免疫功能受损宿主外周血单个核细胞端粒酶活性研究
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中华内科杂志 2000年第9期第39卷
作者：黄燕 范学工 张英健 周巧玲 唐发清 易红
单位：黄燕(410008 长沙, 湖南医科大学附属湘雅医院传染科)；范学工(410008 长沙, 湖南医科大学附属湘雅医院传染科)；张英健(内分泌科)；周巧玲(肾内科)；唐发清(中心实验室)易红(中心实验室)
关键词：淋巴细胞；单核细胞；白细胞介素12；端粒酶
中华内科杂志000910 【摘要】 目的 探讨免疫功能受损宿主外周血单个核细胞(PBMC)端粒酶活性的表达情况。 方法 采用PCR-ELISA法测定了17例健康者、14例慢性乙型肝炎、8例糖尿病和8例慢性肾功能衰竭患者的PBMC经植物血凝素(PHA)刺激前后端粒酶的活性水平，及重组人白细胞介素12(rhIL-12)对端粒酶活性的影响。 结果 (1)4组静息PBMC有低水平的端粒酶活性表达(A值分别为0.52±0.28、0.32±0.27、0.41±0.20及0.43±0.30)，经PHA刺激后活性明显升高(1.39±0.09、1.21±0.38、1.38±0.11及1.36±0.08)；(2)慢性乙型肝炎患者静息期PBMC端粒酶活性显著低于健康者，但PHA刺激后两者活性差异无显著性；(3)未能发现rhIL-12对端粒酶活性的影响。 结论 PBMC能表达端粒酶活性，慢性乙型肝炎患者的免疫功能缺损可能与其PBMC端粒酶活性下降有关。
, 百拇医药
Telomerase activity of peripheral blood mononuclear cells in patients with acquired immune dysfunction
HUANG Yan, FAN Xuegong, ZHANG Yingjian, et al.
Department of Infectious Diseases,The Affiliated Xiangya Hospital of Hunan Medical University, Changsha 410008, China
【Abstract】 Objective To investigate telomerase activity of peripheral blood mononuclear cells(PBMC) in patients with acquired immune dysfunction. Methods Telomerase activity of peripheral PBMC isolated from 4 groups including healthy subjects(17), chronic hepatitis B patients(14), diabetic patients(8) and chronic renal failure patients(8) was assayed with PCR-ELISA. Results (1) Telomerase activity was detectable at low levels in resting PBMC of all the 4 groups. It increased obviously after in vitro phytohemagglutinin (PHA) stimulation；(2) Telomerase activity of the resting PBMC in chronic hepatitis B patients was significantly lower than that in normal subjects, and was upregulated to the same level in the both groups after PHA stimulation；(3) No effect of recombinant human interleukin-12 on telomerase activity of activated T lymphocytes was found. ConclusionsPBMC may express telomerase activity and the decreased telomerase activity of PBMC in patients with chronic hepatitis B may partially be responsible for immune dysfunction in these patients.
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【Key words】 Lymphocytes; Monocytes; Interleukin-12; Telomerase
端粒是位于染色体末端对染色体的稳定起重要作用的DNA蛋白复合体，端粒的缩短能导致细胞的衰老和死亡[1]。端粒酶是一种核糖核蛋白，由RNA和蛋白质复合体组成，具有逆转录酶的活性，它能以自身的RNA为模板合成端粒。端粒酶主要存在于精原细胞、造血细胞、永生细胞及大部分肿瘤细胞，绝大多数体细胞的端粒酶均处于失活状态[2]。近年来的研究表明,外周血淋巴细胞有低水平的端粒酶活性表达[3]，而在进展性的人类免疫缺陷病毒(HIV)感染时，造血祖细胞的端粒酶活性下降、T细胞端粒缩短，提示患者的免疫系统提前进入了复制衰老，这可能与艾滋病患者最终的免疫功能缺损及继发各种机会性感染有关[4，5]。但这种现象是否在其他病毒性疾病中存在尚未见报道。白细胞介素(IL)-12主要是由单核巨噬细胞产生的活性较强的促活化型T细胞增殖的细胞因子。体外研究发现，IL-12可恢复艾滋病患者的T细胞功能，其主要机制是促进Th1细胞免疫应答[6]。IL-12能否调节T细胞端粒酶生物学行为还未见报道。某些慢性疾病，如慢性乙型肝炎、糖尿病、慢性肾功能衰竭的病人，由于获得性免疫功能受损，极易发生机会性感染，包括院内感染，一方面加重病情，同时也使原发病的治疗更加困难。上述患者是否有淋巴细胞端粒酶活性改变，IL-12能否通过调节T细胞端粒酶生物学行为来改善这些患者的免疫功能尚不清楚。本研究试图了解这些患者的淋巴细胞端粒酶活性水平，以及重组人IL-12 ( rhIL-12 ) 在体外对淋巴细胞端粒酶的影响。
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资料和方法
一、 研究对象
健康对照组17例，年龄12～56岁，平均33岁；慢性乙型肝炎患者14例(诊断符合1995 年 第五次全国传染病寄生虫病学术会议制定的诊断标准)，年龄15～42岁，平均34岁，其中慢性肝炎6例(中度3例，重度3例)，慢性重型肝炎8例；Ⅱ型糖尿病患者8例，年龄41～66岁，平均54岁；慢性肾功能衰竭患者8例，年龄22～43岁，平均35岁。
二、实验方法
1. 外周血单个核细胞(PBMC)培养：无菌取静脉血肝素抗凝，用淋巴细胞分离液(上海试剂二厂)离心，常规分离获得PBMC，Hank液洗涤细胞2次，计数。将细胞分3孔(3×106/孔)置于2ml RPMI 1640培养基中于24孔培养板培养，第一孔仅为PBMC；第二孔为PBMC+植物血凝素(PHA ，Sigma公司产品)，终浓度10mg/L；第三孔为PBMC+PHA+rhIL-12 (PharMingen)，终浓度500 ng/L。72h后收集细胞，锥虫蓝染色计数，取2×106个细胞，Hank液洗涤2次，4℃，3 000g离心10 min，弃上清，-80℃保存细胞。
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2.端粒酶活性检测：(1)检测原理： 端粒酶以其自身的RNA为模板合成端粒的重复序列加至生物素标记的引物上，产物行PCR扩增后与地高辛标记的探针杂交。杂交产物与酶标板结合，加入过氧化氢酶标记的抗地高辛抗体及过氧化氢酶的底物显色。根据吸光度的大小判定酶的活性。(2)检测方法：使用端粒酶PCR-ELISA试剂盒(Boehringer Mannheim 公司)，并按其提供的方法进行以下步骤：细胞提取物的准备：细胞经裂解后4℃，16 000g离心20 min，-80℃保存上清液备用。提取物可通过加热65℃、10 min使端粒酶失活作阴性对照，阳性对照为永生化的人胚肾细胞(293细胞株)提取物。在0.5 ml Eppendof管中依次加入25 μl反应混合液(含生物素标记的P1-TS引物、P2引物、Taq酶、dNTP等)、2 μl细胞提取液，加水至50 μl并以石蜡油封闭。将反应管置于DNA扩增仪(PE 480)中进行以下循环：25℃、30 min逆转录，95℃、5 min灭活端粒酶，94℃、30s→50℃、30s→72℃、90s循环30个周期，再72℃、10 min充分延伸。PCR产物变性后与地高辛标记的探针杂交，再在酶标标记板上与抗地高辛-过氧化物酶、TMB底物及反应终止液共同孵育后用ELISA计数器测定其在波长450 nm处的吸光度(A450，>0.2为阳性)，以此作PCR产物的定量分析。同时使用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)及银染法分析PCR产物，出现6个bp重复条带形成的梯形图为阳性。
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三、 统计学处理
数据以均数±标准差表示，采用配对t检验和方差分析。
结果
一、 健康人、乙型肝炎、糖尿病和慢性肾功能衰竭患者PBMC端粒酶活性的表达
PBMC端粒酶活性在PHA刺激前4组均较低，PHA刺激后则显著增高(P<0.001)。刺激前的端粒酶活性以健康人为最高，乙型肝炎患者最低，两者相比差异有显著性(P<0.05)，健康人与肾功能衰竭、糖尿病患者的PBMC端粒酶在活化前相比差异无显著性(P>0.05)，刺激后4组的端粒酶活性差异仍无显著性 (P>0.05，表1)。慢性重型乙型肝炎患者的端粒酶活性下降比较明显 ，而慢性乙型肝炎患者的端粒酶活性下降不明显 (表2)。阳性对照值：1.48，阴性对照值：0.00。实验结果行重复试验，重复性较好。电泳结果与酶标结果相符(图1)。
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表1 健康者与患者PBMC在PHA刺激前后端粒酶活性比较(A值，
±s) 组别
例数
PBMC
PBMC+PHA
健康者
17
0.52±0.28
1.39±0.09*
乙型肝炎
14
, 百拇医药 0.32±0.27△
1.21±0.38*
糖尿病
8
0.41±0.20
1.38±0.11*
慢性肾功能衰竭
8
0.43±0.30
1.36±0.08*
注：与健康者比较，△P<0.05；分别与刺激前相比，*P<0.001 表2 乙型肝炎患者PBMC端粒酶活性(A值，±s)
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例数
PBMC
PBMC+PHA
慢性乙型肝炎
6
0.51±0.29〓
1.19±0.38
慢性重型乙型肝炎
8
0.18±0.14*
1.22±0.04
注： 与慢性乙型肝炎相比，*P<0.05
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1～3：健康者标本；4～6：乙型肝炎患者标本；7：阳性对照； 8：阴性对照 1、4：PBMC； 2、5：PBMC+PHA； 3、6：PBMC+PHA+rhIL-12
图1 PHA及rhIL-12作用前后PBMC端粒酶变化的电泳图
二、 rhIL-12对PBMC端粒酶活性的影响
本研究测定了7例健康者、6例乙型肝炎患者、5例糖尿病患者和6例慢性肾功能衰竭患者的PBMC经PHA和rhIL-12作用后的端粒酶活性，并测定了2例健康者经不同浓度的rhIL-12(分别为50、150、250、500 ng/L)作用后的端粒酶活性，未能发现rhIL-12对PBMC端粒酶活性有调节作用(P>0.05，表3，4)。电泳结果与酶标结果相符(图1，2)。
表3 rhIL-12处理前后PBMC端粒酶活性的比较(A值，±s) 组别
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例数
PBMC
PBMC+PHA
PBMC+PHA+rhIL-12
健康者
7
0.40±0.31
1.37±0.06
1.40±0.07
乙型肝炎
6
0.14±0.13
, 百拇医药
1.36±0.07
1.38±0.11
糖尿病
5
0.38±0.19
1.37±0.13
1.33±0.11
慢性肾功能衰竭
6
0.47±0.34
1.34±0.08
1.42±0.09
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表4 不同浓度的rhIL-12对PBMC端粒酶活性的影响(A值，±s) 例号
PBMC
PBMC+PHA
PBMC+PHA+ rhIL-12
rhIL-12(ng/L)：
50
150
250
500
1
, 百拇医药 0.95
1.38
1.35
1.32
1.38
1.38
2
0.52
1.34
1.34
1.37
1.31
1.31
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讨论 近年来，端粒酶和端粒长度在HIV感染者的淋巴细胞中的变化受到研究者们的关注。HIV感染者的造血祖细胞的端粒酶活性下降，并且感染者的PBMC的端粒长度随疾病的进展而缩短，这与淋巴细胞端粒随年龄增长而缩短相一致。由此，研究者们提出了进展性HIV感染者的淋巴细胞提前进入了复制衰老的观点，并认为这与患者的免疫功能减弱有关[5，7]。较多研究已证实，免疫功能紊乱是慢性乙型肝炎的主要发病机制，其主要表现有CD4细胞减少，CD8细胞增高，CD4/CD8比值下降[8]；Th1和Th2免疫应答失衡[9]；淋巴细胞凋亡增加等[10]。由于免疫功能受损，使乙型肝炎患者不能清除HBV易成为慢性感染，亦使病人容易继发机会性感染，包括院内感染。这些已经成为乙型肝炎治疗中的棘手问题。本研究显示，慢性乙型肝炎患者的PBMC端粒酶活性有随病情的严重性而降低的趋势。慢性乙型肝炎组，尤其是重型肝炎患者外周血静息PBMC端粒酶活性显著低于正常对照组，说明这些患者的PBMC端粒酶活性在体内被抑制或被损害。由于端粒酶活性的低下可影响其相应细胞的功能[11]，因而乙型肝炎患者PBMC端粒酶活性减低可能是这些病人免疫功能缺陷的一个重要机制，但两者之间的直接联系尚需进一步的实验论证，此工作我们正在进行之中。PHA刺激后乙型肝炎患者端粒酶活性能上升至正常人水平，说明这种抑制可能是可逆性的。糖尿病和慢性肾功能衰竭患者有免疫功能低下，容易继发各类机会性感染已为临床观察所证实。尽管有若干研究，但其免疫功能缺损的机制仍不十分清楚。本研究发现，不论刺激与否，糖尿病、慢性肾功能衰竭患者PBMC端粒酶活性与健康人相比差异无显著性，说明这些患者的PBMC端粒酶未受影响，不是导致其免疫功能缺损的原因。必须指出的是，端粒酶只是维持端粒长度的一种机制，端粒的长度与淋巴细胞的衰老有着直接的联系。慢性乙型肝炎、慢性肾功能衰竭和糖尿病患者的淋巴细胞端粒长度如何，值得进一步研究。
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1：阴性对照； 2： PBMC； 3： PBMC+PHA； 4～7： PBMC+PHA+rhIL-12 (rhIL-12浓度分别为50、150 、250、500 ng/L)；8： PBMC+PHA+IL-12 抗体； 9： 阳性对照
图2 不同浓度的rhIL-12对PBMC端粒酶活性影响的电泳图
白细胞介素在免疫细胞的成熟、活化、增殖和免疫调节过程中发挥重要作用。已有研究表明，IL-2和IL-4与T淋巴细胞的端粒酶活化有关[12]。IL-12具有促进活化的T细胞增殖、增强自然杀伤细胞和细胞毒性T细胞的细胞毒活性，并使其γ-干扰素(IFNγ)产生增多的作用。IL-12还能提高HIV感染者的T细胞对抗原的反应性，表现为增殖增加，产生IL-2、IFNγ增加，而IL-10的产生减少。这种作用能被IL-12抗体所阻断[6，13]。鉴于IL-12对细胞免疫的正调节作用，为了了解IL-12是否通过对淋巴细胞端粒酶活性的影响来调节免疫功能，本研究观察了rhIL-12对淋巴细胞端粒酶的影响。IL-12不能使静息PBMC增殖已有定论，我们也在PBMC 组中单独加入rhIL-12，未能发现其增殖及端粒酶活性的变化(结果未显示)。但预料之外的是，本研究未能发现rhIL-12可以使活化的T细胞的端粒酶活性增加。为了进一步确认这一结果，我们于PBMC+PHA组中加入抗IL-12抗体(Genzyme，1:1000)，亦不能使端粒酶活性下降(结果未显示)。为了消除PCR产物过多使酶标板饱和，以致A值难以显示差异这一可能性，我们将PCR产物1∶2、1∶4、1∶8稀释之后再包被酶标板，结果A值平行下降，仍无显著差异。产生这一结果的原因不清，有待进一步研究。可能的原因有：(1)端粒酶的活性不能无限制地增高，T细胞端粒酶活性已被PHA激活到一个较高的水平；(2)IL-12能诱导细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的细胞毒活性，但这需要IL-2的协同参与，本研究缺乏外源性的IL-2，使IL-12不能充分发挥作用；(3)本研究所用的IL-12浓度为500 ng/L，有2例健康者使用了不同浓度的IL-12， 均无明显作用。有报道IL-12增加CTL融细胞活性的浓度为1～10 μg/L，本研究所用浓度有可能偏低；(4)rhIL-12对端粒酶活性确实没有影响。
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许多研究表明端粒的缩短和细胞衰老之间有密切联系，而端粒酶的激活则能阻止细胞分裂过程中端粒的缩短，从而使细胞逃脱复制衰老[14]。随年龄的增长，淋巴细胞端粒酶的活性逐渐下降，端粒亦逐渐缩短。T细胞在体外培养的过程中，随细胞的分裂，端粒和端粒酶亦有类似的变化[11]。本研究发现，乙型肝炎患者的淋巴细胞端粒酶活性下降，提示其免疫系统有可能提前进入了衰老，但还需进一步的研究，如对端粒长度的测定等来证实这一推论。
基金项目：卫生部科研基金资助(98-1-121)
参考文献
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(收稿日期：1999-10-14), 百拇医药
单位：黄燕(410008 长沙, 湖南医科大学附属湘雅医院传染科)；范学工(410008 长沙, 湖南医科大学附属湘雅医院传染科)；张英健(内分泌科)；周巧玲(肾内科)；唐发清(中心实验室)易红(中心实验室)
关键词：淋巴细胞；单核细胞；白细胞介素12；端粒酶
中华内科杂志000910 【摘要】 目的 探讨免疫功能受损宿主外周血单个核细胞(PBMC)端粒酶活性的表达情况。 方法 采用PCR-ELISA法测定了17例健康者、14例慢性乙型肝炎、8例糖尿病和8例慢性肾功能衰竭患者的PBMC经植物血凝素(PHA)刺激前后端粒酶的活性水平，及重组人白细胞介素12(rhIL-12)对端粒酶活性的影响。 结果 (1)4组静息PBMC有低水平的端粒酶活性表达(A值分别为0.52±0.28、0.32±0.27、0.41±0.20及0.43±0.30)，经PHA刺激后活性明显升高(1.39±0.09、1.21±0.38、1.38±0.11及1.36±0.08)；(2)慢性乙型肝炎患者静息期PBMC端粒酶活性显著低于健康者，但PHA刺激后两者活性差异无显著性；(3)未能发现rhIL-12对端粒酶活性的影响。 结论 PBMC能表达端粒酶活性，慢性乙型肝炎患者的免疫功能缺损可能与其PBMC端粒酶活性下降有关。
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Telomerase activity of peripheral blood mononuclear cells in patients with acquired immune dysfunction
HUANG Yan, FAN Xuegong, ZHANG Yingjian, et al.
Department of Infectious Diseases,The Affiliated Xiangya Hospital of Hunan Medical University, Changsha 410008, China
【Abstract】 Objective To investigate telomerase activity of peripheral blood mononuclear cells(PBMC) in patients with acquired immune dysfunction. Methods Telomerase activity of peripheral PBMC isolated from 4 groups including healthy subjects(17), chronic hepatitis B patients(14), diabetic patients(8) and chronic renal failure patients(8) was assayed with PCR-ELISA. Results (1) Telomerase activity was detectable at low levels in resting PBMC of all the 4 groups. It increased obviously after in vitro phytohemagglutinin (PHA) stimulation；(2) Telomerase activity of the resting PBMC in chronic hepatitis B patients was significantly lower than that in normal subjects, and was upregulated to the same level in the both groups after PHA stimulation；(3) No effect of recombinant human interleukin-12 on telomerase activity of activated T lymphocytes was found. ConclusionsPBMC may express telomerase activity and the decreased telomerase activity of PBMC in patients with chronic hepatitis B may partially be responsible for immune dysfunction in these patients.
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【Key words】 Lymphocytes; Monocytes; Interleukin-12; Telomerase
端粒是位于染色体末端对染色体的稳定起重要作用的DNA蛋白复合体，端粒的缩短能导致细胞的衰老和死亡[1]。端粒酶是一种核糖核蛋白，由RNA和蛋白质复合体组成，具有逆转录酶的活性，它能以自身的RNA为模板合成端粒。端粒酶主要存在于精原细胞、造血细胞、永生细胞及大部分肿瘤细胞，绝大多数体细胞的端粒酶均处于失活状态[2]。近年来的研究表明,外周血淋巴细胞有低水平的端粒酶活性表达[3]，而在进展性的人类免疫缺陷病毒(HIV)感染时，造血祖细胞的端粒酶活性下降、T细胞端粒缩短，提示患者的免疫系统提前进入了复制衰老，这可能与艾滋病患者最终的免疫功能缺损及继发各种机会性感染有关[4，5]。但这种现象是否在其他病毒性疾病中存在尚未见报道。白细胞介素(IL)-12主要是由单核巨噬细胞产生的活性较强的促活化型T细胞增殖的细胞因子。体外研究发现，IL-12可恢复艾滋病患者的T细胞功能，其主要机制是促进Th1细胞免疫应答[6]。IL-12能否调节T细胞端粒酶生物学行为还未见报道。某些慢性疾病，如慢性乙型肝炎、糖尿病、慢性肾功能衰竭的病人，由于获得性免疫功能受损，极易发生机会性感染，包括院内感染，一方面加重病情，同时也使原发病的治疗更加困难。上述患者是否有淋巴细胞端粒酶活性改变，IL-12能否通过调节T细胞端粒酶生物学行为来改善这些患者的免疫功能尚不清楚。本研究试图了解这些患者的淋巴细胞端粒酶活性水平，以及重组人IL-12 ( rhIL-12 ) 在体外对淋巴细胞端粒酶的影响。
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资料和方法
一、 研究对象
健康对照组17例，年龄12～56岁，平均33岁；慢性乙型肝炎患者14例(诊断符合1995 年 第五次全国传染病寄生虫病学术会议制定的诊断标准)，年龄15～42岁，平均34岁，其中慢性肝炎6例(中度3例，重度3例)，慢性重型肝炎8例；Ⅱ型糖尿病患者8例，年龄41～66岁，平均54岁；慢性肾功能衰竭患者8例，年龄22～43岁，平均35岁。
二、实验方法
1. 外周血单个核细胞(PBMC)培养：无菌取静脉血肝素抗凝，用淋巴细胞分离液(上海试剂二厂)离心，常规分离获得PBMC，Hank液洗涤细胞2次，计数。将细胞分3孔(3×106/孔)置于2ml RPMI 1640培养基中于24孔培养板培养，第一孔仅为PBMC；第二孔为PBMC+植物血凝素(PHA ，Sigma公司产品)，终浓度10mg/L；第三孔为PBMC+PHA+rhIL-12 (PharMingen)，终浓度500 ng/L。72h后收集细胞，锥虫蓝染色计数，取2×106个细胞，Hank液洗涤2次，4℃，3 000g离心10 min，弃上清，-80℃保存细胞。
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2.端粒酶活性检测：(1)检测原理： 端粒酶以其自身的RNA为模板合成端粒的重复序列加至生物素标记的引物上，产物行PCR扩增后与地高辛标记的探针杂交。杂交产物与酶标板结合，加入过氧化氢酶标记的抗地高辛抗体及过氧化氢酶的底物显色。根据吸光度的大小判定酶的活性。(2)检测方法：使用端粒酶PCR-ELISA试剂盒(Boehringer Mannheim 公司)，并按其提供的方法进行以下步骤：细胞提取物的准备：细胞经裂解后4℃，16 000g离心20 min，-80℃保存上清液备用。提取物可通过加热65℃、10 min使端粒酶失活作阴性对照，阳性对照为永生化的人胚肾细胞(293细胞株)提取物。在0.5 ml Eppendof管中依次加入25 μl反应混合液(含生物素标记的P1-TS引物、P2引物、Taq酶、dNTP等)、2 μl细胞提取液，加水至50 μl并以石蜡油封闭。将反应管置于DNA扩增仪(PE 480)中进行以下循环：25℃、30 min逆转录，95℃、5 min灭活端粒酶，94℃、30s→50℃、30s→72℃、90s循环30个周期，再72℃、10 min充分延伸。PCR产物变性后与地高辛标记的探针杂交，再在酶标标记板上与抗地高辛-过氧化物酶、TMB底物及反应终止液共同孵育后用ELISA计数器测定其在波长450 nm处的吸光度(A450，>0.2为阳性)，以此作PCR产物的定量分析。同时使用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)及银染法分析PCR产物，出现6个bp重复条带形成的梯形图为阳性。
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三、 统计学处理
数据以均数±标准差表示，采用配对t检验和方差分析。
结果
一、 健康人、乙型肝炎、糖尿病和慢性肾功能衰竭患者PBMC端粒酶活性的表达
PBMC端粒酶活性在PHA刺激前4组均较低，PHA刺激后则显著增高(P<0.001)。刺激前的端粒酶活性以健康人为最高，乙型肝炎患者最低，两者相比差异有显著性(P<0.05)，健康人与肾功能衰竭、糖尿病患者的PBMC端粒酶在活化前相比差异无显著性(P>0.05)，刺激后4组的端粒酶活性差异仍无显著性 (P>0.05，表1)。慢性重型乙型肝炎患者的端粒酶活性下降比较明显 ，而慢性乙型肝炎患者的端粒酶活性下降不明显 (表2)。阳性对照值：1.48，阴性对照值：0.00。实验结果行重复试验，重复性较好。电泳结果与酶标结果相符(图1)。
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表1 健康者与患者PBMC在PHA刺激前后端粒酶活性比较(A值，
±s) 组别例数
PBMC
PBMC+PHA
健康者
17
0.52±0.28
1.39±0.09*
乙型肝炎
14
, 百拇医药 0.32±0.27△
1.21±0.38*
糖尿病
8
0.41±0.20
1.38±0.11*
慢性肾功能衰竭
8
0.43±0.30
1.36±0.08*
注：与健康者比较，△P<0.05；分别与刺激前相比，*P<0.001 表2 乙型肝炎患者PBMC端粒酶活性(A值，
±s), http://www.100md.com
例数
PBMC
PBMC+PHA
慢性乙型肝炎
6
0.51±0.29〓
1.19±0.38
慢性重型乙型肝炎
8
0.18±0.14*
1.22±0.04
注： 与慢性乙型肝炎相比，*P<0.05
, 百拇医药
1～3：健康者标本；4～6：乙型肝炎患者标本；7：阳性对照； 8：阴性对照 1、4：PBMC； 2、5：PBMC+PHA； 3、6：PBMC+PHA+rhIL-12
图1 PHA及rhIL-12作用前后PBMC端粒酶变化的电泳图
二、 rhIL-12对PBMC端粒酶活性的影响
本研究测定了7例健康者、6例乙型肝炎患者、5例糖尿病患者和6例慢性肾功能衰竭患者的PBMC经PHA和rhIL-12作用后的端粒酶活性，并测定了2例健康者经不同浓度的rhIL-12(分别为50、150、250、500 ng/L)作用后的端粒酶活性，未能发现rhIL-12对PBMC端粒酶活性有调节作用(P>0.05，表3，4)。电泳结果与酶标结果相符(图1，2)。
表3 rhIL-12处理前后PBMC端粒酶活性的比较(A值，
±s) 组别, 百拇医药
例数
PBMC
PBMC+PHA
PBMC+PHA+rhIL-12
健康者
7
0.40±0.31
1.37±0.06
1.40±0.07
乙型肝炎
6
0.14±0.13
, 百拇医药
1.36±0.07
1.38±0.11
糖尿病
5
0.38±0.19
1.37±0.13
1.33±0.11
慢性肾功能衰竭
6
0.47±0.34
1.34±0.08
1.42±0.09
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表4 不同浓度的rhIL-12对PBMC端粒酶活性的影响(A值，
±s) 例号PBMC
PBMC+PHA
PBMC+PHA+ rhIL-12
rhIL-12(ng/L)：
50
150
250
500
1
, 百拇医药 0.95
1.38
1.35
1.32
1.38
1.38
2
0.52
1.34
1.34
1.37
1.31
1.31
, http://www.100md.com
讨论 近年来，端粒酶和端粒长度在HIV感染者的淋巴细胞中的变化受到研究者们的关注。HIV感染者的造血祖细胞的端粒酶活性下降，并且感染者的PBMC的端粒长度随疾病的进展而缩短，这与淋巴细胞端粒随年龄增长而缩短相一致。由此，研究者们提出了进展性HIV感染者的淋巴细胞提前进入了复制衰老的观点，并认为这与患者的免疫功能减弱有关[5，7]。较多研究已证实，免疫功能紊乱是慢性乙型肝炎的主要发病机制，其主要表现有CD4细胞减少，CD8细胞增高，CD4/CD8比值下降[8]；Th1和Th2免疫应答失衡[9]；淋巴细胞凋亡增加等[10]。由于免疫功能受损，使乙型肝炎患者不能清除HBV易成为慢性感染，亦使病人容易继发机会性感染，包括院内感染。这些已经成为乙型肝炎治疗中的棘手问题。本研究显示，慢性乙型肝炎患者的PBMC端粒酶活性有随病情的严重性而降低的趋势。慢性乙型肝炎组，尤其是重型肝炎患者外周血静息PBMC端粒酶活性显著低于正常对照组，说明这些患者的PBMC端粒酶活性在体内被抑制或被损害。由于端粒酶活性的低下可影响其相应细胞的功能[11]，因而乙型肝炎患者PBMC端粒酶活性减低可能是这些病人免疫功能缺陷的一个重要机制，但两者之间的直接联系尚需进一步的实验论证，此工作我们正在进行之中。PHA刺激后乙型肝炎患者端粒酶活性能上升至正常人水平，说明这种抑制可能是可逆性的。糖尿病和慢性肾功能衰竭患者有免疫功能低下，容易继发各类机会性感染已为临床观察所证实。尽管有若干研究，但其免疫功能缺损的机制仍不十分清楚。本研究发现，不论刺激与否，糖尿病、慢性肾功能衰竭患者PBMC端粒酶活性与健康人相比差异无显著性，说明这些患者的PBMC端粒酶未受影响，不是导致其免疫功能缺损的原因。必须指出的是，端粒酶只是维持端粒长度的一种机制，端粒的长度与淋巴细胞的衰老有着直接的联系。慢性乙型肝炎、慢性肾功能衰竭和糖尿病患者的淋巴细胞端粒长度如何，值得进一步研究。
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1：阴性对照； 2： PBMC； 3： PBMC+PHA； 4～7： PBMC+PHA+rhIL-12 (rhIL-12浓度分别为50、150 、250、500 ng/L)；8： PBMC+PHA+IL-12 抗体； 9： 阳性对照
图2 不同浓度的rhIL-12对PBMC端粒酶活性影响的电泳图
白细胞介素在免疫细胞的成熟、活化、增殖和免疫调节过程中发挥重要作用。已有研究表明，IL-2和IL-4与T淋巴细胞的端粒酶活化有关[12]。IL-12具有促进活化的T细胞增殖、增强自然杀伤细胞和细胞毒性T细胞的细胞毒活性，并使其γ-干扰素(IFNγ)产生增多的作用。IL-12还能提高HIV感染者的T细胞对抗原的反应性，表现为增殖增加，产生IL-2、IFNγ增加，而IL-10的产生减少。这种作用能被IL-12抗体所阻断[6，13]。鉴于IL-12对细胞免疫的正调节作用，为了了解IL-12是否通过对淋巴细胞端粒酶活性的影响来调节免疫功能，本研究观察了rhIL-12对淋巴细胞端粒酶的影响。IL-12不能使静息PBMC增殖已有定论，我们也在PBMC 组中单独加入rhIL-12，未能发现其增殖及端粒酶活性的变化(结果未显示)。但预料之外的是，本研究未能发现rhIL-12可以使活化的T细胞的端粒酶活性增加。为了进一步确认这一结果，我们于PBMC+PHA组中加入抗IL-12抗体(Genzyme，1:1000)，亦不能使端粒酶活性下降(结果未显示)。为了消除PCR产物过多使酶标板饱和，以致A值难以显示差异这一可能性，我们将PCR产物1∶2、1∶4、1∶8稀释之后再包被酶标板，结果A值平行下降，仍无显著差异。产生这一结果的原因不清，有待进一步研究。可能的原因有：(1)端粒酶的活性不能无限制地增高，T细胞端粒酶活性已被PHA激活到一个较高的水平；(2)IL-12能诱导细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的细胞毒活性，但这需要IL-2的协同参与，本研究缺乏外源性的IL-2，使IL-12不能充分发挥作用；(3)本研究所用的IL-12浓度为500 ng/L，有2例健康者使用了不同浓度的IL-12， 均无明显作用。有报道IL-12增加CTL融细胞活性的浓度为1～10 μg/L，本研究所用浓度有可能偏低；(4)rhIL-12对端粒酶活性确实没有影响。
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许多研究表明端粒的缩短和细胞衰老之间有密切联系，而端粒酶的激活则能阻止细胞分裂过程中端粒的缩短，从而使细胞逃脱复制衰老[14]。随年龄的增长，淋巴细胞端粒酶的活性逐渐下降，端粒亦逐渐缩短。T细胞在体外培养的过程中，随细胞的分裂，端粒和端粒酶亦有类似的变化[11]。本研究发现，乙型肝炎患者的淋巴细胞端粒酶活性下降，提示其免疫系统有可能提前进入了衰老，但还需进一步的研究，如对端粒长度的测定等来证实这一推论。
基金项目：卫生部科研基金资助(98-1-121)
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(收稿日期：1999-10-14), 百拇医药