粪便幽门螺杆菌抗原测定的临床研究
作者：金牡丹 吴佳丽 周智林 汪以信 梁丽贞 李琳 郑风鸣 梁刚 朱永良
单位：金牡丹 吴佳丽 周智林 汪以信 梁丽贞 李琳 郑风鸣(杭州市第三医院内科 310009)；梁刚 朱永良(浙江医科大学附属第二医院内科)
关键词：
中华内科杂志001020 幽门螺杆菌(Hp)感染与多种胃病关系密切。已被世界卫生组织列为Ⅰ类致癌物。现已证明，治疗 Hp有助于慢性活动性胃炎、消化性溃疡的治愈，并可降低其复发率，根除Hp感染已成为治疗上述疾病的重要组成部分。目前，临床上评价Hp感染与否的方法虽较多，但均存在不足之处。粪便Hp抗原测定可用于Hp诊断[1] 。我们通过免疫动物产生Hp特异性抗体，建立了免疫胶体金斑点渗透法粪便Hp抗原测定方法，并对其临床价值予以评价。
一、对象和方法
, http://www.100md.com
1.对象：共59例，其中男32例，年龄24～56岁，女27例，年龄28～51岁。Hp诊断标准：(1)细菌培养阳性；(2)组织切片染色见到大量细菌者；(3)WS银染色、呼气试验和尿素酶试验任2项阳性者[1] 。本试验Hp感染组为组织切片染色和快速尿素酶试验均为阳性者；无Hp感染组为两者阴性者。取以上患者新鲜粪便10g，加入适量生理盐水搅拌成糊状，室温静止片刻， 以3 000r/min离心15min，收集上清液(约1～2ml)置-20℃保存备用。
2.方法：(1)鼠抗Hp抗体的制备和分离纯化按文献报道进行[2] 。(2)兔抗Hp抗体的胶体金标记用柠檬酸钠法还原金颗粒，操作同文献[2] ，颗粒直径约20 μm。(3)粪便Hp抗原的免疫胶体金法测定取鼠抗Hp抗体(10 μg/ml)5 μl吸附于硝酸纤维膜上，37℃烘干，10%小牛血清封闭后，加入200 μl粪便上清液，待彻底渗干后，加入2滴免疫胶体金溶液(约100 μl)，等渗干后，加入300 μl、pH 8.2 、0.002 mol/L的Tris盐酸缓冲液洗膜2次。结果判断：凡是硝酸纤维膜上出现明显红色斑点判为阳性，否则为阴性。每次均应设阴、阳性对照。
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二、结果
1.各组粪便Hp抗原测定：结果表明Hp阳性组粪便Hp抗原测定阳性率为80.65%(25/31)，显著高于阴性组的3.57%(1/28)(P<0.01)。粪便Hp抗原测定方法对Hp感染诊断的特异性为96.43%，敏感性为80.65%，阳性预测值为97.10%，阴性预测值为80.65%。
2.粪便Hp抗原阳性检出情况与Hp感染菌量的关系：以胃黏膜组织切片经WS银染色，根据菌数多少，分为+、++、+++并与粪便Hp抗原进行比较，阳性检出情况分别为5/7、13/16、7/8，结果示其除与+++有关外，其余二组差异不明显(P>0.05)。
讨论 迄今用于诊断Hp感染的方法可分为：(1)侵入性检查法：须与胃镜检查配合，包括快速尿素酶法，小块胃黏膜组织WS银染色法和细菌培养法等,由于Hp在胃内感染灶内分布不匀,取材部位影响结果准确性[3] ，用这种方法评价抗Hp治疗疗效时，患者因需再次胃镜检查而不易接受。(2)非侵入性检查法：包括血清Hp特异性抗体(IgG、IgM、IgA)测定和13C、14C尿素呼气试验及15N-尿氨排泄试验等。文献报道，几乎所有Hp感染均诱导产生特异性抗体，血清Hp特异性抗体测定对是否曾有Hp感染的诊断准确率较高，但由于Ig半衰期为6个月，其阳性不能肯定现有Hp感染灶的存在[4] 。13C、15N不属于放射性核素，对人体具有高度安全性，然用于检测13C、15N的质谱仪价格昂贵，难以推广使用。14C尿素呼气试验最常用，放射性核素14C半衰期为5 000余年，尽管患者在接受检查时服用剂量较微，但对其安全性仍需进一步评估。此外，13C、14C尿素呼气试验和15N-尿氨排泄试验易受药物、食物影响，检查前需停药3 d和检查时空腹[5]。最近朱永良等[4]报道血清可溶性Hp抗原测定可弥补或替代上述检查之不足。
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研究查明，Hp定居在胃黏膜上，其部分细菌和其代谢产物、死亡菌体成分可被释放进入肠道，这些成分可抵御消化酶类的降解而出现在粪便中。我们采用豚鼠、兔源多抗建立了双抗体夹心免疫胶体金粪便Hp抗原测定法。该方法灵敏度为12.5 μg/L，试验方法重复性为100%，对Hp诊断特性为96.43%，敏感性为80.65%。另外，该法操作简便，成本低廉，反应迅速，且对患者无任何创伤和不良反应，患者易接受，可作为临床诊断Hp感染的方法之一。本研究中，阳性对照组出现阴性病例，可能与Hp菌株间差异和相应抗原被降解有关，需进一步研究证实。
参考文献
1，胡伏莲，周殿元，贾博琦，主编.幽门螺杆菌感染的基础与临床.第1版. 北京：中国科学技术出版社，1997.152-154.
2，洪孝庄，孙曼霁，主编.蛋白质连接技术. 第1版.北京：中国医药科技出版社， 1993.70-81.
, 百拇医药
3，Crabtree JE . Immune and inflammatory responses to Helicobacter pylori infection. Scand J Gastroenterol Suppl，1996，7：30-40.
4，朱永良，钱可大，吴勤动，等.血清可溶性幽门螺杆菌抗原测定.中华消化杂志，1999，19:328-330.
5，Wu JC, Liu GL, Zhang ZH, et al . 15NH4+excretion test: a new method for detection of Helicobacter pylori infection . J Clin Microbiol， 1992，30:181-184.
收稿日期：2000-01-04, 百拇医药
单位：金牡丹 吴佳丽 周智林 汪以信 梁丽贞 李琳 郑风鸣(杭州市第三医院内科 310009)；梁刚 朱永良(浙江医科大学附属第二医院内科)
关键词：
中华内科杂志001020 幽门螺杆菌(Hp)感染与多种胃病关系密切。已被世界卫生组织列为Ⅰ类致癌物。现已证明，治疗 Hp有助于慢性活动性胃炎、消化性溃疡的治愈，并可降低其复发率，根除Hp感染已成为治疗上述疾病的重要组成部分。目前，临床上评价Hp感染与否的方法虽较多，但均存在不足之处。粪便Hp抗原测定可用于Hp诊断[1] 。我们通过免疫动物产生Hp特异性抗体，建立了免疫胶体金斑点渗透法粪便Hp抗原测定方法，并对其临床价值予以评价。
一、对象和方法
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1.对象：共59例，其中男32例，年龄24～56岁，女27例，年龄28～51岁。Hp诊断标准：(1)细菌培养阳性；(2)组织切片染色见到大量细菌者；(3)WS银染色、呼气试验和尿素酶试验任2项阳性者[1] 。本试验Hp感染组为组织切片染色和快速尿素酶试验均为阳性者；无Hp感染组为两者阴性者。取以上患者新鲜粪便10g，加入适量生理盐水搅拌成糊状，室温静止片刻， 以3 000r/min离心15min，收集上清液(约1～2ml)置-20℃保存备用。
2.方法：(1)鼠抗Hp抗体的制备和分离纯化按文献报道进行[2] 。(2)兔抗Hp抗体的胶体金标记用柠檬酸钠法还原金颗粒，操作同文献[2] ，颗粒直径约20 μm。(3)粪便Hp抗原的免疫胶体金法测定取鼠抗Hp抗体(10 μg/ml)5 μl吸附于硝酸纤维膜上，37℃烘干，10%小牛血清封闭后，加入200 μl粪便上清液，待彻底渗干后，加入2滴免疫胶体金溶液(约100 μl)，等渗干后，加入300 μl、pH 8.2 、0.002 mol/L的Tris盐酸缓冲液洗膜2次。结果判断：凡是硝酸纤维膜上出现明显红色斑点判为阳性，否则为阴性。每次均应设阴、阳性对照。
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二、结果
1.各组粪便Hp抗原测定：结果表明Hp阳性组粪便Hp抗原测定阳性率为80.65%(25/31)，显著高于阴性组的3.57%(1/28)(P<0.01)。粪便Hp抗原测定方法对Hp感染诊断的特异性为96.43%，敏感性为80.65%，阳性预测值为97.10%，阴性预测值为80.65%。
2.粪便Hp抗原阳性检出情况与Hp感染菌量的关系：以胃黏膜组织切片经WS银染色，根据菌数多少，分为+、++、+++并与粪便Hp抗原进行比较，阳性检出情况分别为5/7、13/16、7/8，结果示其除与+++有关外，其余二组差异不明显(P>0.05)。
讨论 迄今用于诊断Hp感染的方法可分为：(1)侵入性检查法：须与胃镜检查配合，包括快速尿素酶法，小块胃黏膜组织WS银染色法和细菌培养法等,由于Hp在胃内感染灶内分布不匀,取材部位影响结果准确性[3] ，用这种方法评价抗Hp治疗疗效时，患者因需再次胃镜检查而不易接受。(2)非侵入性检查法：包括血清Hp特异性抗体(IgG、IgM、IgA)测定和13C、14C尿素呼气试验及15N-尿氨排泄试验等。文献报道，几乎所有Hp感染均诱导产生特异性抗体，血清Hp特异性抗体测定对是否曾有Hp感染的诊断准确率较高，但由于Ig半衰期为6个月，其阳性不能肯定现有Hp感染灶的存在[4] 。13C、15N不属于放射性核素，对人体具有高度安全性，然用于检测13C、15N的质谱仪价格昂贵，难以推广使用。14C尿素呼气试验最常用，放射性核素14C半衰期为5 000余年，尽管患者在接受检查时服用剂量较微，但对其安全性仍需进一步评估。此外，13C、14C尿素呼气试验和15N-尿氨排泄试验易受药物、食物影响，检查前需停药3 d和检查时空腹[5]。最近朱永良等[4]报道血清可溶性Hp抗原测定可弥补或替代上述检查之不足。
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研究查明，Hp定居在胃黏膜上，其部分细菌和其代谢产物、死亡菌体成分可被释放进入肠道，这些成分可抵御消化酶类的降解而出现在粪便中。我们采用豚鼠、兔源多抗建立了双抗体夹心免疫胶体金粪便Hp抗原测定法。该方法灵敏度为12.5 μg/L，试验方法重复性为100%，对Hp诊断特性为96.43%，敏感性为80.65%。另外，该法操作简便，成本低廉，反应迅速，且对患者无任何创伤和不良反应，患者易接受，可作为临床诊断Hp感染的方法之一。本研究中，阳性对照组出现阴性病例，可能与Hp菌株间差异和相应抗原被降解有关，需进一步研究证实。
参考文献
1，胡伏莲，周殿元，贾博琦，主编.幽门螺杆菌感染的基础与临床.第1版. 北京：中国科学技术出版社，1997.152-154.
2，洪孝庄，孙曼霁，主编.蛋白质连接技术. 第1版.北京：中国医药科技出版社， 1993.70-81.
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3，Crabtree JE . Immune and inflammatory responses to Helicobacter pylori infection. Scand J Gastroenterol Suppl，1996，7：30-40.
4，朱永良，钱可大，吴勤动，等.血清可溶性幽门螺杆菌抗原测定.中华消化杂志，1999，19:328-330.
5，Wu JC, Liu GL, Zhang ZH, et al . 15NH4+excretion test: a new method for detection of Helicobacter pylori infection . J Clin Microbiol， 1992，30:181-184.
收稿日期：2000-01-04, 百拇医药