CD+4自然杀伤T细胞在慢性乙型肝炎病毒感染中的作用
作者：姜荣龙 卢桥生 侯金林 郭亚兵 骆抗先 富宁
单位：姜荣龙 卢桥生 侯金林 郭亚兵 骆抗先(广州，第一军医大学南方医院感染内科 510515)；富宁(免疫学教研室)
关键词：肝炎，乙型；，慢性；自然杀伤细胞
中华内科杂志000807 【摘要】 目的 了解CD+4、CD+8自然杀伤(NK)T细胞在慢性HBV感染者外周血中的分布情况，并对其细胞毒性进行分析，阐明其在慢性HBV感染中的作用。方法 常规分离外周血单个核细胞(PBMCs)， 用重组人白细胞介素-12/2 (rhIL-12/IL-2)诱导14 d， 以鼠抗人CD4 单克隆抗体(mAb)或抗人CD8 mAb与抗人CD56mAb分别标记细胞样品，流式细胞术(FCM)分析，CD+4 CD+56同时阳性的细胞，即为CD+4NK-T细胞；CD+8 CD+56同时阳性的细胞为CD+8NK-T细胞，因此获得CD+4、CD+8 NK-T细胞的百分比。并对细胞样品同时进行细胞毒性试验；分别以鼠抗人CD4 mAb、抗人CD8 mAb及抗人CD56mAb和新鲜兔血清处理细胞，以鉴定CD+3 CD+4NK-T、CD+3CD+8 NK-T细胞的细胞毒活性。结果 rhIL-12/IL-2诱导后，慢性HBV感染者外周血CD+4NK-T细胞的含量远低于正常对照组。CD+4NK-T细胞的比例(%)在正常对照组、慢性乙型肝炎(CH)组和慢性无症状携带者(AsC)组分别为18.10±4.20，6.95±2.85和1.50±1.30，经方差分析证实3组之间差异具有显著性(P<0.05)；CD+8NK-T细胞的比例(%)在正常对照组、CH组及AsC组分别为2.70±1.10, 2.20±1.40和3.10±0.70, 经方差分析显示3组之间无统计学差异(P>0.05)。51Cr释放试验证实，体外针对Raji细胞的细胞毒性试验显示，AsC组的细胞毒活性明显低于正常对照组和CH组(P<0.05)；经相应单克隆抗体、兔血清阻断处理后证实具有细胞毒性作用的效应主要为CD+4NK-T细胞。结论 慢性HBV感染者细胞免疫功能低下，可能与其CD+4NK-T细胞数量的不足相关。
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Clinical significance of peripheral blood CD+4 natural killer T cells in chronic hepatitis B virus infection
JIANG Ronglong LU Qiaosheng HOU Jinlin et al
(Department of Infectious Diseases, Nanfang Hospital, The First Military Medical University, Guangzhou 510515, China)
【Abstract】 Objective To demonstrate the clinical significance of CD+4 /CD+8 natural killer T (NK-T) cells in chronic hepatitis B virus (HBV) infection, we investigated the proportion and cytotoxicity of CD+4 /CD+8 NK-T in the peripheral blood of chronic HBV infected individuals. Methods Peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) from chronic HBV infected individuals were separated routinely and stimulated with recombinant human interleukin-12/2 (rhIL-12/IL-2) for 14 days, the percentage of CD+4 NK-T cells in peripheral blood was analyzed with fluorescence activated cell sorter (FACS). The cytotoxicity of peripheral blood lymphocytes (PBLs) was tested with a 4 h 51 Cr release assay. Results After IL-12/IL-2 induction, the percentage of CD+4 NK-T cells was 18.10±4.20, 6.95±2.85 and 1.50±1.30 in the healthy controls, chronic hepatitis(CH) patients and asymptomatic carriers (AsC) respectively. The percentage of CD+4 NK-T cells in the peripheral blood of chronic HBV infected individuals was lower than that in the healthy controls. Statistic analysis suggested there was significant difference among the three groups (P<0.05). The percentage of CD+8 NK-T cells was 2.70±1.10, 2.20±1.40和3.10±0.70 respectively in the three groups and there was no significant difference among them(P>0.05). In vitro cytotoxicity assays against Raji cells revealed that the cytotoxicity of PBLs in the healthy control group was more potent than that in CH and AsC group (P<0.05). Cytotoxicity of PBLs in AsC group was significantly lower in comparison with CH and healthy control groups. The cytotoxicity of CD+4 NK-T cells against Raji cells was abolished by treating PBLs with either mouse anti-CD4 antibody or anti-CD56 antibody and complement, and partially depleted by anti-CD8 antibody. Conclusions The abnormal cellular immune function in chronic HBV infected individuals may be associated with deficiency of CD+4 NK-T cells.
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【Key words】 Hepatitis B，Chronic； Natural killer cells
CD+4T辅助细胞(Th)在针对细胞内病毒、细菌及寄生虫等病原的免疫反应中起着重要的作用。基于其分泌细胞因子谱的不同，Th细胞至少可分为Th0、Th1、Th2 3个亚群[1-3]。Th1细胞在启动抵御病毒的免疫反应，并对细胞毒活性CD+8T淋巴细胞提供辅助过程中扮演着极其重要的角色[4]。然而，除了其免疫调节特性外，近年研究显示, Th1细胞作为效应细胞具有免疫病理作用。Th1细胞克隆在传染性疾病中可引起病原的清除及组织的损伤[5,6]。自慢性HBV感染者活检肝组织中分离的病毒特异性Th细胞克隆同时显示Th1细胞因子谱及溶细胞活性，既表达自然杀伤(NK)细胞的表面标志CD56，又与细胞毒性T淋巴细胞(CTL)拥有共同的表位，因而CD+4CD+56 Th细胞具有杀伤活性。国外已将CD+3 CD+56T细胞命名为自然杀伤T细胞(NK-T细胞)[7], 为探明CD+4 NK-T细胞在慢性HBV感染中的作用，我们采用流式细胞术对慢性HBV感染者外周血CD+4NK-T、CD+8NK-T细胞的分布情况进行分析，并对细胞样品进行51Cr细胞毒性试验，以鉴定其细胞毒性。
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对象与方法
一、对象
本研究所选病例为我院1999年5～9月门诊及住院病人。按照1995年全国传染病与寄生虫病学术会议修订的《病毒性肝炎防治方案(试行)》的临床肝炎诊断标准，选择36例慢性HBV感染者，分为两组，慢性HBV携带者(AsC)18例，经肝组织活检证实的慢性乙型病毒性肝炎(CH)18例，均为中度，正常对照组12例，取自门诊健康体检者。48例受检者中女14例，男34例，年龄17～42岁(平均32.4岁)；36例慢性HBV感染者均为HBsAg阳性(ELISA)，27例HBeAg阳性，9例抗-HBe阳性；正常对照组除5例抗-HBs阳性外，其余对照者HBV血清标志物全部阴性。所有受检者抗-HCV阴性(第二代试剂盒，EIA)。
二、方法
1.荧光激活细胞分类器(FACS)分析CD+4 NK-T、CD+8NK-T细胞的分布情况：取新鲜肝素抗凝全血4 ml，常规Ficoll-Isopaque密度梯度离心分离外周血单个核细胞(PBMCs)，并重悬于含10%小牛血清的RPMI 1640培养液中，采用塑料培养瓶37℃培养2 h，移去贴壁的单核细胞。2×106/ml非贴壁细胞继续以20 U/ml重组人白细胞介素-12(rhIL-12)及100 U/ml rhIL-2(Bender Medsystems, Austria)刺激培养14 d，收集细胞，离心，去上清；以含0.5%牛血清白蛋白(BSA)的磷酸缓冲液(PBS)洗涤1次，离心，去上清；加入FITC标记鼠抗人CD4单克隆抗体(mAb)或CD8 mAb、PE标记CD56 mAb [Coulter Beckman Co, USA]45 min, 室温避光，以含0.5% BSA PBS洗涤1次，离心，去上清，加1 ml PBS混匀细胞，作流式细胞检测，获得CD+4 NK-T和CD+8 NK-T细胞的百分率。所有病例均同步设一鼠抗人IgG(PE、FITC)细胞样品作为对照。
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2.阻断试验: 以鼠抗人CD4 mAb、CD8 mAb、CD56 mAb 分别处理细胞样品，4℃孵育45 min，尔后以新鲜兔血清37℃温育45 min，以去除相应的CD+4或CD+8或CD+56细胞。之后将处理过的细胞样品作为效应细胞进行细胞毒性试验。
3.细胞毒性试验: 靶细胞为Raji细胞，对NK细胞有抗性，引自中国科学院上海细胞生物研究所。将Raji细胞悬浮于含10%小牛血清的RPMI 1640中，并以3 700kBq Na2(51Cr)O4标记，置37℃含5%CO2的孵箱温育60 min, 反应后洗涤3次，计数，用培养液调浓度为5×107/ml细胞悬液。按常规行细胞毒试验。靶细胞104/孔，按不同的效-靶比例，与效应细胞共同孵育，37℃，4 h。 之后收集上清，用γ计数器计数。细胞毒性以实验组计数/ min(cpm)减去自然释放cpm占最大释放cpm减去自然释放cpm的百分比计算。自然释放cpm小于最大释放cpm的15%。
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三、统计学处理
3组间比较采用方差分析，数据以
±s表示。
结果
一、慢性HBV感染者外周血CD+4 NK-T 及CD+8NK-T细胞的分布情况
rhIL-2/IL-12诱导前，实验组与对照组外周血CD+4NK-T细胞的比例(%)为1.15±0.65, CD+8NK-T细胞(%)为1.60±0.70; 经rhIL-2/IL-12诱导后，慢性HBV感染者外周血CD+4NK-T细胞的百分比远低于正常对照组(图1)。CD+4NK-T细胞的比例(%)在正常对照组、CH组及AsC组分别为18.10±4.10，6.95±2.85和1.50±1.30，经方差分析证实3组之间
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细胞样品经rIL-12 /rIL-2诱导14 d后, 分别以CD4 mAb (FITC) 、CD8 mAb (FITC)与CD56 mAb (PE)染色，室温30 min， 洗涤后以流式细胞术分析； CD+4CD+56 细胞为CD+4 NK-T细胞， CD+8CD+56 细胞为CD+8 NK-T细胞 a： 细胞同步以鼠IgG (FITC, PE)标记作为内参照； b： 正常对照组; c： 慢性肝炎组；d： 慢性HBV携带组
图1 正常对照及实验组外周血CD+4 NK-T (A) 、CD+8 NK-T (B) 细胞的FACS分析
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差异具有显著性(P<0.05)。CD+8NK-T细胞的比例(%)在正常对照组、CH组及AsC组分别为2.70±1.10, 2.20±1.40和3.10±0.70, 经方差分析证实3组之间并无统计学差异(P>0.05)。正常对照组的CD+4NK-T细胞的百分比明显高于AsC组和CH组(P<0.05)。
二、阻断试验结果
以鼠抗人CD4 mAb、CD8mAb、CD56mAb及新鲜兔血清分别处理正常对照组的细胞样品，之后进行细胞毒活性检测。为鉴定所用单抗的可靠性，对其中1例经上述处理后的细胞样品分别以CD4mAb(FITC)/CD56mAb(PE)、CD8mAb(FITC)/CD56mAb(PE)、CD3 mAb(FITC)/CD56mAb(PE)标记，之后以流式细胞术(FCM)分析， CD+4NK-T细胞(%)分别为0.7、16.9和1.1；CD+8NK-T细胞(%)分别为2.9、0.5和0.8；CD-3CD+56NK细胞(%)分别为13.7、16.5和0.5，结果显示，细胞样品经鼠抗人CD4mAb、CD8mAb、CD56mAb及兔血清处理后，可去除相应的CD+4或CD+8或CD+56。细胞毒性试验结果发现：当细胞样品以CD4mAb或CD56mAb及新鲜兔血清处理后，其细胞毒活性完全消失；而用CD8mAb及新鲜兔血清处理后，对其细胞毒活性没有影响(表1)。结果证实经IL-12/IL-2诱导后正常对照组的细胞样品中具有细胞毒活性的效应细胞主要为CD+4NK-T细胞。
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表1 CD+4NK-T细胞作为细胞毒性细胞的鉴定(±s) 处理方式
不同效靶比时的细胞毒性(%)
5∶1
10∶1
20∶1
补体
45.8±7.4
71.2±10.1
84.2±8.7
CD4mAb+补体
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<1
<1
2.1±0.7
CD56mAb+补体
<1
<1
2.5±0.2
CD8mAb+补体
41.1±2.9
65.5±2.4
78.8±1.8
注：Raji细胞作为靶细胞
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三、细胞毒活性试验结果
缺失单核细胞的外周血淋巴细胞(PBL)以含10%FCS、20 U/ml rhIL-12及或100 U/ml rhIL-2的RPMI 1640培养基培养14 d，以诱导CD+4NK-T细胞的扩增。经rhIL-12/IL-2协同诱导后，体外针对Raji细胞的细胞毒性试验显示正常对照组较CH组和AsC组有更强的细胞毒活性(P<0.05)；见图2。 AsC组的细胞毒性明显低于CH组和正常对照组(P<0.05)，细胞毒性试验经重复后结果相似。
经rhIL-12/IL-2诱导后的PBLs 作为效应细胞。 靶细胞Raji为NK抗性细胞。 靶细胞以3 700kBq Na251CrO4 37℃标记60 min, 洗涤后按常规行细胞毒性试验。 标记后的靶细胞与效应细胞按不同的效靶比例混匀后置96孔圆底培养板孵育4 h, 收集上清，用γ计数器计数。细胞毒性以实验组cpm减去自然释放cpm占最大释放cpm减去自然释放cpm的百分比计算
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图2 各实验组外周血经IL-2/IL-12诱导后PBLs针对Raji 细胞的细胞毒性试验
讨论
长期以来，人们普遍认为HBV感染的慢性化主要是机体细胞免疫功能低下所致，但其机制并未完全阐明。Barnaba等的研究结果表明，在正常人及慢性肝炎病人的外周血几乎没有CD+4CD+56的T细胞。在慢性活动性乙型肝炎病人，具有分泌Th1细胞因子的细胞毒性CD+4T细胞隔室化于肝内，这些细胞表达CD+56分子，肝内炎性环境的抗原刺激可促进这些细胞的扩增，并认为CD+4CD+56T细胞在慢性HBV感染中具有病理效应。Franco等[8]在转基因小鼠模型也证实CD+4 Th1细胞具有病理效应功能。Satoh等[9]的研究认为，联合应用rhIL-12/IL-2，并在CD3 mAb存在下，在正常人外周血淋巴细胞中可诱导出CD+8CD+56α β T细胞的扩增；而仅应用rhIL-12/IL-2则可诱导出CD+4CD+56α β T细胞的扩增。结果显示，在某种条件下， rhIL-12与 IL-2协同诱导具有人CD56抗原的潜在细胞毒性T细胞，提示在人体肝脏的这些细胞与鼠肝脏的NK1+α β T细胞具有功能的相似性。但是有关慢性HBV感染者外周血经rhIL-2/IL-12诱导后，CD+4NK-T细胞的研究则未见报道。本研究结果提示：慢性HBV感染者外周血经rhIL-2/IL-12诱导后，CD+4NK-T细胞的含量仍然远低于正常对照组。其细胞毒活性明显低于正常对照组；而CD+8NK-T细胞的百分含量在本实验3组之间并无统计学差异。提示在慢性HBV感染中细胞免疫功能的低下，可能与其CD+4NK-T细胞数量的不足有一定关系。
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参考文献
1，Mosmann TR，Coffman RL. Th1 and Th2 cells: different patterns of lymphokine secretion lead to different functional properties. Annu Rev Immunol, 1989,7:145-173.
2，Yssel H, De Waal Malefyt R, Roncarolo MG, et al. IL-10 is produced by subsets of human CD4+ T cell clones and peripheral blood T cells. J Immunol, 1992,149:2378-384.
3，Firestein GS, Roeder WD, Laxer JA, et al. A new murine CD4+ T cell subsets with an unrestricted cytokine profile. J Immunol, 1988,143:518-525.
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4，Vitiello A, Ishioka G, Grey HM, et al. Development of a lipopeptide-based therapeutic vaccine to treat chronic HBV infection. I. Induction of a primary cytotoxic T lymphocyte response in humans. J Clin Invest,1995,95:341-349.
5，Katz JD, Benoist C, Mathis D. T helper cell subsets in insulin-dependent diabetes. Science, 1995, 268:1185-1188.
6，Barnaba V, Franco A, Paroli M, et al. Selective expansion of cytotoxic T lymphocytes with a CD4+CD56+ surface phenotype and a T helper type 1 profile of cytokine secretion in the liver of patients chronically infected with hepatitis B virus. J Immunol, 1994,152:3074-3087.
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7，Doherty DG, Norris S, Madrigal-Estebas L, et al. The human liver contains multiple populations of NK cells, T cells, and CD3+CD56+ natural T cells with distinct cytotoxic activities and Th1, Th2, and Th0 cytokine secretion patterns. J Immunol, 1999, 163:2314-2321.
8，Franco A, Guidotti LG, Hobbs MV, et al. Pathogenetic effector function of CD4-positive T helper 1 cells hepatitis B virus transgenic mice. J Immunol, 1997,159:2001-2008.
9，Satoh M, Seki S, Hashimoto W, et al. Cytotoxic gamma delta or alpha beta T cells with a natural killer cell marker, CD56, induced from human peripheral blood lymphocytes by a combination of IL-12 and IL-2. J Immunol, 1996,157:3886-3892.
(收稿日期：1999-09-05), 百拇医药
单位：姜荣龙 卢桥生 侯金林 郭亚兵 骆抗先(广州，第一军医大学南方医院感染内科 510515)；富宁(免疫学教研室)
关键词：肝炎，乙型；，慢性；自然杀伤细胞
中华内科杂志000807 【摘要】 目的 了解CD+4、CD+8自然杀伤(NK)T细胞在慢性HBV感染者外周血中的分布情况，并对其细胞毒性进行分析，阐明其在慢性HBV感染中的作用。方法 常规分离外周血单个核细胞(PBMCs)， 用重组人白细胞介素-12/2 (rhIL-12/IL-2)诱导14 d， 以鼠抗人CD4 单克隆抗体(mAb)或抗人CD8 mAb与抗人CD56mAb分别标记细胞样品，流式细胞术(FCM)分析，CD+4 CD+56同时阳性的细胞，即为CD+4NK-T细胞；CD+8 CD+56同时阳性的细胞为CD+8NK-T细胞，因此获得CD+4、CD+8 NK-T细胞的百分比。并对细胞样品同时进行细胞毒性试验；分别以鼠抗人CD4 mAb、抗人CD8 mAb及抗人CD56mAb和新鲜兔血清处理细胞，以鉴定CD+3 CD+4NK-T、CD+3CD+8 NK-T细胞的细胞毒活性。结果 rhIL-12/IL-2诱导后，慢性HBV感染者外周血CD+4NK-T细胞的含量远低于正常对照组。CD+4NK-T细胞的比例(%)在正常对照组、慢性乙型肝炎(CH)组和慢性无症状携带者(AsC)组分别为18.10±4.20，6.95±2.85和1.50±1.30，经方差分析证实3组之间差异具有显著性(P<0.05)；CD+8NK-T细胞的比例(%)在正常对照组、CH组及AsC组分别为2.70±1.10, 2.20±1.40和3.10±0.70, 经方差分析显示3组之间无统计学差异(P>0.05)。51Cr释放试验证实，体外针对Raji细胞的细胞毒性试验显示，AsC组的细胞毒活性明显低于正常对照组和CH组(P<0.05)；经相应单克隆抗体、兔血清阻断处理后证实具有细胞毒性作用的效应主要为CD+4NK-T细胞。结论 慢性HBV感染者细胞免疫功能低下，可能与其CD+4NK-T细胞数量的不足相关。
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JIANG Ronglong LU Qiaosheng HOU Jinlin et al
(Department of Infectious Diseases, Nanfang Hospital, The First Military Medical University, Guangzhou 510515, China)
【Abstract】 Objective To demonstrate the clinical significance of CD+4 /CD+8 natural killer T (NK-T) cells in chronic hepatitis B virus (HBV) infection, we investigated the proportion and cytotoxicity of CD+4 /CD+8 NK-T in the peripheral blood of chronic HBV infected individuals. Methods Peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) from chronic HBV infected individuals were separated routinely and stimulated with recombinant human interleukin-12/2 (rhIL-12/IL-2) for 14 days, the percentage of CD+4 NK-T cells in peripheral blood was analyzed with fluorescence activated cell sorter (FACS). The cytotoxicity of peripheral blood lymphocytes (PBLs) was tested with a 4 h 51 Cr release assay. Results After IL-12/IL-2 induction, the percentage of CD+4 NK-T cells was 18.10±4.20, 6.95±2.85 and 1.50±1.30 in the healthy controls, chronic hepatitis(CH) patients and asymptomatic carriers (AsC) respectively. The percentage of CD+4 NK-T cells in the peripheral blood of chronic HBV infected individuals was lower than that in the healthy controls. Statistic analysis suggested there was significant difference among the three groups (P<0.05). The percentage of CD+8 NK-T cells was 2.70±1.10, 2.20±1.40和3.10±0.70 respectively in the three groups and there was no significant difference among them(P>0.05). In vitro cytotoxicity assays against Raji cells revealed that the cytotoxicity of PBLs in the healthy control group was more potent than that in CH and AsC group (P<0.05). Cytotoxicity of PBLs in AsC group was significantly lower in comparison with CH and healthy control groups. The cytotoxicity of CD+4 NK-T cells against Raji cells was abolished by treating PBLs with either mouse anti-CD4 antibody or anti-CD56 antibody and complement, and partially depleted by anti-CD8 antibody. Conclusions The abnormal cellular immune function in chronic HBV infected individuals may be associated with deficiency of CD+4 NK-T cells.
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【Key words】 Hepatitis B，Chronic； Natural killer cells
CD+4T辅助细胞(Th)在针对细胞内病毒、细菌及寄生虫等病原的免疫反应中起着重要的作用。基于其分泌细胞因子谱的不同，Th细胞至少可分为Th0、Th1、Th2 3个亚群[1-3]。Th1细胞在启动抵御病毒的免疫反应，并对细胞毒活性CD+8T淋巴细胞提供辅助过程中扮演着极其重要的角色[4]。然而，除了其免疫调节特性外，近年研究显示, Th1细胞作为效应细胞具有免疫病理作用。Th1细胞克隆在传染性疾病中可引起病原的清除及组织的损伤[5,6]。自慢性HBV感染者活检肝组织中分离的病毒特异性Th细胞克隆同时显示Th1细胞因子谱及溶细胞活性，既表达自然杀伤(NK)细胞的表面标志CD56，又与细胞毒性T淋巴细胞(CTL)拥有共同的表位，因而CD+4CD+56 Th细胞具有杀伤活性。国外已将CD+3 CD+56T细胞命名为自然杀伤T细胞(NK-T细胞)[7], 为探明CD+4 NK-T细胞在慢性HBV感染中的作用，我们采用流式细胞术对慢性HBV感染者外周血CD+4NK-T、CD+8NK-T细胞的分布情况进行分析，并对细胞样品进行51Cr细胞毒性试验，以鉴定其细胞毒性。
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一、对象
本研究所选病例为我院1999年5～9月门诊及住院病人。按照1995年全国传染病与寄生虫病学术会议修订的《病毒性肝炎防治方案(试行)》的临床肝炎诊断标准，选择36例慢性HBV感染者，分为两组，慢性HBV携带者(AsC)18例，经肝组织活检证实的慢性乙型病毒性肝炎(CH)18例，均为中度，正常对照组12例，取自门诊健康体检者。48例受检者中女14例，男34例，年龄17～42岁(平均32.4岁)；36例慢性HBV感染者均为HBsAg阳性(ELISA)，27例HBeAg阳性，9例抗-HBe阳性；正常对照组除5例抗-HBs阳性外，其余对照者HBV血清标志物全部阴性。所有受检者抗-HCV阴性(第二代试剂盒，EIA)。
二、方法
1.荧光激活细胞分类器(FACS)分析CD+4 NK-T、CD+8NK-T细胞的分布情况：取新鲜肝素抗凝全血4 ml，常规Ficoll-Isopaque密度梯度离心分离外周血单个核细胞(PBMCs)，并重悬于含10%小牛血清的RPMI 1640培养液中，采用塑料培养瓶37℃培养2 h，移去贴壁的单核细胞。2×106/ml非贴壁细胞继续以20 U/ml重组人白细胞介素-12(rhIL-12)及100 U/ml rhIL-2(Bender Medsystems, Austria)刺激培养14 d，收集细胞，离心，去上清；以含0.5%牛血清白蛋白(BSA)的磷酸缓冲液(PBS)洗涤1次，离心，去上清；加入FITC标记鼠抗人CD4单克隆抗体(mAb)或CD8 mAb、PE标记CD56 mAb [Coulter Beckman Co, USA]45 min, 室温避光，以含0.5% BSA PBS洗涤1次，离心，去上清，加1 ml PBS混匀细胞，作流式细胞检测，获得CD+4 NK-T和CD+8 NK-T细胞的百分率。所有病例均同步设一鼠抗人IgG(PE、FITC)细胞样品作为对照。
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2.阻断试验: 以鼠抗人CD4 mAb、CD8 mAb、CD56 mAb 分别处理细胞样品，4℃孵育45 min，尔后以新鲜兔血清37℃温育45 min，以去除相应的CD+4或CD+8或CD+56细胞。之后将处理过的细胞样品作为效应细胞进行细胞毒性试验。
3.细胞毒性试验: 靶细胞为Raji细胞，对NK细胞有抗性，引自中国科学院上海细胞生物研究所。将Raji细胞悬浮于含10%小牛血清的RPMI 1640中，并以3 700kBq Na2(51Cr)O4标记，置37℃含5%CO2的孵箱温育60 min, 反应后洗涤3次，计数，用培养液调浓度为5×107/ml细胞悬液。按常规行细胞毒试验。靶细胞104/孔，按不同的效-靶比例，与效应细胞共同孵育，37℃，4 h。 之后收集上清，用γ计数器计数。细胞毒性以实验组计数/ min(cpm)减去自然释放cpm占最大释放cpm减去自然释放cpm的百分比计算。自然释放cpm小于最大释放cpm的15%。
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三、统计学处理
3组间比较采用方差分析，数据以
±s表示。结果
一、慢性HBV感染者外周血CD+4 NK-T 及CD+8NK-T细胞的分布情况
rhIL-2/IL-12诱导前，实验组与对照组外周血CD+4NK-T细胞的比例(%)为1.15±0.65, CD+8NK-T细胞(%)为1.60±0.70; 经rhIL-2/IL-12诱导后，慢性HBV感染者外周血CD+4NK-T细胞的百分比远低于正常对照组(图1)。CD+4NK-T细胞的比例(%)在正常对照组、CH组及AsC组分别为18.10±4.10，6.95±2.85和1.50±1.30，经方差分析证实3组之间
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细胞样品经rIL-12 /rIL-2诱导14 d后, 分别以CD4 mAb (FITC) 、CD8 mAb (FITC)与CD56 mAb (PE)染色，室温30 min， 洗涤后以流式细胞术分析； CD+4CD+56 细胞为CD+4 NK-T细胞， CD+8CD+56 细胞为CD+8 NK-T细胞 a： 细胞同步以鼠IgG (FITC, PE)标记作为内参照； b： 正常对照组; c： 慢性肝炎组；d： 慢性HBV携带组
图1 正常对照及实验组外周血CD+4 NK-T (A) 、CD+8 NK-T (B) 细胞的FACS分析
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差异具有显著性(P<0.05)。CD+8NK-T细胞的比例(%)在正常对照组、CH组及AsC组分别为2.70±1.10, 2.20±1.40和3.10±0.70, 经方差分析证实3组之间并无统计学差异(P>0.05)。正常对照组的CD+4NK-T细胞的百分比明显高于AsC组和CH组(P<0.05)。
二、阻断试验结果
以鼠抗人CD4 mAb、CD8mAb、CD56mAb及新鲜兔血清分别处理正常对照组的细胞样品，之后进行细胞毒活性检测。为鉴定所用单抗的可靠性，对其中1例经上述处理后的细胞样品分别以CD4mAb(FITC)/CD56mAb(PE)、CD8mAb(FITC)/CD56mAb(PE)、CD3 mAb(FITC)/CD56mAb(PE)标记，之后以流式细胞术(FCM)分析， CD+4NK-T细胞(%)分别为0.7、16.9和1.1；CD+8NK-T细胞(%)分别为2.9、0.5和0.8；CD-3CD+56NK细胞(%)分别为13.7、16.5和0.5，结果显示，细胞样品经鼠抗人CD4mAb、CD8mAb、CD56mAb及兔血清处理后，可去除相应的CD+4或CD+8或CD+56。细胞毒性试验结果发现：当细胞样品以CD4mAb或CD56mAb及新鲜兔血清处理后，其细胞毒活性完全消失；而用CD8mAb及新鲜兔血清处理后，对其细胞毒活性没有影响(表1)。结果证实经IL-12/IL-2诱导后正常对照组的细胞样品中具有细胞毒活性的效应细胞主要为CD+4NK-T细胞。
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表1 CD+4NK-T细胞作为细胞毒性细胞的鉴定(
±s) 处理方式不同效靶比时的细胞毒性(%)
5∶1
10∶1
20∶1
补体
45.8±7.4
71.2±10.1
84.2±8.7
CD4mAb+补体
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<1
<1
2.1±0.7
CD56mAb+补体
<1
<1
2.5±0.2
CD8mAb+补体
41.1±2.9
65.5±2.4
78.8±1.8
注：Raji细胞作为靶细胞
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三、细胞毒活性试验结果
缺失单核细胞的外周血淋巴细胞(PBL)以含10%FCS、20 U/ml rhIL-12及或100 U/ml rhIL-2的RPMI 1640培养基培养14 d，以诱导CD+4NK-T细胞的扩增。经rhIL-12/IL-2协同诱导后，体外针对Raji细胞的细胞毒性试验显示正常对照组较CH组和AsC组有更强的细胞毒活性(P<0.05)；见图2。 AsC组的细胞毒性明显低于CH组和正常对照组(P<0.05)，细胞毒性试验经重复后结果相似。
经rhIL-12/IL-2诱导后的PBLs 作为效应细胞。 靶细胞Raji为NK抗性细胞。 靶细胞以3 700kBq Na251CrO4 37℃标记60 min, 洗涤后按常规行细胞毒性试验。 标记后的靶细胞与效应细胞按不同的效靶比例混匀后置96孔圆底培养板孵育4 h, 收集上清，用γ计数器计数。细胞毒性以实验组cpm减去自然释放cpm占最大释放cpm减去自然释放cpm的百分比计算
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图2 各实验组外周血经IL-2/IL-12诱导后PBLs针对Raji 细胞的细胞毒性试验
讨论
长期以来，人们普遍认为HBV感染的慢性化主要是机体细胞免疫功能低下所致，但其机制并未完全阐明。Barnaba等的研究结果表明，在正常人及慢性肝炎病人的外周血几乎没有CD+4CD+56的T细胞。在慢性活动性乙型肝炎病人，具有分泌Th1细胞因子的细胞毒性CD+4T细胞隔室化于肝内，这些细胞表达CD+56分子，肝内炎性环境的抗原刺激可促进这些细胞的扩增，并认为CD+4CD+56T细胞在慢性HBV感染中具有病理效应。Franco等[8]在转基因小鼠模型也证实CD+4 Th1细胞具有病理效应功能。Satoh等[9]的研究认为，联合应用rhIL-12/IL-2，并在CD3 mAb存在下，在正常人外周血淋巴细胞中可诱导出CD+8CD+56α β T细胞的扩增；而仅应用rhIL-12/IL-2则可诱导出CD+4CD+56α β T细胞的扩增。结果显示，在某种条件下， rhIL-12与 IL-2协同诱导具有人CD56抗原的潜在细胞毒性T细胞，提示在人体肝脏的这些细胞与鼠肝脏的NK1+α β T细胞具有功能的相似性。但是有关慢性HBV感染者外周血经rhIL-2/IL-12诱导后，CD+4NK-T细胞的研究则未见报道。本研究结果提示：慢性HBV感染者外周血经rhIL-2/IL-12诱导后，CD+4NK-T细胞的含量仍然远低于正常对照组。其细胞毒活性明显低于正常对照组；而CD+8NK-T细胞的百分含量在本实验3组之间并无统计学差异。提示在慢性HBV感染中细胞免疫功能的低下，可能与其CD+4NK-T细胞数量的不足有一定关系。
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参考文献
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9，Satoh M, Seki S, Hashimoto W, et al. Cytotoxic gamma delta or alpha beta T cells with a natural killer cell marker, CD56, induced from human peripheral blood lymphocytes by a combination of IL-12 and IL-2. J Immunol, 1996,157:3886-3892.
(收稿日期：1999-09-05), 百拇医药