血清幽门螺杆菌可溶性抗原检测的临床意义
作者：吴勤动 钱可大 朱永良 唐训球 杜勤 孙丽萍
单位：吴勤动 钱可大 朱永良 唐训球 杜勤(杭州， 浙江大学医学院附属第二医院消化内科 310009)；孙丽萍(病理科)
关键词：螺杆菌，幽门；抗原；血清学
中华内科杂志000805 【摘要】 目的 探索一种新的不受血清抗体回忆反应影响的血清学幽门螺杆菌(Hp)检测方法。方法 采用生物素-亲和素酶联免疫法测定血清Hp可溶性抗原，判断患者Hp感染状况，并与快速尿素酶试验、组织切片染色、血清Hp抗体3种检测方法进行比较，对该方法的可靠性进行评估。结果血清Hp可溶性抗原(Hp SAg)检测诊断敏感性为93.02%，特异性为87.88%，阳性预测值为90.91%，阴性预测值为90.63%。 103例慢性胃炎、消化性溃疡及其他消化道疾病接受胃镜检查患者Hp检测结果显示，血清Hp SAg检测阳性率与非血清学Hp检测方法结果基本一致( P>0.05)。结论 Hp SAg 检测作为一种新的血清学Hp检测方法，具有检测快速、经济、准确、便于大规模普查等优点，且不受抗体回忆反应影响，结果稳定、特异性高，可用于Hp的临床诊断、根除疗效观察和随访复查等，也适合于儿童及孕妇检测。
, http://www.100md.com
A newly developed method for detecting serum Helicobacter pylori soluble antigen and its clinical significance
WU Qindong QIAN Keda ZHU Yongliang et al
(Department of Gastroenterology, Second Affiliated Hospital of Medical College, Zhejiang University, Hangzhou 310009, China)
【Abstract】 Objective To explore a new serological method for detecting Helicobacter pylori(Hp) infection which cannot be affected by memorizing reaction of serum Hp antibody after eradication. Methods Serum soluble antigen of Hp was detected by using avidin-biotin ELISA technique to evaluate the status of Hp infection and to compare with rapid urease test(RUT), histologic examination and serology. Results The sensitivity, specificity, positive predictive value and negative predictive value were 93.02%, 87.88%, 90.91% and 90.63% respectively. The prevalence rate of serum Hp soluble antigen in 103 patients undergoing endoscopy was similar either with serological or non-serological methods (P>0.05). Conclusion The detection of serum Hp soluble antigen could be used as a new serological method which is accurate, convenient, not being affected by memorizing reaction of serum antibody, more sensitive, more specific and suitable for clinical diagnosis, evaluation of eradication and follow-up of Hp as well as for detection in children and pregnant women.
, 百拇医药
【Key words】 Helicobacter pylori; Antigen; Serology
幽门螺杆菌(Hp)自1983年由Marshall和Warren发现以来，已寻找出多种诊断检测方法。由于目前认为Hp是慢性胃炎的主要病因[1]、消化性溃疡的重要发病因素[2]、胃癌的高危致癌因子[3]，因此探索更迅速、准确、方便、经济的诊断方法显得极其重要。传统检测的侵入性方法包括胃黏膜细菌培养法、快速尿素酶试验(RUT)、组织切片染色、PCR检测等，由于需依赖胃镜检查完成，常使Hp复查受阻。非侵入性方法中血清Hp抗体检查对患者新近或既往感染较难鉴别，14C-尿素呼气试验由于仍有少量放射活性，应用于儿童及孕妇受到限制。我们建立及应用血清Hp可溶性抗原检测法诊断患者Hp感染状况，并与其他3种检测方法进行比较，该方法目前未见国内外文献报道，现将研究结果报告如下。
对象和方法
, 百拇医药
1.病例选择：收集1998年10月～1999年4月因上消化道症状来本院进行胃镜检查的慢性胃病患者103例，年龄23～69岁，平均年龄(45.1±11.6)岁。男61例，女42例，诊断均经电子胃镜及病理学检查确诊，对胃部手术、胃肿瘤、上消化道大量出血患者不列入研究范围。
2.胃镜取材：每例胃镜受检者在胃窦部距幽门孔5 cm以内区域取3～4块胃黏膜组织，分别进行RUT和病理学检查。
3 RUT：采用福建三强生物制品公司生产的Hp RUT试剂盒。
4.组织学检查：胃黏膜活检标本置10%甲醛液固定，切片采用美蓝染色，Hp分级按Marshall和Warren[4]所报告的分级方法。
5.血清Hp可溶性抗原(Hp SAg)和Hp IgG抗体检测：患者于胃镜检查结束后抽取肘静脉血10 ml，常温下分离血清。Hp SAg检测实验方法：(1) 取10 μg/ml亲和素(美国Sigma公司产品)包被微孔4℃过夜，洗涤3次，10%小牛血清封闭37℃ 30 min。(2) 样本1∶100稀释后，每孔50 μl，同时各孔再加入生物素(美国Sigma公司产品)化兔抗可溶性Hp抗体50 μl(1∶25)，混匀1 min ，37℃ 2 h，洗涤3次。(3) 加入Hp抗原-辣根过氧化物酶(Hp-HRP)1∶20，100 μl/孔， 37℃ 2 h ，洗涤3次。(4)加入四甲基联苯胺，100 μl/孔，室温避光反应30 min ，加入50 μl 1.8 mol H2SO4终止反应，以λ=450 nm测各孔吸光度值(A)。(5)结果判断：检测结果大于正常人对照
+2s以上者为阳性。Hp IgG抗体(Hp Ab)检测方法按常规ELISA方法进行。
, 百拇医药
6.统计学处理：样本率比较采用χ2检验。
结果
1.血清Hp SAg检测的诊断敏感性和特异性：Hp阳性对照组选自43例RUT和组织美蓝染色2项试验均为阳性的患者，Hp阴性对照组选自33例上述2项试验均为阴性的患者。结果显示：血清Hp SAg 检测法诊断敏感性为93.02%，特异性为87.88%，阳性预测值为90.91%，阴性预测值为90.63%。
2.血清Hp SAg检测法诊断阳性率：103例因慢性胃炎、消化性溃疡及其他消化道疾病接受胃镜检查的患者，其Hp感染检测结果显示血清Hp SAg检测阳性率(52.43%)与RUT(57.28%)和美蓝染色(54.37%)2种检测方法的结果基本一致(P>0.05)，Hp Ab检测阳性率(70.87%)明显高于其他3种方法(P<0.05)，表明Hp Ab检测因对患者新近或既往感染均呈阳性反应，较高阳性率判断时应排除部分假阳性患者，才能提高诊断正确率。
, 百拇医药
3.血清Hp SAg和Hp Ab检测比较：Hp阳性和阴性对照组设置标准同上，结果显示：血清Hp SAg 检测诊断敏感性为 93.02% ，特异性为87.88%，Hp Ab检测的诊断敏感性为100%，诊断特异性为60.61%，表明Hp SAg检测诊断的特异性明显优于Hp Ab检测方法。
讨论
目前Hp检测方法主要分为侵入性和非侵入性检测方法两类，前者需依赖胃镜检查下进行，反复受检较为困难，此外，Hp在胃黏膜呈灶性分布，活检可能出现假阴性。后者无需在胃镜检查下进行，无创伤，易为患者所接受。13C-UBT和15N-尿氨排出试验无放射性，准确性好，但由于检测仪器质谱仪价格昂贵，目前尚未能普遍开展。14C-UBT检测仪器相对便宜、准确性尚好，但由于仍有少量放射活性，儿童及孕妇不宜，应用受到限制。传统血清学Hp抗体检测由于Hp感染后体内高滴度抗体在Hp被根除后因回忆反应仍可维持6～12个月后才下降[5] ，因而虽然可诊断Hp感染，但难以区别患者近期或既往胃黏膜Hp感染，独立判断Hp感染较为困难。
, 百拇医药
Hp在侵入、定植胃黏膜后可释放一些可溶性抗原物质进入血中，这些可溶性抗原物质多来源于菌体外膜蛋白，包括尿素酶、蛋白酶、脂多糖、细胞毒素、中性粒细胞活化蛋白、热休克蛋白等[6]，分子量在80 000～550 000之间。上述可溶性抗原除部分被特异性抗体中和形成抗原抗体复合物排出体外，大部分以游离状态存在于血循环中。一般认为可溶性抗原物质较易诱发免疫耐受性，定植胃黏膜的Hp释放入血的可溶性抗原物质，可能因抗原剂量小，机体产生免疫耐受性[7]，导致机体免疫应答缺失或减弱，致使可溶性Hp抗原不能被机体特异性免疫抗体中和清除而脱逸至周围血中。这种由Hp菌体外膜蛋白脱落形成的可溶性Hp抗原，血中浓度的维持必须依赖于胃黏膜上Hp持续感染和不断繁殖。一旦Hp被根除，其释放可溶性抗原物质即可停止或迅速减少。因此，检测血中Hp可溶性抗原可反映患者胃黏膜是否存在Hp现时感染以及治疗后Hp是否被根除，从而对抗Hp药物疗效作出正确的评价，也适合流行病学调查和抗Hp治疗后随访等。该血清学Hp抗原检测的新方法操作简便、经济、敏感性高、易推广，同时又避免了血清Hp抗体因产生回忆反应而特异性低等缺点，并且由于无放射性，是一种更理想的非侵入性Hp检测方法。
, 百拇医药
本组结果显示血清Hp SAg检测的诊断敏感性为93.02%，诊断特异性为87.88%，与UBT检测方法的报道基本一致[8]。本组研究结果还显示，血清学Hp抗体检测方法因抗体回忆反应，Hp感染检测阳性率显著高于其他3种检测方法，因而结果可靠性并不理想，而Hp SAg检测Hp感染阳性率与RUT和组织美蓝染色2种方法结果基本一致，其结果稳定可靠，可以与目前认为非侵入性Hp诊断方法金标准[9]的13C、14C-UBT相媲美。
参考文献
1，江绍基.消化性溃疡治疗的沿革.中华消化杂志, 1994,14:245-249.
2，Miehlke S, Bayerdorffer E, Lehn N, et al. Severity of Helicobacter pylori gastritis predicts duodenal ulcer recurrence. Scand J Gastroentero1, 1996,31:856-862.
, 百拇医药
3，Forman D. Helicobacter pylori and gastric cancer. Scand J Gastroenterol Suppl, 1996,220:23-26.
4，Marshall BJ, Warren JR. Unidentified curved baccili in the stomach of patients with gastritis and peptic ulceration. Lancet， 1984,l:1311-1315.
5，吴勤动,钱可大,朱永良,等. 幽门螺杆菌抗体体内消长趋势探讨.中华内科杂志, 1993,33:12.
6，胡伏莲,周殿元,贾博琦,主编. 幽门螺杆菌感染的基础与临床.北京: 中国科学技术出版社,1997.320-338.
7，余传霖, 叶天星,陆德源,主编. 现代医学免疫学.上海:上海医科大学出版社, 1998.349-350.
, http://www.100md.com
8，Kalach N, Briet F, Raymond J, et a1. The 13 carbon urea breath test for the noninvasive detection of Helicobacter pylori in children: comparison with culture and determination of minimum analysis requirements. J Pediatr GastroenteroI Nutr, 1998,26:291-296.
9，Feldman RA, Evans SJ. Accuracy of diagnostic method used for epidemiological studies of Helicobacter pylori. Aliment PharmacoI Ther, 1995, 9 Suppl 2:21-31.
(收稿日期：1999-12-02), 百拇医药
单位：吴勤动 钱可大 朱永良 唐训球 杜勤(杭州， 浙江大学医学院附属第二医院消化内科 310009)；孙丽萍(病理科)
关键词：螺杆菌，幽门；抗原；血清学
中华内科杂志000805 【摘要】 目的 探索一种新的不受血清抗体回忆反应影响的血清学幽门螺杆菌(Hp)检测方法。方法 采用生物素-亲和素酶联免疫法测定血清Hp可溶性抗原，判断患者Hp感染状况，并与快速尿素酶试验、组织切片染色、血清Hp抗体3种检测方法进行比较，对该方法的可靠性进行评估。结果血清Hp可溶性抗原(Hp SAg)检测诊断敏感性为93.02%，特异性为87.88%，阳性预测值为90.91%，阴性预测值为90.63%。 103例慢性胃炎、消化性溃疡及其他消化道疾病接受胃镜检查患者Hp检测结果显示，血清Hp SAg检测阳性率与非血清学Hp检测方法结果基本一致( P>0.05)。结论 Hp SAg 检测作为一种新的血清学Hp检测方法，具有检测快速、经济、准确、便于大规模普查等优点，且不受抗体回忆反应影响，结果稳定、特异性高，可用于Hp的临床诊断、根除疗效观察和随访复查等，也适合于儿童及孕妇检测。
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A newly developed method for detecting serum Helicobacter pylori soluble antigen and its clinical significance
WU Qindong QIAN Keda ZHU Yongliang et al
(Department of Gastroenterology, Second Affiliated Hospital of Medical College, Zhejiang University, Hangzhou 310009, China)
【Abstract】 Objective To explore a new serological method for detecting Helicobacter pylori(Hp) infection which cannot be affected by memorizing reaction of serum Hp antibody after eradication. Methods Serum soluble antigen of Hp was detected by using avidin-biotin ELISA technique to evaluate the status of Hp infection and to compare with rapid urease test(RUT), histologic examination and serology. Results The sensitivity, specificity, positive predictive value and negative predictive value were 93.02%, 87.88%, 90.91% and 90.63% respectively. The prevalence rate of serum Hp soluble antigen in 103 patients undergoing endoscopy was similar either with serological or non-serological methods (P>0.05). Conclusion The detection of serum Hp soluble antigen could be used as a new serological method which is accurate, convenient, not being affected by memorizing reaction of serum antibody, more sensitive, more specific and suitable for clinical diagnosis, evaluation of eradication and follow-up of Hp as well as for detection in children and pregnant women.
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【Key words】 Helicobacter pylori; Antigen; Serology
幽门螺杆菌(Hp)自1983年由Marshall和Warren发现以来，已寻找出多种诊断检测方法。由于目前认为Hp是慢性胃炎的主要病因[1]、消化性溃疡的重要发病因素[2]、胃癌的高危致癌因子[3]，因此探索更迅速、准确、方便、经济的诊断方法显得极其重要。传统检测的侵入性方法包括胃黏膜细菌培养法、快速尿素酶试验(RUT)、组织切片染色、PCR检测等，由于需依赖胃镜检查完成，常使Hp复查受阻。非侵入性方法中血清Hp抗体检查对患者新近或既往感染较难鉴别，14C-尿素呼气试验由于仍有少量放射活性，应用于儿童及孕妇受到限制。我们建立及应用血清Hp可溶性抗原检测法诊断患者Hp感染状况，并与其他3种检测方法进行比较，该方法目前未见国内外文献报道，现将研究结果报告如下。
对象和方法
, 百拇医药
1.病例选择：收集1998年10月～1999年4月因上消化道症状来本院进行胃镜检查的慢性胃病患者103例，年龄23～69岁，平均年龄(45.1±11.6)岁。男61例，女42例，诊断均经电子胃镜及病理学检查确诊，对胃部手术、胃肿瘤、上消化道大量出血患者不列入研究范围。
2.胃镜取材：每例胃镜受检者在胃窦部距幽门孔5 cm以内区域取3～4块胃黏膜组织，分别进行RUT和病理学检查。
3 RUT：采用福建三强生物制品公司生产的Hp RUT试剂盒。
4.组织学检查：胃黏膜活检标本置10%甲醛液固定，切片采用美蓝染色，Hp分级按Marshall和Warren[4]所报告的分级方法。
5.血清Hp可溶性抗原(Hp SAg)和Hp IgG抗体检测：患者于胃镜检查结束后抽取肘静脉血10 ml，常温下分离血清。Hp SAg检测实验方法：(1) 取10 μg/ml亲和素(美国Sigma公司产品)包被微孔4℃过夜，洗涤3次，10%小牛血清封闭37℃ 30 min。(2) 样本1∶100稀释后，每孔50 μl，同时各孔再加入生物素(美国Sigma公司产品)化兔抗可溶性Hp抗体50 μl(1∶25)，混匀1 min ，37℃ 2 h，洗涤3次。(3) 加入Hp抗原-辣根过氧化物酶(Hp-HRP)1∶20，100 μl/孔， 37℃ 2 h ，洗涤3次。(4)加入四甲基联苯胺，100 μl/孔，室温避光反应30 min ，加入50 μl 1.8 mol H2SO4终止反应，以λ=450 nm测各孔吸光度值(A)。(5)结果判断：检测结果大于正常人对照
+2s以上者为阳性。Hp IgG抗体(Hp Ab)检测方法按常规ELISA方法进行。, 百拇医药
6.统计学处理：样本率比较采用χ2检验。
结果
1.血清Hp SAg检测的诊断敏感性和特异性：Hp阳性对照组选自43例RUT和组织美蓝染色2项试验均为阳性的患者，Hp阴性对照组选自33例上述2项试验均为阴性的患者。结果显示：血清Hp SAg 检测法诊断敏感性为93.02%，特异性为87.88%，阳性预测值为90.91%，阴性预测值为90.63%。
2.血清Hp SAg检测法诊断阳性率：103例因慢性胃炎、消化性溃疡及其他消化道疾病接受胃镜检查的患者，其Hp感染检测结果显示血清Hp SAg检测阳性率(52.43%)与RUT(57.28%)和美蓝染色(54.37%)2种检测方法的结果基本一致(P>0.05)，Hp Ab检测阳性率(70.87%)明显高于其他3种方法(P<0.05)，表明Hp Ab检测因对患者新近或既往感染均呈阳性反应，较高阳性率判断时应排除部分假阳性患者，才能提高诊断正确率。
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3.血清Hp SAg和Hp Ab检测比较：Hp阳性和阴性对照组设置标准同上，结果显示：血清Hp SAg 检测诊断敏感性为 93.02% ，特异性为87.88%，Hp Ab检测的诊断敏感性为100%，诊断特异性为60.61%，表明Hp SAg检测诊断的特异性明显优于Hp Ab检测方法。
讨论
目前Hp检测方法主要分为侵入性和非侵入性检测方法两类，前者需依赖胃镜检查下进行，反复受检较为困难，此外，Hp在胃黏膜呈灶性分布，活检可能出现假阴性。后者无需在胃镜检查下进行，无创伤，易为患者所接受。13C-UBT和15N-尿氨排出试验无放射性，准确性好，但由于检测仪器质谱仪价格昂贵，目前尚未能普遍开展。14C-UBT检测仪器相对便宜、准确性尚好，但由于仍有少量放射活性，儿童及孕妇不宜，应用受到限制。传统血清学Hp抗体检测由于Hp感染后体内高滴度抗体在Hp被根除后因回忆反应仍可维持6～12个月后才下降[5] ，因而虽然可诊断Hp感染，但难以区别患者近期或既往胃黏膜Hp感染，独立判断Hp感染较为困难。
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Hp在侵入、定植胃黏膜后可释放一些可溶性抗原物质进入血中，这些可溶性抗原物质多来源于菌体外膜蛋白，包括尿素酶、蛋白酶、脂多糖、细胞毒素、中性粒细胞活化蛋白、热休克蛋白等[6]，分子量在80 000～550 000之间。上述可溶性抗原除部分被特异性抗体中和形成抗原抗体复合物排出体外，大部分以游离状态存在于血循环中。一般认为可溶性抗原物质较易诱发免疫耐受性，定植胃黏膜的Hp释放入血的可溶性抗原物质，可能因抗原剂量小，机体产生免疫耐受性[7]，导致机体免疫应答缺失或减弱，致使可溶性Hp抗原不能被机体特异性免疫抗体中和清除而脱逸至周围血中。这种由Hp菌体外膜蛋白脱落形成的可溶性Hp抗原，血中浓度的维持必须依赖于胃黏膜上Hp持续感染和不断繁殖。一旦Hp被根除，其释放可溶性抗原物质即可停止或迅速减少。因此，检测血中Hp可溶性抗原可反映患者胃黏膜是否存在Hp现时感染以及治疗后Hp是否被根除，从而对抗Hp药物疗效作出正确的评价，也适合流行病学调查和抗Hp治疗后随访等。该血清学Hp抗原检测的新方法操作简便、经济、敏感性高、易推广，同时又避免了血清Hp抗体因产生回忆反应而特异性低等缺点，并且由于无放射性，是一种更理想的非侵入性Hp检测方法。
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本组结果显示血清Hp SAg检测的诊断敏感性为93.02%，诊断特异性为87.88%，与UBT检测方法的报道基本一致[8]。本组研究结果还显示，血清学Hp抗体检测方法因抗体回忆反应，Hp感染检测阳性率显著高于其他3种检测方法，因而结果可靠性并不理想，而Hp SAg检测Hp感染阳性率与RUT和组织美蓝染色2种方法结果基本一致，其结果稳定可靠，可以与目前认为非侵入性Hp诊断方法金标准[9]的13C、14C-UBT相媲美。
参考文献
1，江绍基.消化性溃疡治疗的沿革.中华消化杂志, 1994,14:245-249.
2，Miehlke S, Bayerdorffer E, Lehn N, et al. Severity of Helicobacter pylori gastritis predicts duodenal ulcer recurrence. Scand J Gastroentero1, 1996,31:856-862.
, 百拇医药
3，Forman D. Helicobacter pylori and gastric cancer. Scand J Gastroenterol Suppl, 1996,220:23-26.
4，Marshall BJ, Warren JR. Unidentified curved baccili in the stomach of patients with gastritis and peptic ulceration. Lancet， 1984,l:1311-1315.
5，吴勤动,钱可大,朱永良,等. 幽门螺杆菌抗体体内消长趋势探讨.中华内科杂志, 1993,33:12.
6，胡伏莲,周殿元,贾博琦,主编. 幽门螺杆菌感染的基础与临床.北京: 中国科学技术出版社,1997.320-338.
7，余传霖, 叶天星,陆德源,主编. 现代医学免疫学.上海:上海医科大学出版社, 1998.349-350.
, http://www.100md.com
8，Kalach N, Briet F, Raymond J, et a1. The 13 carbon urea breath test for the noninvasive detection of Helicobacter pylori in children: comparison with culture and determination of minimum analysis requirements. J Pediatr GastroenteroI Nutr, 1998,26:291-296.
9，Feldman RA, Evans SJ. Accuracy of diagnostic method used for epidemiological studies of Helicobacter pylori. Aliment PharmacoI Ther, 1995, 9 Suppl 2:21-31.
(收稿日期：1999-12-02), 百拇医药