正常人血清中乙型肝炎病毒相关抗体与其DNA间关系的研究
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中华内科杂志 2000年第9期第39卷
作者：何晋德 仝文斌 邹磊 杜绍财
单位：何晋德 邹磊(100044 北京医科大学人民医院消化科)；仝文斌 杜绍财(肝病研究所)
关键词：
中华内科杂志000916 近几年人们对HBV相关抗体，尤其是抗-HBs的意义有了新的认识，发现抗-HBs(+)慢性肝病患者体内有HBV存在和复制。正常人HBV相关抗体阳性血清中是否也有HBV存在和复制仍不十分清楚，探讨它对进一步控制HBV的传播、理解输血后乙型肝炎的发生以及器官移植等方面可能有重要意义。另外，本研究采用ELISA对基因扩增产物进行了量化研究。
一、资料与方法
1.血清标本选择：入选血清要求HBsAg(-) 、HBeAg(-)、肝功能正常、无肝炎病史、HBV抗体阳性的自然感染者和HBV疫苗接种者，分组见表1。 HBV血清学检测均用酶标法，HBsAg、抗-HBs、HBeAg、抗-HBe的检测采用Boehringer Mannheim产试剂，抗-HBc IgG的检测采用军事医学科学院产试剂。检测抗-HBc IgM的试剂购于解放军第302医院。
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表1 血清学指标及其检测结果 分组
抗-
HBs
抗-
HBe
抗-HBc
IgG
例数
DNA(+)
例数(%)
平均A值
自然感染者A
+
, 百拇医药
+
+
58
3(5.2)*
0.274±0.155
B
+
-
+
53
5(9.4)*
0.316±0.186
, 百拇医药 C
-
-
+
23
4(17.4)*
0.302±0.072
疫苗接种者
+
-
-
57
0
, 百拇医药
-
正常对照
-
-
-
45
0
-
注：抗-HBc IgM均为阴性；*A、B组间及B、C组间比较，P>0.25；A、C组间比较，P<0.10
2.引物及探针：外引物和内引物的序列同文献[1]，HBV-C1的5′末端用生物素标记，探针序列为5′-CTGACTACT-AATTCCCTGGATGCTGGGTCT-3′， 5′末端用荧光素标记，其与北京医科大学肝病研究所产试剂盒序列相同。
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3.HBV DNA的检测： (1)套式PCR：①HBV裂解：5 μl血清加15 μl裂解液(1%NP40)，混匀，依次65℃ 20 min、90℃10 min和95℃10 min裂解。②套式PCR扩增：与文献[1]基本相同，所不同的是内、外引物各0.25 μl (1 g/L)，Taq-DNA聚合酶2U，单次PCR产物取5 μl，单次及套式PCR循环次数分别为N1及N2(ELISA对PCR产物的定量有赖于对“平台期”的确定，故PCR必须在“平台期”前终止反应，因此套式PCR需要确立N1和N2)。(2)ELISA检测扩增产物：酶标板制备参照文献[2]进行，将链酶亲和素包被于酶标孔中。将1∶20(体积比)稀释后的套式PCR产物100 μl加入酶标孔中(样品稀释液为0.01mol/L 磷酸盐缓冲液、pH7.4，含10 g/L BSA、0.5%吐温-20)，37℃ 反应45 min后洗板6次(洗液为10 mmol/L Tris-HCl、pH7.5，0.05%吐温-20)；加入150 mmol/L NaOH 100 μl室温反应10 min，洗板6次；加入25 nmol/L探针100 μl(杂交液含50%甲酰胺，5×SSC，1×FPG，25 mmol/L KH2PO4、pH7.0，2 g/L SDS，50 g/L 硫酸葡聚糖)，37℃ 反应45 min后洗板6次；加入50U/L HRP标记的抗- fluorescein标记抗体100 μl(酶稀释液含100 mmol/L Tris-HCl、pH7.5，150 mmol/L NaCl，10 g/L BSA)，37℃ 反应15 min后洗板6次；TMB显色，测定450 nm下的吸光度(A)值。
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4.统计学处理： t检验。
二、结果
1.“平台期”确定： 选择10-4稀释度阳性血清，见表2。根据其A值，循环次数选定N1＝27、N2＝21。
表2 不同N1和N2相组合的检测结果(A) N1＼N2
15
18
21
24
27
, 百拇医药
30
15′
0.087
0.098
0.097
0.126
0.294
0.52
18′
0.090
0.145
0.153
0.211
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0.457
0.802
21′
0.106
0.164
0.267
0.428
0.713
0.887
24′
0.145
0.199
0.365
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0.492
0.972
1.057
27′
0.146
0.209
0.442
0.568
0.976
1.117
30′
0.176
0.356
, 百拇医药
0.462
0.685
1.113
1.148
2.敏感度：将HBeAg强阳性血清(约含HBV DNA 24 μg/L)连续10倍稀释，检测结果见表3，并与电泳对照。
3.入选标本检测结果：见表1。
讨论 近年来对微量HBV的检测主要采用PCR技术，但主要是定性研究。本实验对PCR产物采用ELISA法检测，可以对核酸起定量作用。从表3的敏感度实验发现，较低HBV浓度(<10-3)其吸光度与病毒含量显现了明显的线性关系。传统观点认为，HBV感染后抗-HBs的出现是HBV被宿主清除的保护性标志，此时的血清没有传染性。但近年的文献报道抗-HBs可以单独[3,4]或(和)HBsAg同时[5]存在于与HBV感染相关的慢性肝病患者血清中，这些患者体内可以有HBV存在和复制。据此有人认为自然感染者血清中任何HBV抗体的出现都提示可能有HBV的存在和复制。
, 百拇医药
本实验结果显示，自然感染者 A、B、C 组中检出HBV DNA的阳性率分别为5.2%、9.4%、17.4%；抗-HBs(+)自然感染者血清中HBV DNA(+)为7.2%。近年文献报道20%的输血后肝炎是HBV感染所致[6]；抗-HBs(+)供体的肝脏移植给受体后发生了乙型肝炎[7] 。尽管自然感染者A组中抗-HBe(+)，但其HBV DNA的阳性率却比B、C组低，且病毒含量似乎更低(表1)，但统计学处理显示差异无显著性。
本研究结果提示：正常人HBV相关抗体阳性自然感染者血清中可能有HBV DNA存在，但其病毒量较低。
表3 实验敏感度 稀释度
100
10-1
, 百拇医药
10-2
10-3
10-4
10-5
10-6
10-7
10-8
10-9
10-10
A值
0.635
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0.702
0.798
0.957
0.702
0.489
0.342
0.313
0.085
0.050
0.063
电泳
+
+
, 百拇医药
+
+
+
+
+
+
-
-
-
注：+为阳性，-为阴性
基金项目：卫生部优秀青年基金项目(96-1-293)
参考文献
1，何晋德,吴晶新,杜绍财,等.套式及免疫套式聚合酶链反应检测乙型肝炎表面抗原阴性肝病患者血清中乙型肝炎病毒DNA. 中华内科杂志，1996，35:537-541.
, 百拇医药
2，仝文斌,张春英,费然,等. 酶免疫法检测丙型肝炎病毒RNA的聚合酶链反应产物.中华医学检验杂志，1998，21:88-91.
3，Kaneko S, Miller RH, Feinstone SM, et al. Detection of serum hepatitis B virus DNA in patients with chronic hepatitis using the polymerase chain reaction assay. Proc Natl Acad Sci U S A，1989，86:312-316.
4，Liang TJ, Baruch Y, Ben-Porath E, et al. Hepatitis B virus infection in patients with idiopathic liver disease. Hepatology， 1991，13:1044-1051.
, 百拇医药
5，Yamamoto K, Horikita M, Tsuda F, et al. Naturally occurring escape mutants of hepatitis B virus with various mutations in the S gene in carriers seropositive for antibody to hepatitis B surface antigen. J Virol ，1994，68:2671-2676.
6，Rasenack JW, Schlayer HJ, Hettler F, et al. Hepatitis B virus infection without immunological markers after open-heart surgery. Lancet ，1995，345:355-357.
7，Lowell JA, Howard TK, White HM, et al. Serological evidence of past hepatitis B infection in liver donor and hepatitis B infection in liver allograft. Lancet， 1995，345:1084-1085.
(收稿日期：1999-10-14), 百拇医药
单位：何晋德 邹磊(100044 北京医科大学人民医院消化科)；仝文斌 杜绍财(肝病研究所)
关键词：
中华内科杂志000916 近几年人们对HBV相关抗体，尤其是抗-HBs的意义有了新的认识，发现抗-HBs(+)慢性肝病患者体内有HBV存在和复制。正常人HBV相关抗体阳性血清中是否也有HBV存在和复制仍不十分清楚，探讨它对进一步控制HBV的传播、理解输血后乙型肝炎的发生以及器官移植等方面可能有重要意义。另外，本研究采用ELISA对基因扩增产物进行了量化研究。
一、资料与方法
1.血清标本选择：入选血清要求HBsAg(-) 、HBeAg(-)、肝功能正常、无肝炎病史、HBV抗体阳性的自然感染者和HBV疫苗接种者，分组见表1。 HBV血清学检测均用酶标法，HBsAg、抗-HBs、HBeAg、抗-HBe的检测采用Boehringer Mannheim产试剂，抗-HBc IgG的检测采用军事医学科学院产试剂。检测抗-HBc IgM的试剂购于解放军第302医院。
, http://www.100md.com
表1 血清学指标及其检测结果 分组
抗-
HBs
抗-
HBe
抗-HBc
IgG
例数
DNA(+)
例数(%)
平均A值
自然感染者A
+
, 百拇医药
+
+
58
3(5.2)*
0.274±0.155
B
+
-
+
53
5(9.4)*
0.316±0.186
, 百拇医药 C
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23
4(17.4)*
0.302±0.072
疫苗接种者
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正常对照
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45
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注：抗-HBc IgM均为阴性；*A、B组间及B、C组间比较，P>0.25；A、C组间比较，P<0.10
2.引物及探针：外引物和内引物的序列同文献[1]，HBV-C1的5′末端用生物素标记，探针序列为5′-CTGACTACT-AATTCCCTGGATGCTGGGTCT-3′， 5′末端用荧光素标记，其与北京医科大学肝病研究所产试剂盒序列相同。
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3.HBV DNA的检测： (1)套式PCR：①HBV裂解：5 μl血清加15 μl裂解液(1%NP40)，混匀，依次65℃ 20 min、90℃10 min和95℃10 min裂解。②套式PCR扩增：与文献[1]基本相同，所不同的是内、外引物各0.25 μl (1 g/L)，Taq-DNA聚合酶2U，单次PCR产物取5 μl，单次及套式PCR循环次数分别为N1及N2(ELISA对PCR产物的定量有赖于对“平台期”的确定，故PCR必须在“平台期”前终止反应，因此套式PCR需要确立N1和N2)。(2)ELISA检测扩增产物：酶标板制备参照文献[2]进行，将链酶亲和素包被于酶标孔中。将1∶20(体积比)稀释后的套式PCR产物100 μl加入酶标孔中(样品稀释液为0.01mol/L 磷酸盐缓冲液、pH7.4，含10 g/L BSA、0.5%吐温-20)，37℃ 反应45 min后洗板6次(洗液为10 mmol/L Tris-HCl、pH7.5，0.05%吐温-20)；加入150 mmol/L NaOH 100 μl室温反应10 min，洗板6次；加入25 nmol/L探针100 μl(杂交液含50%甲酰胺，5×SSC，1×FPG，25 mmol/L KH2PO4、pH7.0，2 g/L SDS，50 g/L 硫酸葡聚糖)，37℃ 反应45 min后洗板6次；加入50U/L HRP标记的抗- fluorescein标记抗体100 μl(酶稀释液含100 mmol/L Tris-HCl、pH7.5，150 mmol/L NaCl，10 g/L BSA)，37℃ 反应15 min后洗板6次；TMB显色，测定450 nm下的吸光度(A)值。
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4.统计学处理： t检验。
二、结果
1.“平台期”确定： 选择10-4稀释度阳性血清，见表2。根据其A值，循环次数选定N1＝27、N2＝21。
表2 不同N1和N2相组合的检测结果(A) N1＼N2
15
18
21
24
27
, 百拇医药
30
15′
0.087
0.098
0.097
0.126
0.294
0.52
18′
0.090
0.145
0.153
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0.802
21′
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0.428
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0.887
24′
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0.146
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1.117
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0.176
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0.462
0.685
1.113
1.148
2.敏感度：将HBeAg强阳性血清(约含HBV DNA 24 μg/L)连续10倍稀释，检测结果见表3，并与电泳对照。
3.入选标本检测结果：见表1。
讨论 近年来对微量HBV的检测主要采用PCR技术，但主要是定性研究。本实验对PCR产物采用ELISA法检测，可以对核酸起定量作用。从表3的敏感度实验发现，较低HBV浓度(<10-3)其吸光度与病毒含量显现了明显的线性关系。传统观点认为，HBV感染后抗-HBs的出现是HBV被宿主清除的保护性标志，此时的血清没有传染性。但近年的文献报道抗-HBs可以单独[3,4]或(和)HBsAg同时[5]存在于与HBV感染相关的慢性肝病患者血清中，这些患者体内可以有HBV存在和复制。据此有人认为自然感染者血清中任何HBV抗体的出现都提示可能有HBV的存在和复制。
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本实验结果显示，自然感染者 A、B、C 组中检出HBV DNA的阳性率分别为5.2%、9.4%、17.4%；抗-HBs(+)自然感染者血清中HBV DNA(+)为7.2%。近年文献报道20%的输血后肝炎是HBV感染所致[6]；抗-HBs(+)供体的肝脏移植给受体后发生了乙型肝炎[7] 。尽管自然感染者A组中抗-HBe(+)，但其HBV DNA的阳性率却比B、C组低，且病毒含量似乎更低(表1)，但统计学处理显示差异无显著性。
本研究结果提示：正常人HBV相关抗体阳性自然感染者血清中可能有HBV DNA存在，但其病毒量较低。
表3 实验敏感度 稀释度
100
10-1
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A值
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0.702
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电泳
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注：+为阳性，-为阴性
基金项目：卫生部优秀青年基金项目(96-1-293)
参考文献
1，何晋德,吴晶新,杜绍财,等.套式及免疫套式聚合酶链反应检测乙型肝炎表面抗原阴性肝病患者血清中乙型肝炎病毒DNA. 中华内科杂志，1996，35:537-541.
, 百拇医药
2，仝文斌,张春英,费然,等. 酶免疫法检测丙型肝炎病毒RNA的聚合酶链反应产物.中华医学检验杂志，1998，21:88-91.
3，Kaneko S, Miller RH, Feinstone SM, et al. Detection of serum hepatitis B virus DNA in patients with chronic hepatitis using the polymerase chain reaction assay. Proc Natl Acad Sci U S A，1989，86:312-316.
4，Liang TJ, Baruch Y, Ben-Porath E, et al. Hepatitis B virus infection in patients with idiopathic liver disease. Hepatology， 1991，13:1044-1051.
, 百拇医药
5，Yamamoto K, Horikita M, Tsuda F, et al. Naturally occurring escape mutants of hepatitis B virus with various mutations in the S gene in carriers seropositive for antibody to hepatitis B surface antigen. J Virol ，1994，68:2671-2676.
6，Rasenack JW, Schlayer HJ, Hettler F, et al. Hepatitis B virus infection without immunological markers after open-heart surgery. Lancet ，1995，345:355-357.
7，Lowell JA, Howard TK, White HM, et al. Serological evidence of past hepatitis B infection in liver donor and hepatitis B infection in liver allograft. Lancet， 1995，345:1084-1085.
(收稿日期：1999-10-14), 百拇医药