系膜增生性肾炎患者肾组织白细胞介素-13基因表达及其意义
作者：张肇 陈孝文 江黎明 叶锋 王建勋 吴平
单位：广东省湛江市，广东医学院附属医院肾脏病研究所 524001
关键词：
中华内科杂志001017 以往的研究表明，致炎细胞因子如白细胞介素(IL)-1、肿瘤坏死因子(TNF)等参与系膜增生性肾炎(MsPGN)的发病过程。IL-13是近年发现的一种抗炎细胞因子，其主要生物学效应是抑制单核、巨噬细胞产生致炎细胞因子。IL-13在MsPGN分子病理机制中的作用迄今国内尚未见报道。我们采用原位杂交技术 (ISH) 检测MsPGN患者肾组织内IL-13 mRNA 表达量的变化，分析MsPGN患者不同程度系膜增殖及肾小管间质病变的肾组织内IL-13 mRNA表达水平的差异，以及其与肾功能、24 h 尿蛋白排泄之间的关系，则有助于更深入了解MsPGN的发病机制。
一、 对象与方法
, http://www.100md.com
1.对象：(1) 正常对照组：4例 (男女各2例)，年龄28～45岁。肾组织来自肾结核、肾肿瘤手术远离病灶的部位，经光镜及免疫荧光检查未发现异常。(2) MsPGN组：非IgA肾病的系膜增生性肾小球肾炎16例，其中男10例，女6例，年龄16～45岁。活检前2个月内未服用激素、细胞毒药物；并排除IgA肾病、系统性红斑狼疮等继发性肾小球疾病。
MsPGN组肾脏病理特点：(1) 分为轻、中、重度系膜增生。轻度系膜增生：增生的系膜宽度不超过毛细血管直径；中度系膜增生：毛细血管直径呈轻重不等的挤压现象；重度系膜增生：系膜基质呈团块状增生，毛细血管消失。本组12例为轻度系膜增生，4 例为中度系膜增生。(2) 肾小管间质病变程度评分：视肾小管萎缩伴间质炎症细胞浸润，以及间质纤维化程度记分。无病变记0分，小灶性记1分，片灶性记2分，弥漫性记3分。本组无肾小管间质病变者5例，轻度肾小管间质病变者8例，中度肾小管间质病变者3例。
2.方法：(1)肾组织标本制备：冰冻切片厚度约为5 μm, 密封后置-70 ℃保存备用。(2)目的基因探针制备：IL-13寡核苷酸探针序列 (3′-GAC GAC CCA GAA GAG CTA CCG-5′)，用地高辛(DIG)3′-末端标记。(3)原位杂交过程：0.2 mol盐酸10 min, 1 μg/ml蛋白酶K 37 ℃消化10 min，加预杂交液 37 ℃ 2 h。IL-13标记探针浓度约为10 pmol/ml ,37 ℃杂交过夜。加入抗DIG抗体-碱性磷酸酶(AKP)复合物(1∶2 000)37 ℃ 1 h，加入显色液(NBT/BCIP)避光4～6 h后终止反应。1%中性红复染1 min。(4)阴性对照： 杂交液中不含标记IL-13探针,杂交后不加抗DIG-AKP复合物,肾组织事先经RNA酶(浓度0.5 mg/ml)处理。 IL-13 mRNA 表达阳性信号：在细胞浆内呈紫蓝色或深蓝色点状或环条状分布。(5)计算机图像定量分析：图像分析仪计算区域内吸光度值(A),再减去背景吸光度值。平均吸光度值越大， IL-13 mRNA表达量越多。(6)统计学处理： 组间差异用t 检验，两个变量间的相互关系应用直线相关分析。P<0.05为有统计学意义。
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二、结果
1.正常对照组：肾组织内未见明显IL-13 mRNA表达，见图1。
2.中度系膜增生组：肾小管间质区IL-13 mRNA 表达量较轻度系膜增生组增高(P<0.05)，但此两组患者肾小球区IL-13 mRNA表达量差异无显著性(P>0.05)。
3.中度肾小管间质病变组：肾小管间质区IL-13 mRNA 表达量明显增高(P<0.05),见图2。
4.直线相关分析结果显示，MsPGN组患者肾小管间质区IL-13 mRNA 表达水平与血肌酐浓度及24 h 尿蛋白排泄量呈正相关，与肌酐清除率呈负相关(r分别为0.515、0.725和-0.607, P<0.05)。
讨论 研究发现，肾小管间质病变程度直接影响MsPGN系膜增殖程度及肾生存率。单核、巨噬细胞是MsPGN肾间质浸润的主要炎症细胞，释放大量活性致炎细胞因子，诱导肾小管上皮细胞MHC Ⅱ类抗原表达并与T细胞相互作用， 造成肾小管间质持续自体免疫损伤。本组结果显示，中度系膜增生MsPGN患者肾小管间质区IL-13 mRNA表达量较轻度系膜增生组高，提示可能由于系膜区炎症反应性增高，启动了相应的抗炎机制，导致IL-13抗炎细胞分泌增加,其机制似通过下调致炎细胞因子的表达，加强IL-1受体拮抗剂的合成，阻断由IL-1等所致肾组织炎症损害[1]。有研究表明，经激素治疗后尿蛋白转阴2周的肾病综合征患者，其外周血单个核细胞中IL-13 mRNA 表达量及蛋白水平明显低于治疗前,说明皮质激素不但减少致炎细胞因子的产生，同时抗炎细胞因子IL-13亦相应减少[2]。本组结果还显示，MsPGN患者肾小管间质如为轻度～中度病变， 其肾小管间质区IL-13 mRNA表达量增高，并与肾功能和尿蛋白排泄量相关。大量蛋白尿除了对肾小管上皮细胞有直接的损害作用外，还间接引起肾小管间质内单核巨噬细胞浸润，产生大量趋化因子， 促进ICAM-1等黏附分子的表达及单核细胞向系膜区迁移, 引起迟发性超敏反应，导致肾小球系膜细胞及基质增殖[3]。IL-13分泌增加可能通过抑制趋化因子所致的T淋巴细胞趋化运动,使炎症及免疫损伤区域局限, 同时IL-13还可抑制Th1细胞分化,减少IL-12及IFN-α的产生, 强烈抑制迟发性超敏反应[4]。综上所述，MsPGN患者肾小管间质区IL-13 mRNA表达水平与肾小管间质病理损害程度及肾功能变化密切相关。IL-13 基因表达可能参与MsPGN的发病机制。
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图1 正常对组肾组织内未见明显IL-13mRNA表达
图2 中度肾小管间质病变MsPGN肾小管间质区IL-13mRNA大量表达，图1，2均为ISH×400
基金项目: 广东省医学科学技术研究基金资助项目(A1999465)
参考文献
1，Janson RW, Hance KR, Arend WP, et al. Production of Interleukin-1 receptor antagonist by human in vitro derived macrophages. Immunol,1991,147: 4218-4222.
2，张爱华,陈荣华,吴元俊,等. 肾病综合征患儿白细胞介素-13 表达与病理形态的关系.肾脏病与透析肾移植杂志,1999,8:429-431.
, 百拇医药
3，Markovic-Lipkovski J, Muller CA, Risler T, et al. Association of glomerular and interstitial mononuclearleucocytes with different forms of glomerulonephritis. Nephrol Dial Transplant,1990,5:10-17.
4，Woods JM, Haines GK,Shah MR, et al. Low-level production of interleukin- 13 in synovial fluid and tissue from patients with arthyitis. Clin Immuno Immunopath, 1997,85:210-220.
收稿日期：1999-12-23, 百拇医药
单位：广东省湛江市，广东医学院附属医院肾脏病研究所 524001
关键词：
中华内科杂志001017 以往的研究表明，致炎细胞因子如白细胞介素(IL)-1、肿瘤坏死因子(TNF)等参与系膜增生性肾炎(MsPGN)的发病过程。IL-13是近年发现的一种抗炎细胞因子，其主要生物学效应是抑制单核、巨噬细胞产生致炎细胞因子。IL-13在MsPGN分子病理机制中的作用迄今国内尚未见报道。我们采用原位杂交技术 (ISH) 检测MsPGN患者肾组织内IL-13 mRNA 表达量的变化，分析MsPGN患者不同程度系膜增殖及肾小管间质病变的肾组织内IL-13 mRNA表达水平的差异，以及其与肾功能、24 h 尿蛋白排泄之间的关系，则有助于更深入了解MsPGN的发病机制。
一、 对象与方法
, http://www.100md.com
1.对象：(1) 正常对照组：4例 (男女各2例)，年龄28～45岁。肾组织来自肾结核、肾肿瘤手术远离病灶的部位，经光镜及免疫荧光检查未发现异常。(2) MsPGN组：非IgA肾病的系膜增生性肾小球肾炎16例，其中男10例，女6例，年龄16～45岁。活检前2个月内未服用激素、细胞毒药物；并排除IgA肾病、系统性红斑狼疮等继发性肾小球疾病。
MsPGN组肾脏病理特点：(1) 分为轻、中、重度系膜增生。轻度系膜增生：增生的系膜宽度不超过毛细血管直径；中度系膜增生：毛细血管直径呈轻重不等的挤压现象；重度系膜增生：系膜基质呈团块状增生，毛细血管消失。本组12例为轻度系膜增生，4 例为中度系膜增生。(2) 肾小管间质病变程度评分：视肾小管萎缩伴间质炎症细胞浸润，以及间质纤维化程度记分。无病变记0分，小灶性记1分，片灶性记2分，弥漫性记3分。本组无肾小管间质病变者5例，轻度肾小管间质病变者8例，中度肾小管间质病变者3例。
2.方法：(1)肾组织标本制备：冰冻切片厚度约为5 μm, 密封后置-70 ℃保存备用。(2)目的基因探针制备：IL-13寡核苷酸探针序列 (3′-GAC GAC CCA GAA GAG CTA CCG-5′)，用地高辛(DIG)3′-末端标记。(3)原位杂交过程：0.2 mol盐酸10 min, 1 μg/ml蛋白酶K 37 ℃消化10 min，加预杂交液 37 ℃ 2 h。IL-13标记探针浓度约为10 pmol/ml ,37 ℃杂交过夜。加入抗DIG抗体-碱性磷酸酶(AKP)复合物(1∶2 000)37 ℃ 1 h，加入显色液(NBT/BCIP)避光4～6 h后终止反应。1%中性红复染1 min。(4)阴性对照： 杂交液中不含标记IL-13探针,杂交后不加抗DIG-AKP复合物,肾组织事先经RNA酶(浓度0.5 mg/ml)处理。 IL-13 mRNA 表达阳性信号：在细胞浆内呈紫蓝色或深蓝色点状或环条状分布。(5)计算机图像定量分析：图像分析仪计算区域内吸光度值(A),再减去背景吸光度值。平均吸光度值越大， IL-13 mRNA表达量越多。(6)统计学处理： 组间差异用t 检验，两个变量间的相互关系应用直线相关分析。P<0.05为有统计学意义。
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二、结果
1.正常对照组：肾组织内未见明显IL-13 mRNA表达，见图1。
2.中度系膜增生组：肾小管间质区IL-13 mRNA 表达量较轻度系膜增生组增高(P<0.05)，但此两组患者肾小球区IL-13 mRNA表达量差异无显著性(P>0.05)。
3.中度肾小管间质病变组：肾小管间质区IL-13 mRNA 表达量明显增高(P<0.05),见图2。
4.直线相关分析结果显示，MsPGN组患者肾小管间质区IL-13 mRNA 表达水平与血肌酐浓度及24 h 尿蛋白排泄量呈正相关，与肌酐清除率呈负相关(r分别为0.515、0.725和-0.607, P<0.05)。
讨论 研究发现，肾小管间质病变程度直接影响MsPGN系膜增殖程度及肾生存率。单核、巨噬细胞是MsPGN肾间质浸润的主要炎症细胞，释放大量活性致炎细胞因子，诱导肾小管上皮细胞MHC Ⅱ类抗原表达并与T细胞相互作用， 造成肾小管间质持续自体免疫损伤。本组结果显示，中度系膜增生MsPGN患者肾小管间质区IL-13 mRNA表达量较轻度系膜增生组高，提示可能由于系膜区炎症反应性增高，启动了相应的抗炎机制，导致IL-13抗炎细胞分泌增加,其机制似通过下调致炎细胞因子的表达，加强IL-1受体拮抗剂的合成，阻断由IL-1等所致肾组织炎症损害[1]。有研究表明，经激素治疗后尿蛋白转阴2周的肾病综合征患者，其外周血单个核细胞中IL-13 mRNA 表达量及蛋白水平明显低于治疗前,说明皮质激素不但减少致炎细胞因子的产生，同时抗炎细胞因子IL-13亦相应减少[2]。本组结果还显示，MsPGN患者肾小管间质如为轻度～中度病变， 其肾小管间质区IL-13 mRNA表达量增高，并与肾功能和尿蛋白排泄量相关。大量蛋白尿除了对肾小管上皮细胞有直接的损害作用外，还间接引起肾小管间质内单核巨噬细胞浸润，产生大量趋化因子， 促进ICAM-1等黏附分子的表达及单核细胞向系膜区迁移, 引起迟发性超敏反应，导致肾小球系膜细胞及基质增殖[3]。IL-13分泌增加可能通过抑制趋化因子所致的T淋巴细胞趋化运动,使炎症及免疫损伤区域局限, 同时IL-13还可抑制Th1细胞分化,减少IL-12及IFN-α的产生, 强烈抑制迟发性超敏反应[4]。综上所述，MsPGN患者肾小管间质区IL-13 mRNA表达水平与肾小管间质病理损害程度及肾功能变化密切相关。IL-13 基因表达可能参与MsPGN的发病机制。
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图1 正常对组肾组织内未见明显IL-13mRNA表达
图2 中度肾小管间质病变MsPGN肾小管间质区IL-13mRNA大量表达，图1，2均为ISH×400
基金项目: 广东省医学科学技术研究基金资助项目(A1999465)
参考文献
1，Janson RW, Hance KR, Arend WP, et al. Production of Interleukin-1 receptor antagonist by human in vitro derived macrophages. Immunol,1991,147: 4218-4222.
2，张爱华,陈荣华,吴元俊,等. 肾病综合征患儿白细胞介素-13 表达与病理形态的关系.肾脏病与透析肾移植杂志,1999,8:429-431.
, 百拇医药
3，Markovic-Lipkovski J, Muller CA, Risler T, et al. Association of glomerular and interstitial mononuclearleucocytes with different forms of glomerulonephritis. Nephrol Dial Transplant,1990,5:10-17.
4，Woods JM, Haines GK,Shah MR, et al. Low-level production of interleukin- 13 in synovial fluid and tissue from patients with arthyitis. Clin Immuno Immunopath, 1997,85:210-220.
收稿日期：1999-12-23, 百拇医药