钙离子在大鼠结肠平滑肌运动中作用机制的研究
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中华内科杂志 2000年第9期第39卷
作者：李俊霞 刘新光 谢鹏雁 谷青 李江 张英 唐朝枢
单位：李俊霞 刘新光 谢鹏雁 谷青 李江(100034 北京大学第一医院消化内科)；张英 唐朝枢(中心实验室)
关键词：结肠疾病，功能性；肌，平滑；鸟苷素
中华内科杂志000904 【摘要】 目的 应用束缚应激大鼠实验模型，研究离体结肠平滑肌的收缩运动及其影响因素，探讨鸟苷素在结肠运动中的作用。方法 建立束缚应激大鼠动物模型，制备离体结肠平滑肌环行肌及纵行肌肌条，应用张力换能器，测定其肌张力。应用放射配基法测定结肠组织及血浆中鸟苷素含量。结果 束缚应激刺激可诱发大鼠排便增加，该动物模型是较好的模拟人IBS的实验动物模型。束缚应激大鼠离体结肠平滑肌的张力升高，对K+、Ca2+、乙酰胆碱作用的反应明显加强，其血浆及结肠组织中鸟苷素的含量增加，曲美布汀可增强基础状态结肠平滑肌的收缩，降低氯化钾、氯化钙及乙酰胆碱对结肠的收缩作用。结论 结肠平滑肌本身收缩活动的异常是肠易激综合征发病的重要机制之一，调节平滑肌收缩与舒张运动，纠正肠管平滑肌运动异常，是治疗肠易激综合征的新方向。
, 百拇医药
The regulation of calcium in the movement of colonic smooth muscle in wrap restraint stress rats
LI Junxia, LIU Xinguang, XIE Pengyan, et al.
Department of Gastroenterology, First Teaching Hospital, Beijing University, Beijing 100034，China
【Abstract】 Objective To investigate the influence of contraction of isolated colonic smooth muscle and role of guanylin in colonic movement in wrap restraint stress rats. Methods By using wrap restraint stress induced defecation rats, the tone of isolated longitudinal and circular colonic muscle strips and guanylin contents in colon and blood were measured by transducer and radioligand binding assay respectively. Results There were similarities between the intestinal effects of wrap restraint stress in rats and irritable bowel syndrome (IBS) in human . Therefore, wrap restraint stress rat is an appropriate animal model to study stress related intestinal dysfunction. In wrap restraint stress rats, both the tone of smooth muscle and the reaction to K+,Ca2+ and acetycholine increased significantly; meanwhile guanylin contents in blood and colon increased also. Trimebutine can decrease the basic tone of smooth muscle and reaction to Ca2+、 K+and acetycholine. Conclusions The abnormality of colonic smooth muscle contraction is one of the mechanisms in IBS and regulation of colonic smooth muscle contraction is a new method to treat IBS.
, 百拇医药
【Key words】 Colonic diseases，functional; Muscle， smooth; Guanylin
应激刺激可引起结肠功能紊乱的症状，是人肠易激综合征(IBS)发病的重要原因之一。应激刺激可诱发和(或)加重IBS的症状，然而，其引起和(或)加重结肠功能紊乱的发病机制尚不清楚，可能与精神神经、体液及肽类激素的调节相关[1]。不同的应激刺激引起不同程度的消化道功能紊乱，其中束缚应激是一种对肠黏膜轻微的、非溃疡形成的刺激，束缚应激诱发排便异常的大鼠模型是研究人IBS的较好的实验动物模型[2]。本实验旨在通过制备束缚应激诱发排便异常变化的大鼠模型，研究其离体结肠平滑肌异常收缩及其调节机制。
材料与方法
一、动物模型的建立与分组
选择健康Wistar大鼠(购自本院实验动物中心)21只，体重200～250 g，雄性，控制室温22℃，在有昼夜光线变化的房间里分笼饲养1周，自由饮水、进食。实验前24 h禁食。随机分为3组，正常对照组与实验组各7只,用于肌张力测定，另外7只大鼠为曲美布汀药物试验组。实验组及药物实验组大鼠予乙醚麻醉至昏倒后，用纸带束缚前肩、前上肢及胸部，限制前上肢搔抓头面部，但不控制其活动。取直径为3 mm 的玻璃小球沿肛门放入距肛门3 cm 直肠内，待2～5 min后大鼠苏醒，迅速移至笼内喂食、饮水，笼内垫清洁滤纸。自大鼠苏醒后开始计时，束缚时间为1 h。观察此1 h内大鼠排便的粪点数及玻璃小球排出时间。对照组大鼠，不予束缚，余实验步骤同前。
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二、方法
1.离体结肠纵行肌及环行肌肌条张力的测定：采用脊髓脱位法处死大鼠，于距肛门5～10 cm 处取结肠 3～5 cm，去除结肠内容物，制成长1.5 cm、 宽 0.3 cm 的纵行肌及环行肌肌条。应用力移位张力换能器测定肌条张力的变化。
2.K+、Ca2+、乙酰胆碱(购自军事医学科学院)对肌条张力的影响:实验组及对照组分别用氯化钾30 mmol/L、氯化钙2.2 mmol/L、乙酰胆碱10-9 g/L作用于平滑肌肌条，记录其肌条张力的变化。
3.曲美布汀(日本田边公司赠送)对K+、Ca2+、乙酰胆碱所致平滑肌张力变化的影响: 取10-9 g/L曲美布汀分别作用于氯化钾、氯化钙、乙酰胆碱作用后的药物实验组平滑肌肌条，记录肌条张力的变化。
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4.结肠黏膜病理组织学检查：处死大鼠后，取乙状结肠0.5 cm ，HE染色，40倍光学显微镜下观察大鼠结肠黏膜病理组织学改变。
5.血浆及结肠组织鸟苷素含量的测定: 采用双抗体分离法测定实验组及对照组大鼠血浆及结肠组织中结合的放射配基的放射强度，换算出相应的鸟苷素含量(放免试剂盒购于凤凰公司)。
三、统计学处理
计量资料以
±s表示，采用t检验处理，显著性水准为 P<0.05。
结果
一、束缚应激刺激对大鼠排便的影响
束缚应激刺激后大鼠(实验组和药物实验组)排便量多于对照组(P<0.05)，且束缚应激刺激后大鼠直肠内玻璃小球排出时间显著缩短(P<0.001)，见表1。
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表1 束缚应激对大鼠排便的影响(±s) 检测指标
实验组
药物实验组
对照组
大鼠粪点数
1.43±0.79
1.57±0.78
0.57±0.53
玻璃小球排出
8.14±4.38**
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34.71±8.90**
33.43±7.41
时间(min)
注：各组的大鼠均为7只 实验组及药物实验组与对照组比较，P<0.05,**P<0.001 二、Ca2+、K+、乙酰胆碱对离体结肠平滑肌肌条张力的影响
1.实验组纵行肌基础肌张力较对照组增高(P<0.01)，氯化钾、氯化钙 、乙酰胆碱可显著增加结肠平滑肌肌条张力(P<0.001)，实验组显著高于对照组(P<0.05)，见表2。实验组环行肌基础肌条张力明显高于对照组(P<0.01)，氯化钾、氯化钙、乙酰胆碱可显著增加结肠平滑肌肌条张力(P<0.001)，实验组显著高于对照组(P<0.05)，见表2。 对照组及实验组组内环行肌与纵行肌之间肌条张力差异无显著性 (P>0.05)。
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表2 K+、Ca2+及乙酰胆碱对结肠平滑肌肌条张力的影响(mg,±s) 检测指标
纵行肌 (7条)
环行肌 (7条)
实验组
对照组
实验组
对照组
基础肌张力
641.64±
74.39ΔΔ
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512.43±
29.76
609.71±
36.74ΔΔ
500.71±
18.81
氯化钾作用后
970.00±
199.39
**Δ
735.42±
102.09***
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943.57±
177.27***
ΔΔ
686.28±
99.35***
氯化钙作用后
973.57±
155.60***Δ
795.71±
78.35***
990.14±
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115.00***ΔΔ
746.71±
79.57***
乙酰胆碱作
用后
1 203.21±
191.12***Δ
868.42±
153.66***
1 148.25±
297.19***Δ
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792.28±
113.69***
注： 实验组与对照组比较，ΔP<0.05,ΔΔP<0.01; 用药后与用药前比较, *P<0.05,**P<0.01,***P<0.001
2. 曲美布汀可增加药物实验组大鼠基础状态下结肠纵行肌及环行肌肌条的张力(P<0.01)，降低药物实验组氯化钾、氯化钙、乙酰胆碱作用后结肠纵行肌及环行肌的张力(P<0.05),见表3。
表3 曲美布汀对基础及K+、Ca2+、乙酰胆碱作用后平滑肌张力的影响(mg,±s) 检测指标
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纵行肌(7条)
环行肌 (7条)
用药前
用药后
用药前
用药后
基础肌张力
705.71±
70.56
846.43±
84.69**
664.28±
, 百拇医药
57.47
839.28±
102.93**
氯化钾作用前后肌张力
935.71±
107.87
639.28±
151.28***
864.28±
98.80
717.85±
117.89*
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氯化钙作用前后肌张力
960.71±
104.94
803.57±
115.86*
896.43±
60.25
771.43±
87.11**
乙酰胆碱作用前后肌张力
1 121.43±
, http://www.100md.com 128.86
782.14±
108.69**
1 017.85±
70.28
746.43±
58.50***
注：用药前后比较，* P<0.05,** P<0.01,***P<0.001
三、结肠组织中鸟苷素的含量
实验组和对照组大鼠中鸟苷素的含量在血浆中分别为(15.59 ± 2.97)ng/L和 (5.86 ±1.19) ng/L，在结肠组织中分别为(89.18 ± 10.91) ng/L蛋白和 (60.27± 5.70)ng/L蛋白，血浆及结肠组织中鸟苷素的含量在实验组明显高于对照组(P<0.001)。
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四、结肠改变
束缚应激大鼠结肠黏膜无充血、水肿、溃疡，无炎症细胞浸润等病理组织学改变。
讨论
应激是通过神经体液调节的一种复杂反应，在人类常常导致胃肠功能失调，表现为胃肠运动、分泌和消化转运时间的改变[3]。Williams的实验证明，束缚应激刺激可改变小肠与结肠的转运时间，导致排便增加，同时引起血浆中促肾上腺皮质激素(ACTH)、β脑啡肽释放升高。束缚应激是一种轻微、非溃疡形成的刺激，可用来复制与应激有关的消化道症状和模拟人类IBS,被用以制作研究IBS的实验动物模型。Haga等应用该动物模型，进行了IBS的治疗药物研究，确立了该模型在IBS研究中的地位[4]。本实验显示束缚应激刺激可引起大鼠结肠运动加快，且不导致结肠病理组织学改变，进一步证实束缚应激诱发排便异常的大鼠动物模型是研究IBS发病机制及其治疗的较为理想的实验动物模型。
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IBS 患者平滑肌细胞的电活动与高动力耦连。目前认为，胃肠平滑肌的两类钙离子通道，即电压依赖性钙通道及受体操纵型钙通道与IBS 的发病关系密切。当钾离子通道激活后，K+ 外流增加，Ca2+ 内流，使细胞内Ca2+ 浓度增加，平滑肌的收缩增强[5]。钾离子通道参与平台期动作电位和复极过程，亦参与引起动作电位的峰电位的形成。
本研究显示，束缚应激大鼠离体结肠的张力明显高于对照组，平滑肌对氯化钾、氯化钙引起收缩作用的反应明显增强。推测平滑肌肌条在氯化钾、氯化钙的作用下，细胞外K+、Ca2+浓度增加，激活钙离子通道，使细胞内Ca2+浓度增高，导致平滑肌肌条收缩运动增强。提示束缚应激大鼠肠道运动异常与肠平滑肌细胞内Ca2+浓度有关。
在本研究中，束缚应激大鼠离体结肠平滑肌肌条对乙酰胆碱引起的收缩反应增加，推测乙酰胆碱直接作用于平滑肌细胞上乙酰胆碱受体，与质膜受体(M)结合，引起M样的作用，使细胞内Ca2+池释放储存的Ca2+,提高细胞内Ca2+水平，导致平滑肌的收缩运动增强。推测束缚应激刺激可能导致乙酰胆碱受体水平提高，增强乙酰胆碱的效应，但对于肌细胞内离子及信号传导机制尚有待于进一步研究。
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鸟苷素是1种由15个氨基酸组成的肽，是强大的内源性大肠杆菌热稳定肠毒素受体激活物(Sta)，大鼠结肠和小肠有鸟苷素mRNA的表达。我们发现束缚应激使大鼠血浆和结肠组织的鸟苷素水平明显增加。鸟苷素与其受体鸟苷素环化酶C(GC-C)结合，激活鸟苷酸环化酶，使细胞中cGMP升高，激活氯离子通道，促进肠内水及电解质的迅速分泌，肠内容物增加[6]。另一方面，促进肌膜Ca2+摄入及肌浆网释放Ca2+，使肌浆内Ca2+浓度增加，肌细胞收缩加强。由此可见，鸟苷素水平增加不仅使大鼠结肠的分泌增加，而且促进结肠的运动增加、结肠的转运速度加快。提示鸟苷素是引起束缚应激大鼠排便异常的主要原因之一，亦是内源性促动力物质之一。
曲美布汀是作用钾、钙离子通道的胃肠动力调节剂，亦是1种外周性作用的脑啡肽类似物，具有调节肠肌间神经丛非胆碱能兴奋性神经元μ、κ 和δ受体的复杂作用。通过兴奋μ、κ受体，促进跨细胞膜K+的传导增加、电压依赖性钙离子通道的传导减弱，产生调节肠运动功能[7]。本实验证实曲美布汀10-9 g/L时能缓慢增加基础状态平滑肌肌条的自律性收缩张力，而不影响其收缩幅度，可降低氯化钾、氯化钙及乙酰胆碱引起平滑肌肌条收缩的张力，显示了曲美布汀与K+、Ca2+及乙酰胆碱作用的相关性。Massaki的研究发现，曲美布汀通过抑制3种K+流(非钙依赖性钾通道、钙激活性钾通道及短暂自发性钾外向电流)，阻滞由于钾通道激活引起的Ca2+通过电压依赖性钙离子通道进入细胞内，使细胞内Ca2+浓度下降，细胞内储存Ca2+减少，同时亦抑制了细胞器内的Ca2+释放，使细胞内的Ca2+浓度保持较低水平，平滑肌的收缩受到抑制。K+流受到抑制，膜静息电位升高，肠平滑肌肌电活动增加，平滑肌细胞去极化，产生的动作电位频率增加，导致平滑肌的收缩力增加。Godfraind等[8]亦证实高浓度曲美布汀(10-8～10-9g/L)还可表现出钙离子阻滞剂样作用，且不同状态的钙离子通道与曲美布汀的亲和力不同，而表现出曲美布汀抑制和兴奋平滑肌运动的双重作用。曲美布汀这种抑制和兴奋平滑肌的双重作用与平滑肌机械运动水平、平滑肌细胞的生物电活动及药物浓度等有关。曲美布汀抑制乙酰胆碱作用的机制尚不清楚，是否影响乙酰胆碱与其受体结合，还需进一步研究。
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IBS是全球性的常见肠道疾病，本研究中的动物模型显示肠黏膜无病理组织学改变，证实IBS是一种功能性肠道疾病。迄今为止，IBS发病机制尚不清楚，基本认为肠动力学异常是产生胃肠症状的主要因素，神经体液、肽类激素调控下的肠平滑肌细胞生物电活动是导致肠运动异常的重要病理生理学基础。肠平滑肌细胞内Ca2+、K+等离子浓度水平是影响平滑肌运动的重要因素，调控离子通道的药物治疗，将是治疗IBS的主要方向。
参考文献
1，侯晓华.消化道运动学.北京：科学出版社,1998.
2，Williams CL , Villar GR, Peterson JM, et al.Sress-induced changes in intestinal transit in the rats：a model for irritable bowel syndrome.Gastroenterology, 1988， 94:611-621.
, http://www.100md.com
3，Reynolds JC. Challenges in the treatment of colonic motility disorders. Am J Health. Sys Pharm, 1996,53:s17-s26.
4，Yamamoto O, Niida H, Tajma K, et al. Effect of YNS-15P：a new alpha-2 adrenoceptor antagonist on stress stimulated colonic propulsion in rats. J Pharmacol Exp Ther，1998, 287:691-696.
5，Masaaki N, Seiich K, Witte D, et al.Effects of trimebutine on K+ current in rabbit ilea smooth muscle cells. Eur J Pharmacol,1993,235:197-203.
, http://www.100md.com
6，Mitchell BJ, Hawkin ,David PW.Guanylin mRNA expression in human intestine and coloretal adenocarcinoma. Lab Invest，1998,78:101-108.
7，Masaaki N, Kenji Y, Katsuo I, et al. Contribution of peripheral opioid to the trimebutine induced contraction of the proximal colon in anesthetized rats. Jpn J Smooth Muscle Res, 1989,25:27-30.
8，Godfraind T, Miller R, Wibo M, et al. Calcium antagonism and calcium entry blockade. Pharmacol Rev , 1996, 38:321-416.
(收稿日期：1999-12-02), 百拇医药
单位：李俊霞 刘新光 谢鹏雁 谷青 李江(100034 北京大学第一医院消化内科)；张英 唐朝枢(中心实验室)
关键词：结肠疾病，功能性；肌，平滑；鸟苷素
中华内科杂志000904 【摘要】 目的 应用束缚应激大鼠实验模型，研究离体结肠平滑肌的收缩运动及其影响因素，探讨鸟苷素在结肠运动中的作用。方法 建立束缚应激大鼠动物模型，制备离体结肠平滑肌环行肌及纵行肌肌条，应用张力换能器，测定其肌张力。应用放射配基法测定结肠组织及血浆中鸟苷素含量。结果 束缚应激刺激可诱发大鼠排便增加，该动物模型是较好的模拟人IBS的实验动物模型。束缚应激大鼠离体结肠平滑肌的张力升高，对K+、Ca2+、乙酰胆碱作用的反应明显加强，其血浆及结肠组织中鸟苷素的含量增加，曲美布汀可增强基础状态结肠平滑肌的收缩，降低氯化钾、氯化钙及乙酰胆碱对结肠的收缩作用。结论 结肠平滑肌本身收缩活动的异常是肠易激综合征发病的重要机制之一，调节平滑肌收缩与舒张运动，纠正肠管平滑肌运动异常，是治疗肠易激综合征的新方向。
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The regulation of calcium in the movement of colonic smooth muscle in wrap restraint stress rats
LI Junxia, LIU Xinguang, XIE Pengyan, et al.
Department of Gastroenterology, First Teaching Hospital, Beijing University, Beijing 100034，China
【Abstract】 Objective To investigate the influence of contraction of isolated colonic smooth muscle and role of guanylin in colonic movement in wrap restraint stress rats. Methods By using wrap restraint stress induced defecation rats, the tone of isolated longitudinal and circular colonic muscle strips and guanylin contents in colon and blood were measured by transducer and radioligand binding assay respectively. Results There were similarities between the intestinal effects of wrap restraint stress in rats and irritable bowel syndrome (IBS) in human . Therefore, wrap restraint stress rat is an appropriate animal model to study stress related intestinal dysfunction. In wrap restraint stress rats, both the tone of smooth muscle and the reaction to K+,Ca2+ and acetycholine increased significantly; meanwhile guanylin contents in blood and colon increased also. Trimebutine can decrease the basic tone of smooth muscle and reaction to Ca2+、 K+and acetycholine. Conclusions The abnormality of colonic smooth muscle contraction is one of the mechanisms in IBS and regulation of colonic smooth muscle contraction is a new method to treat IBS.
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【Key words】 Colonic diseases，functional; Muscle， smooth; Guanylin
应激刺激可引起结肠功能紊乱的症状，是人肠易激综合征(IBS)发病的重要原因之一。应激刺激可诱发和(或)加重IBS的症状，然而，其引起和(或)加重结肠功能紊乱的发病机制尚不清楚，可能与精神神经、体液及肽类激素的调节相关[1]。不同的应激刺激引起不同程度的消化道功能紊乱，其中束缚应激是一种对肠黏膜轻微的、非溃疡形成的刺激，束缚应激诱发排便异常的大鼠模型是研究人IBS的较好的实验动物模型[2]。本实验旨在通过制备束缚应激诱发排便异常变化的大鼠模型，研究其离体结肠平滑肌异常收缩及其调节机制。
材料与方法
一、动物模型的建立与分组
选择健康Wistar大鼠(购自本院实验动物中心)21只，体重200～250 g，雄性，控制室温22℃，在有昼夜光线变化的房间里分笼饲养1周，自由饮水、进食。实验前24 h禁食。随机分为3组，正常对照组与实验组各7只,用于肌张力测定，另外7只大鼠为曲美布汀药物试验组。实验组及药物实验组大鼠予乙醚麻醉至昏倒后，用纸带束缚前肩、前上肢及胸部，限制前上肢搔抓头面部，但不控制其活动。取直径为3 mm 的玻璃小球沿肛门放入距肛门3 cm 直肠内，待2～5 min后大鼠苏醒，迅速移至笼内喂食、饮水，笼内垫清洁滤纸。自大鼠苏醒后开始计时，束缚时间为1 h。观察此1 h内大鼠排便的粪点数及玻璃小球排出时间。对照组大鼠，不予束缚，余实验步骤同前。
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二、方法
1.离体结肠纵行肌及环行肌肌条张力的测定：采用脊髓脱位法处死大鼠，于距肛门5～10 cm 处取结肠 3～5 cm，去除结肠内容物，制成长1.5 cm、 宽 0.3 cm 的纵行肌及环行肌肌条。应用力移位张力换能器测定肌条张力的变化。
2.K+、Ca2+、乙酰胆碱(购自军事医学科学院)对肌条张力的影响:实验组及对照组分别用氯化钾30 mmol/L、氯化钙2.2 mmol/L、乙酰胆碱10-9 g/L作用于平滑肌肌条，记录其肌条张力的变化。
3.曲美布汀(日本田边公司赠送)对K+、Ca2+、乙酰胆碱所致平滑肌张力变化的影响: 取10-9 g/L曲美布汀分别作用于氯化钾、氯化钙、乙酰胆碱作用后的药物实验组平滑肌肌条，记录肌条张力的变化。
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4.结肠黏膜病理组织学检查：处死大鼠后，取乙状结肠0.5 cm ，HE染色，40倍光学显微镜下观察大鼠结肠黏膜病理组织学改变。
5.血浆及结肠组织鸟苷素含量的测定: 采用双抗体分离法测定实验组及对照组大鼠血浆及结肠组织中结合的放射配基的放射强度，换算出相应的鸟苷素含量(放免试剂盒购于凤凰公司)。
三、统计学处理
计量资料以
±s表示，采用t检验处理，显著性水准为 P<0.05。结果
一、束缚应激刺激对大鼠排便的影响
束缚应激刺激后大鼠(实验组和药物实验组)排便量多于对照组(P<0.05)，且束缚应激刺激后大鼠直肠内玻璃小球排出时间显著缩短(P<0.001)，见表1。
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表1 束缚应激对大鼠排便的影响(
±s) 检测指标实验组
药物实验组
对照组
大鼠粪点数
1.43±0.79
1.57±0.78
0.57±0.53
玻璃小球排出
8.14±4.38**
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34.71±8.90**
33.43±7.41
时间(min)
注：各组的大鼠均为7只 实验组及药物实验组与对照组比较，P<0.05,**P<0.001 二、Ca2+、K+、乙酰胆碱对离体结肠平滑肌肌条张力的影响
1.实验组纵行肌基础肌张力较对照组增高(P<0.01)，氯化钾、氯化钙 、乙酰胆碱可显著增加结肠平滑肌肌条张力(P<0.001)，实验组显著高于对照组(P<0.05)，见表2。实验组环行肌基础肌条张力明显高于对照组(P<0.01)，氯化钾、氯化钙、乙酰胆碱可显著增加结肠平滑肌肌条张力(P<0.001)，实验组显著高于对照组(P<0.05)，见表2。 对照组及实验组组内环行肌与纵行肌之间肌条张力差异无显著性 (P>0.05)。
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表2 K+、Ca2+及乙酰胆碱对结肠平滑肌肌条张力的影响(mg,
±s) 检测指标纵行肌 (7条)
环行肌 (7条)
实验组
对照组
实验组
对照组
基础肌张力
641.64±
74.39ΔΔ
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512.43±
29.76
609.71±
36.74ΔΔ
500.71±
18.81
氯化钾作用后
970.00±
199.39
**Δ
735.42±
102.09***
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943.57±
177.27***
ΔΔ
686.28±
99.35***
氯化钙作用后
973.57±
155.60***Δ
795.71±
78.35***
990.14±
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115.00***ΔΔ
746.71±
79.57***
乙酰胆碱作
用后
1 203.21±
191.12***Δ
868.42±
153.66***
1 148.25±
297.19***Δ
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792.28±
113.69***
注： 实验组与对照组比较，ΔP<0.05,ΔΔP<0.01; 用药后与用药前比较, *P<0.05,**P<0.01,***P<0.001
2. 曲美布汀可增加药物实验组大鼠基础状态下结肠纵行肌及环行肌肌条的张力(P<0.01)，降低药物实验组氯化钾、氯化钙、乙酰胆碱作用后结肠纵行肌及环行肌的张力(P<0.05),见表3。
表3 曲美布汀对基础及K+、Ca2+、乙酰胆碱作用后平滑肌张力的影响(mg,
±s) 检测指标, 百拇医药
纵行肌(7条)
环行肌 (7条)
用药前
用药后
用药前
用药后
基础肌张力
705.71±
70.56
846.43±
84.69**
664.28±
, 百拇医药
57.47
839.28±
102.93**
氯化钾作用前后肌张力
935.71±
107.87
639.28±
151.28***
864.28±
98.80
717.85±
117.89*
, 百拇医药
氯化钙作用前后肌张力
960.71±
104.94
803.57±
115.86*
896.43±
60.25
771.43±
87.11**
乙酰胆碱作用前后肌张力
1 121.43±
, http://www.100md.com 128.86
782.14±
108.69**
1 017.85±
70.28
746.43±
58.50***
注：用药前后比较，* P<0.05,** P<0.01,***P<0.001
三、结肠组织中鸟苷素的含量
实验组和对照组大鼠中鸟苷素的含量在血浆中分别为(15.59 ± 2.97)ng/L和 (5.86 ±1.19) ng/L，在结肠组织中分别为(89.18 ± 10.91) ng/L蛋白和 (60.27± 5.70)ng/L蛋白，血浆及结肠组织中鸟苷素的含量在实验组明显高于对照组(P<0.001)。
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四、结肠改变
束缚应激大鼠结肠黏膜无充血、水肿、溃疡，无炎症细胞浸润等病理组织学改变。
讨论
应激是通过神经体液调节的一种复杂反应，在人类常常导致胃肠功能失调，表现为胃肠运动、分泌和消化转运时间的改变[3]。Williams的实验证明，束缚应激刺激可改变小肠与结肠的转运时间，导致排便增加，同时引起血浆中促肾上腺皮质激素(ACTH)、β脑啡肽释放升高。束缚应激是一种轻微、非溃疡形成的刺激，可用来复制与应激有关的消化道症状和模拟人类IBS,被用以制作研究IBS的实验动物模型。Haga等应用该动物模型，进行了IBS的治疗药物研究，确立了该模型在IBS研究中的地位[4]。本实验显示束缚应激刺激可引起大鼠结肠运动加快，且不导致结肠病理组织学改变，进一步证实束缚应激诱发排便异常的大鼠动物模型是研究IBS发病机制及其治疗的较为理想的实验动物模型。
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IBS 患者平滑肌细胞的电活动与高动力耦连。目前认为，胃肠平滑肌的两类钙离子通道，即电压依赖性钙通道及受体操纵型钙通道与IBS 的发病关系密切。当钾离子通道激活后，K+ 外流增加，Ca2+ 内流，使细胞内Ca2+ 浓度增加，平滑肌的收缩增强[5]。钾离子通道参与平台期动作电位和复极过程，亦参与引起动作电位的峰电位的形成。
本研究显示，束缚应激大鼠离体结肠的张力明显高于对照组，平滑肌对氯化钾、氯化钙引起收缩作用的反应明显增强。推测平滑肌肌条在氯化钾、氯化钙的作用下，细胞外K+、Ca2+浓度增加，激活钙离子通道，使细胞内Ca2+浓度增高，导致平滑肌肌条收缩运动增强。提示束缚应激大鼠肠道运动异常与肠平滑肌细胞内Ca2+浓度有关。
在本研究中，束缚应激大鼠离体结肠平滑肌肌条对乙酰胆碱引起的收缩反应增加，推测乙酰胆碱直接作用于平滑肌细胞上乙酰胆碱受体，与质膜受体(M)结合，引起M样的作用，使细胞内Ca2+池释放储存的Ca2+,提高细胞内Ca2+水平，导致平滑肌的收缩运动增强。推测束缚应激刺激可能导致乙酰胆碱受体水平提高，增强乙酰胆碱的效应，但对于肌细胞内离子及信号传导机制尚有待于进一步研究。
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鸟苷素是1种由15个氨基酸组成的肽，是强大的内源性大肠杆菌热稳定肠毒素受体激活物(Sta)，大鼠结肠和小肠有鸟苷素mRNA的表达。我们发现束缚应激使大鼠血浆和结肠组织的鸟苷素水平明显增加。鸟苷素与其受体鸟苷素环化酶C(GC-C)结合，激活鸟苷酸环化酶，使细胞中cGMP升高，激活氯离子通道，促进肠内水及电解质的迅速分泌，肠内容物增加[6]。另一方面，促进肌膜Ca2+摄入及肌浆网释放Ca2+，使肌浆内Ca2+浓度增加，肌细胞收缩加强。由此可见，鸟苷素水平增加不仅使大鼠结肠的分泌增加，而且促进结肠的运动增加、结肠的转运速度加快。提示鸟苷素是引起束缚应激大鼠排便异常的主要原因之一，亦是内源性促动力物质之一。
曲美布汀是作用钾、钙离子通道的胃肠动力调节剂，亦是1种外周性作用的脑啡肽类似物，具有调节肠肌间神经丛非胆碱能兴奋性神经元μ、κ 和δ受体的复杂作用。通过兴奋μ、κ受体，促进跨细胞膜K+的传导增加、电压依赖性钙离子通道的传导减弱，产生调节肠运动功能[7]。本实验证实曲美布汀10-9 g/L时能缓慢增加基础状态平滑肌肌条的自律性收缩张力，而不影响其收缩幅度，可降低氯化钾、氯化钙及乙酰胆碱引起平滑肌肌条收缩的张力，显示了曲美布汀与K+、Ca2+及乙酰胆碱作用的相关性。Massaki的研究发现，曲美布汀通过抑制3种K+流(非钙依赖性钾通道、钙激活性钾通道及短暂自发性钾外向电流)，阻滞由于钾通道激活引起的Ca2+通过电压依赖性钙离子通道进入细胞内，使细胞内Ca2+浓度下降，细胞内储存Ca2+减少，同时亦抑制了细胞器内的Ca2+释放，使细胞内的Ca2+浓度保持较低水平，平滑肌的收缩受到抑制。K+流受到抑制，膜静息电位升高，肠平滑肌肌电活动增加，平滑肌细胞去极化，产生的动作电位频率增加，导致平滑肌的收缩力增加。Godfraind等[8]亦证实高浓度曲美布汀(10-8～10-9g/L)还可表现出钙离子阻滞剂样作用，且不同状态的钙离子通道与曲美布汀的亲和力不同，而表现出曲美布汀抑制和兴奋平滑肌运动的双重作用。曲美布汀这种抑制和兴奋平滑肌的双重作用与平滑肌机械运动水平、平滑肌细胞的生物电活动及药物浓度等有关。曲美布汀抑制乙酰胆碱作用的机制尚不清楚，是否影响乙酰胆碱与其受体结合，还需进一步研究。
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IBS是全球性的常见肠道疾病，本研究中的动物模型显示肠黏膜无病理组织学改变，证实IBS是一种功能性肠道疾病。迄今为止，IBS发病机制尚不清楚，基本认为肠动力学异常是产生胃肠症状的主要因素，神经体液、肽类激素调控下的肠平滑肌细胞生物电活动是导致肠运动异常的重要病理生理学基础。肠平滑肌细胞内Ca2+、K+等离子浓度水平是影响平滑肌运动的重要因素，调控离子通道的药物治疗，将是治疗IBS的主要方向。
参考文献
1，侯晓华.消化道运动学.北京：科学出版社,1998.
2，Williams CL , Villar GR, Peterson JM, et al.Sress-induced changes in intestinal transit in the rats：a model for irritable bowel syndrome.Gastroenterology, 1988， 94:611-621.
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3，Reynolds JC. Challenges in the treatment of colonic motility disorders. Am J Health. Sys Pharm, 1996,53:s17-s26.
4，Yamamoto O, Niida H, Tajma K, et al. Effect of YNS-15P：a new alpha-2 adrenoceptor antagonist on stress stimulated colonic propulsion in rats. J Pharmacol Exp Ther，1998, 287:691-696.
5，Masaaki N, Seiich K, Witte D, et al.Effects of trimebutine on K+ current in rabbit ilea smooth muscle cells. Eur J Pharmacol,1993,235:197-203.
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6，Mitchell BJ, Hawkin ,David PW.Guanylin mRNA expression in human intestine and coloretal adenocarcinoma. Lab Invest，1998,78:101-108.
7，Masaaki N, Kenji Y, Katsuo I, et al. Contribution of peripheral opioid to the trimebutine induced contraction of the proximal colon in anesthetized rats. Jpn J Smooth Muscle Res, 1989,25:27-30.
8，Godfraind T, Miller R, Wibo M, et al. Calcium antagonism and calcium entry blockade. Pharmacol Rev , 1996, 38:321-416.
(收稿日期：1999-12-02), 百拇医药