exons described by Chamberlain et al. Allelic fragment length polymorphism analysis was made on DNA with PCR amplification using primers of intragenic short tandem repeat (STR) sequences (STR44、 STR45、 STR49 and STR50), primers of 5′ end (5′DYS-II) and primers of 3′end (MZ18、 MZ19) in the members of the families. Results Deletions of exons as well as deletions of STR allelic fragments adjacent to the exon deletions were determined in two patients, hemizygosity at those loci was detected and carrier status ascertained in the mothers of the patients. The normal haplotypes were determined in some relatives of the patients. Deletion of allelic fragment of STR49 was found in a patient of the anather family with DMD and carrier status ascertained in the mother of the patient. No deletion was detected in the sporadic BMD family，but risk haplotype was determined. Conclusion The method of linkage analysis of STR sequence polymorphism can determine haplotypes at normal status or at risk status. It may be used in gene diagnosis, prenatal diagnosis and carrier detection in the families of Duchenne and Becker muscular dystrophy.
, 百拇医药
【Key words】 Muscular dystrophy; Polymorphism, restriction fragment length; Hereditary diseases
假肥大型进行性肌营养不良症(分Duchenne muscular dystrophy,DMD 型和Becker muscular dystrophy,BMD型)是X-染色体隐性遗传的等位基因病,其致病基因位于Xp21。近10年来运用分子生物学技术完成了该病的基因定位、cDNA克隆、外显子全序列测定等关键工作。大量家系的研究显示，约60% 的DMD/BMD患者有基因缺失，目前围绕基因缺失的“热点”区域，已设计了18对引物以检测外显子缺失,研制出RT-PCR、套式-PCR方法及内外引物以提高检测的精确度与灵敏度;合成了12对引物以分析DMD基因5′端、3′端以及缺失"热点"内含子的短串联重复顺序(short tandem repeat , STR)多态性。本实验运用9对外显子引物，6对短串联重复顺序引物在4个DMD/BMD家系用PCR方法检测患者的基因缺失，识别携带者，判断正常及风险染色体的单体型，有效地进行了临床诊断及遗传咨询。
, 百拇医药
材料与方法
一、临床资料
受检的4个DMD/BMD家系均来自解放军总医院肌病门诊，病例收集时间为1993年12月至1995年2月。患者具有典型的临床表现，其中3个家族中有两个以上同样患者，1个家族只有1例患者。肌电图示肌原性受损。磷酸肌酸激酶(CK)1 445～3 813 IU/L,乳酸脱氢酶(LDH)151.0～640.9 IU/L。
二、方法
1.DNA标本：抽取静脉血5 ml，常规分离白细胞，酚/氯仿法抽提白细胞核DNA,溶于Tris-EDTA(TE)溶液中-20 ℃保存备用。
2.PCR方法及条件：多重聚合酶链反应采用Chamberlain等[1]报告的9对引物。反应总体积50 μl，含10×反应缓冲液5 μl,dNTP各0.2 mmol/L, MgCl2 2.0 mmol/L,每种引物25 pmol, 模板DNA 0.5～1.0 μg, Taq 多聚酶4 U (军事医学科学院研制)。扩增条件:95 ℃预变性4 min, 94 ℃变性 45 s,55 ℃复性50 s,70 ℃延伸2 min,30个循环,最后延伸7 min。内含子短串联重复顺序(STR)引物位于dystrophin基因第44、45、49、50号内含子[2], 反应总体积30 μl,含10×反应缓冲液3 μl,dNTP各 0.2 mmol/L, MgCl2 1.5 mmol/L, 每种引物30 pmol,模板DNA 0.2～0.5 μg，Taq 多聚酶1.5 U。扩增条件: 94 ℃预变性 3 min, 94 ℃变性45 s,55 ℃复性50 s,67 ℃延伸90 s,30个循环,最后延伸10 min。 5′端引物(5′DYS-II)位于dystrophin脑启动子区[3],延伸条件改为63 ℃，延伸3 min,30个循环，最后延伸10 min。3′端引物(MZ18,MZ19)位于3′端不翻译区[4]，扩增条件：94 ℃预变性3 min，94 ℃ 变性40 s，62 ℃复性50 s，65 ℃延伸90 s，30个循环，最后延伸10 min。
, 百拇医药
3.电泳：多重PCR产物经2% 琼脂糖凝胶电泳在紫外灯下观察。电压70 V,时间0.5～1.0 h。STR扩增产物经琼脂糖电泳初步观察后，用6%～8%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分型，以PBR322/MspI作分子量标准。电压600 V,时间1～2 h。0.2%硝酸银染色[5]。
4.等位片段标记、识别方法：使用北京航空航天大学编辑的凝胶电泳图象分析软件标记在凝胶电泳中分型的 DNA片段，自动计算该片段的分子量。以英文大写字母A、B、C、D、X、Y分别代表STR44、STR45、STR49、STR50以及5′端、3′端位点所得到的DNA片段，以阿拉伯数字1、2、3...从小到大依次代表计算机实测的DNA片段的分子量。
结果
本组实验所测得STR-PCR等位片段数量及大小:见表1。
表1 短串联重复顺序多态性片段数量与分子量
, 百拇医药
等位片
段标记
分子量
(bp)
等位片
段标记
分子量
(bp)
5′(DYS-II)
X1
186
3′(MZ-18/19)
Y1
, 百拇医药
128
X2
190
Y2
132
X3
200
Y3
136
STR44
A1
148
STR49
, 百拇医药
C1
200
A2
156
C2
206
A3
160
C3
212
A4
166
C4
, 百拇医药 220
A5
172
C5
240
A6
180
C6
246
STR45
B1
120
C7
264
, 百拇医药
B2
124
STR50
D1
212
B3
128
D2
218
B4
136
D3
238
, http://www.100md.com B5
140
D4
246
4个家系分析如下：
家系1：为家族性DMD,在两代人中有4例男性发病(Ⅲ-7 ， IV-6，IV-8， IV-9)，多重PCR检查发现先证者(IV-6)第51号外显子缺失,STR-PCR发现第51号外显子近端的STR49、STR50位点的多态性片段缺失，其母亲(Ⅲ-2)的相应位点为半合子，显示为缺失基因的携带者。Ⅲ-6携带1条与Ⅲ-2相同的来自父亲的X-染色体及1条与Ⅲ-2不同的来自母亲的正常X-染色体，所以排除了其携带致病基因的危险。单体型分析结果及系谱图见图1。 II-2在其6次妊娠中，3次将其致病的染色体传递给后代(Ⅲ-2,Ⅲ-4,Ⅲ-7)，这个频率大大高于DMD基因的突变率(10.9×10ˉ5 基因/代)，因而排除了II-2的卵母细胞减数分裂时发生突变的可能性。如果II-2的体细胞(血细胞、皮肤细胞等)基因分析显示与先证者相同的单体型，那麽 II-2是缺失携带者；如果其体细胞显示突变型与野生型DNA片段共存的现象[6]，则支持II-2在囊胚期的新生突变，此时生殖细胞全部为突变型，而体细胞呈嵌合型。这两种状态对于后代的遗传影响是同样的。
, 百拇医药
Del:为缺失的STR位点
图1 家系1的系谱图及单体型分析
家系2：调查了4代人，仅第4代两个表兄弟患DMD，多重PCR没有发现外显子缺失，STR-PCR及电泳发现STR 49片段缺失。由于有些基因内部的同源重复顺序可能成为染色体重组的热点，导致部分基因片段的缺失或插入，可以认为由于内含子49的突变影响了内含子-外显子接头，并引起“阅读框架”的移码突变，表现为DMD。多态性片段分析结果显示(X1-A5-B4-del-D4 )为致病染色体单体型， Ⅲ-3为基因携带者(图2)。由于该家系第二代及其相关亲属未发现同样患者，而II-2又生产了两个携带DMD基因的女性(Ⅲ-3,Ⅲ-6)，所以首要考虑II-2在胚胎发育期生殖细胞突变引起嵌合的可能性，这种情况可导致1个以上的后代携带突变基因。
Del:为缺失的STR位点
, http://www.100md.com
图2 家系2的系谱图及单体型分析
家系3：为散发型BMD 。多重PCR检查未发现外显子缺失， STR-PCR发现患者(II-2)与其胞兄(II-1)在STR45、STR49、STR50及3′端4个位点等位片段的大小不能区别，患者的母亲在这4个内含子位点的多态性片段纯合，仅在STR44、5′端发现患者与其正常的兄弟得到了不同大小的DNA片段。因而可以推断这个家系中风险染色体的单体型为X1-A3-B4-C6-D3 -Y3(图3)。现有检查未证明该散发患者的染色体发生重组，所以不能确定患者为新生突变，又由于先证者为非缺失型BMD，也难以确定其母与先证者相同的X-染色体是否为致病染色体 ，只能认为这个染色体的单体型为风险单体型，有再发风险。患者之母血清CPK升高将有助于其携带者身份的确定。
图3 家系3的系谱图及单体型分析
, 百拇医药
家系4：分析了1个少见的一代多患者发病的BMD家系(图4)。多重PCR显示第17、19、45号外显子缺失。STR-PCR发现患者(II-5、II-7)的STR44、STR45位点多态性片段缺失，其母亲(I-2)相应位点为半合子，其姐(II-3)获得了来自母亲的一条正常X染色体及来自父亲的一条X染色体，为家族中的 正常后代。这类家系的发病机制较为复杂，它可能是隐蔽的家族性BMD，致病基因由女性携带，在以前的几代中未能表现；或者是发生在先证者母亲胚胎早期的新生突变，由于突变发生在外胚层、中胚层及内胚层分化以前，可能导致生殖细胞全部为突变细胞，而体细胞是嵌合型，第3种可能为新生突变发生在先证者的外祖父母，母亲为致病基因携带者。本实验等位片段长度多态性分析表明，I-2的体细胞显示为缺失杂合子，符合第三种发病机制。在这种一代家系中，致病基因可多次传递最终导致家族性DMD。
Del:为缺失的STR位点
, 百拇医药
图4 家系4的系谱图及单体型分析
讨论
在本组实验中，我们使用多重PCR方法扩增dystrophin 基因缺失“热点”的9个外显子，使用STR-PCR方法扩增位于 dystrophin基因5′端脑启动子，3′端不翻译区及第44、45、49、50号内含子的短串联重复顺序，在4个不同类型的 DMD/BMD家系中均发现了有诊断意义的基因缺陷。家系分析也表明，如果要更准确地判断致病染色体的来源及突变发生的确切阶段，一定要得到尽可能多的患者亲属的临床资料及DNA标本，以分析DMD发病的共性与特点[7]。
本实验使用6%～8%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，在6个STR位点分别测出3～7个等位片段，片段大小与文献报告的范围有重叠，但不尽一致。例如文献报告STR 50位点片段范围在233～251 bp，而本组报告的 范围为212～246 bp，这可能由于中国汉族与其他人种之间的种族差异所致。本实验采用北京航空航天大学编辑的凝胶电泳图象分析软件标记在凝胶电泳中分型的 DNA片段，避免了手工测量的误差，提高了测量的精确性。由于未进行序列分析，所测片段大小不能精确到单个碱基。
, http://www.100md.com
实验还表明，我们所使用的短串联重复顺序具有高度的多态性，并且遵循Mendel定律遗传给后代，是家系中一种明显的遗传标记。运用多态性片段连锁分析方法可以区分患者、携带者和正常后代的单体型，阐明染色体的父母来源，为遗传咨询提供帮助。在高风险家族，如果已知先证者的单体型，可进行携带者妊娠的产前诊断。由于这些STR位点具有高度的多态性并可进行多位点分析，可以识别基因内重组并能在几乎所有DMD/BMD家系提供所需的诊断信息，从而显示了本方法在携带者诊断、产前诊断及遗传咨询方面良好的应用前景[8]。
志谢 本研究工作曾得到协和医科大学基础医学院医学遗传学室黄尚志教授和李辉技师的热情指导与大力协助
基金项目：本课题受国家自然科学基金资助(39370258)
参考文献
1，Chamberlain JS, Gibbs RA,Ranier JE, et al. Multiplex PCR for the diagnosis of Duchenne muscular dystrophy. In: Innis MA, Gelfand DH, Sninsky JJ, et al.eds. PCR protocols: a guide to methods and applications. New york : Academic Press, 1990. 272-281.
, 百拇医药
2，Clemens PR, Fenwick RG, Chamberlain JS, et al. Carrier detection and prenatal diagnosis in Duchenne and Becker muscular dystrophy families, using dinucleotide epeat polymorphisms. Am J Hum Genet, 1991, 49: 951-960.
3，Feener CA, Boyce FM, Kunkel LM. Rapid detection of CA polymorphisms in cloned DNA: application to the 5′ region of the dystrophin gene. Am J Hum Genet, 1991,48:621-627.
4，Oudet C, Heilig R, Mandel JL. An informative polymorphism detectable by polymerase chain reaction at the 3′ end of the dystrophin gene. Hum Genet, 1990, 84:283-285.
, http://www.100md.com
5，黄尚志，李辉.垂直电泳槽凝胶水平灌制法. 中华医学遗传学杂志， 1995，12：179.
6，Bunyan DJ, Robinson DO, Collins AL, et al. Germline and somatic mosaicism in a female carrier of Duchenne muscular dystrophy. Hum Genet, 1994, 93:541-544.
7，Zatz M, Sumita D, Campiotto S, et al. Paternal inheritance or different mutations in maternally related patients occur in about 3% of Duchenne familial cases. Am J Med Genet ,1998, 78: 361-365.
8，Dincer P, Topaloglu H, Ayter S. DNA diagnostic teste in Xp21 dystrophy families for prenatal diagnosis. Turk J Pediatri, 1998, 40:347-355.
(收稿日期：1999-07-21), 百拇医药