类风湿关节炎患者滑膜、滑液和血浆中PAI的检测及其临床意义
作者：杨春花 黄烽
单位：杨春花(北京，解放军总医院风湿科 100853)；黄烽(北京，解放军总医院风湿科 100853)
关键词：关节炎，类风湿；纤溶酶原激活物抑制剂；免疫组织化学
中华内科杂志001012 【摘要】 目的 检测Ⅰ型和Ⅱ型纤溶酶原激活物抑制剂(PAI-1和PAI-2)在类风湿关节炎(RA)患者滑膜组织中的定位和表达，同时测定RA患者滑液和血浆中PAI-1的含量和活性，并分析其临床意义。方法 运用免疫组织化学方法检测了24例RA、18例骨关节炎(OA)和6例正常滑膜组织中PAI-1和PAI-2的定位及其表达；采用ELISA双抗体夹心法测定46例RA和8例OA患者血浆、14例RA滑液和12例正常对照血浆中PAI-1的含量和活性。结果 24例RA滑膜组织，全部呈PAI-1阳性染色，8例呈PAI-2阳性染色,阳性细胞主要定位在滑膜衬里层；18例OA中，9例呈PAI-1阳性染色，阳性细胞分布部位类似于RA,未检出PAI-2阳性信号；6例正常滑膜组织中均未检测到PAI-1和PAI-2阳性染色。RA患者滑液中PAI-1的含量和活性显著高于其自身血浆(P<0.001和P<0.05)；而RA患者血浆中PAI-1的含量及活性亦明显高于OA组(P<0.05， P<0.000 1)和正常对照组(P<0.000 1， P<0.001)；并且RA患者滑液和血浆中PAI-1的含量和活性与RA患者病情活动指标呈正相关。结论 PAI-1和PAI-2在RA滑膜组织中表达增高，其中PAI-1增高更显著，PAI-1在RA滑液和血浆中的含量和活性均明显高于OA和正常对照组，且与RA 病情密切相关，说明PAI、尤其是PAI-1在RA的发病过程中起着重要作用。
, 百拇医药
Detection and significance of plasminogen activator inhibitor in synovial tissue，synovial fluid and plasma from patients with rheumatoid arthritis
YANG Chunhua HUANG Feng
(General Hospital of PLA, Beijing 100853, China)
【Abstract】 Objective To study the distribution and expression of type-1 plasminogen activator inhibitor(PAI-1) and type-2 plasminogen activator inhibitor (PAI-2) in synovial tissue from rheumatoid arthritis(RA) and measure the antigen levels and activity in synovial fluid and plasma of patients with RA. Methods Immuno-histochemical analysis was used to detect PAI-1 and PAI-2 expression and distribution in synovial tissue from 24 RA patients, 18 osteoarthritis (OA) patients and 6 normal subjects. PAI-1 and PAI-2 antigen concentration and activity were determined with ELISA sandwich method. Results In RA patients, positive staining of PAI-1 and PAI-2 was seen respectively in all the 24 cases and 8 of the 24cases; positive expression was distributed mainly in the synovial lining area. In OA patients, positive staining of PAI-1 was detected in 8 cases and its positive distribution was similar to that in RA. No PAI-2 positive staining was seen in all the OA cases. In 6 normal subjects with normal synovial tissue,the staining was negative. The concentration and activity of PAI-1 in RA synovial fluid(SF) were significantly higher than those in the plasma(P<0.001and P<0.05). The concentration and activity of PAI-1 in the plasma of RA were also much higher than those in the plasma of OA(P<0.05 and P<0.000 1)and healthy subjects(P<0.000 1and P<0.001). The concentration and activity of PAI-1 in SF and plasma of RA correlated positively. Conclusion The up-regulated expression of PAI-1 and PAI-2 and the concentration and activity of PAI-1 in SF and plasma were significantly higher in RA than those in OA and healthy subjects, suggesting PAI especially PAI-1 may play an important role in the pathogenesis of RA.
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【Key words】 Arthritis，rheumatoid； Plasminogen activator inhibitor； Immunohistochemistry
组织型纤溶酶原激活物(tPA)和尿激酶型纤溶酶原激活物 (uPA)可使纤溶酶原转变为纤溶酶，降解细胞外基质和基底膜成分，参与纤溶、炎症、细胞迁移、排卵、肿瘤浸润和转移等许多生理和病理过程。Ⅰ型纤溶酶原激活物抑制剂(PAI-1)是这两者主要的快速作用的抑制剂，它能抑制纤溶酶原激活物(PA)介导的纤溶活性，被认为是体内最重要的纤溶活性调节者，因而PAI-1在类风湿关节炎(RA)等炎症及肿瘤组织中的表达和含量备受关注[1，2]。我们检测了RA患者滑膜、滑液和血浆中PAI-1的定位、定量和活性，并结合临床资料分析了PAI-1与RA患者病情活动的关系，探讨了利用这一方法对RA进行诊断和预后分析的可能性。
材料和方法
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1.标本采取：24例RA滑膜组织均取自解放军总医院手术切除标本，经常规甲醛固定，石蜡包埋。6例正常滑膜组织均取自无关节病变的截肢患者。46例RA患者血浆，其中14例合并收集同一患者滑液及8例骨关节炎(OA)患者血浆均取自解放军总医院住院患者。14例正常对照血浆取自解放军总医院输血科无血缘关系的健康献血员。分别抽取上述RA患者及正常人静脉血，并于同一天抽吸RA患者滑液，在30 min内置4℃冷冻离心15 min，在所有吸取血浆和滑液上清中均加入1/10的0.13 mol/L枸橼酸钠抗凝，-80℃保存备用。所有RA诊断均符合美国风湿病协会1987年制订的RA诊断标准。OA诊断均符合1991年Altman[3]诊断标准。
2.免疫组织化学检测：PAI-1鼠单克隆抗体和PAI-2兔多克隆抗体购自上海医科大学分子遗传学研究室。过氧化物酶标记的链霉卵白素(SP)染色试剂盒为美国ZYMED公司产品。采用SP免疫组织化学技术检测。染色步骤：石蜡切片常规脱蜡，10%的正常羊血清室温封闭20 min，依次加入一抗，生物素标记的二抗，辣根过氧化物酶标记的SP，DAB-H2O2显色溶液，苏木素复染，中性树脂胶封片，显微镜下观察结果。每个步骤间用PBS冲洗5 min×3次。每份标本设立阴性对照：(1)分别用PBS代替一抗、二抗和辣根过氧化物酶标记的SP，其余步骤不变；(2)正常滑膜石蜡切片同步进行染色。结果判定在高倍显微镜下进行。结果判断：凡细胞浆中出现明显的棕色或棕黄色颗粒为PAI-1或PAI-2蛋白阳性细胞。在RA和OA中，根据阳性细胞占全部细胞的比例分为：(-)：无阳性细胞或阳性细胞数<10%；(+)：阳性细胞占10%～40%；(++)：阳性细胞超过40%～70%；(+++)：阳性细胞>70%。
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3.PAI-1含量测定：ELISA试剂盒购自比利时INNOGENETICS公司，完全按照试剂盒提供的操作流程进行。
4.PAI-1活性测定：PAI-1活性测定试剂盒购自上海医科大学分子遗传学研究室，完全根据试剂盒说明书进行。
5.统计学处理：实验结果以平均数±标准差(
±s)表示。两组之间计量资料的比较采用t检验；以直线相关回归方法检验结果的相关性。计算机软件用美国CRC发行的Stata软件(4.0)。检验水准α=0.05。
结果
1. RA、OA患者和对照组的一般资料：见表1。
2. PAI-1免疫组化结果： 24例RA滑膜组织中，全部检出PAI-1阳性染色，其中(+++)17例，(++)5例，(+)2例；检出8例PAI-2阳性染色，(+++)1例，(++)5例，(+)2例，(-)16例。 PAI-1和PAI-2蛋白阳性细胞主要分布在滑膜衬里层和滑膜下层，其中滑膜衬里细胞、巨噬细胞样细胞、单核细胞和部分浸润的浆细胞胞浆中呈明显的阳性染色；大部分滑膜下层的小血管内皮细胞亦呈阳性染色。18例OA中，9例呈PAI-1阳性反应，分别为(+++)2例，(++)2例，(+)5例，(-)9例，阳性细胞分布部位类似于RA；未检出PAI-2阳性反应。6例正常滑膜组织中均未检测到PAI-1和PAI-2阳性染色。
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表1 RA、OA患者和正常对照组临床和实验室资料比较(±s) 项目
RA(46例)
OA(8例)
正常组(14例)
性别(女/男)
35/11
5/3
4/10
年龄(岁)
46.59±
16.33
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58.46±
38.32
27.23±
20.42
病程(年)
7.52±
7.91
10.44±
7.42
-
血沉(mm/1h)
50.38±
29.09
, 百拇医药
9.50±
7.58
-
C反应蛋白(mg/L)
39.0 ±
43.3
6.1 ±
4.4
-
血小板(×109/L)
279.39±
79.08
, 百拇医药
200.39±
75.84
178.21±
88.65
类风湿因子(IU/ml)
172.05±
203.10
<20
-
3. 各组样品中PAI-1抗原含量和PAI-1活性测定结果：见表2。
4. PAI-1含量与RA病情活动的关系：见表3。表2 RA、OA和正常组血浆和滑液中PAI-1含量及活性测定结果比较(±s) 组别
, 百拇医药
例数
标本
PAI-1含量(μg/L)
P值
PAI-1活性
(IU/mg)
P值
RA
14
滑液
83.97±
19.77
-
, 百拇医药
11.50±
0.70
-
RA
46
血浆
59.92±27.13*
0.004 2
9.97±
2.18*
0.013
OA
, 百拇医药
8
血浆
38.60±10.86**
0.029 1
5.26±
3.0**
0.000 1
正常组
12
血浆
30.53±
12.64△
, 百拇医药
0.000 4
7.81±
2.93△
0.003 3
注：* RA滑液组与自身血浆对比；** RA血浆与OA血浆对比；△RA血浆与正常对照组对比表3 血浆和滑液中PAI-1含量与反映RA病情活动的血液学指标的相关性比较 组别
血浆(46例)
滑液(14例)
相关系数
P值
相关系数
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P值
ESR
0.145 4
0.739
0.543 1
0.868
CRP
0.318 4
0.109
0.517 5
0.027
RF
0.203 4
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0.396
0.694 2
<0.001
PLT
0.089 2
0.836
0.212 1
0.055
讨论 uPA通过与细胞膜上的uPAR专一性结合后，直接降解细胞外基质。uPA活性也受到多种物质的抑制性调节，其中包括uPA的生理性抑制剂 PAI-1，2，3和PN(proteinase nexin)。PAI-1和PAI-2是正常人血浆中PA的主要抑制剂，其中PAI-1的作用更为重要。PAI-1是一种由379个氨基酸组成的糖蛋白，分子量约50 000，PAI-1能快速与tPA和uPA结合，抑制它们的活性，是人体纤溶系统中主要的调节因子。关节滑膜成纤维细胞、软骨细胞、内皮细胞、单核细胞和多形核白细胞均能合成uPA、PAI-1和PAI-2，正常情况下，这些细胞可能主要负责在局部产生uPA和PAI，维持整个uPA系统的平衡，但在关节炎等病理情况下其详细的作用机制和涉及的成分还很不清楚[4，5]。在本研究中，我们主要检测了PAI-1和PAI-2在RA滑膜组织中的定位和分布以及定量分析了PAI-1在RA患者滑液、血浆中的含量和活性，并同时与OA患者和正常对照组进行比较，分析PAI在关节炎中可能发挥的作用。
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免疫组化结果显示，所有RA滑膜组织中均检出了PAI-1的阳性染色、8例检出了PAI-2阳性染色，PAI-1和PAI-2的强染色信号主要分布在RA患者的滑膜衬里层；在OA患者，只在少数病例检测到相对弱的PAI-1阳性染色，OA和正常滑膜组织中均未检出PAI-2的阳性染色。由此可见，PAI-1和PAI-2主要分布在增殖和侵袭性生长的滑膜组织，以适应这部分组织同时表达增强的uPA和uPAR，PAI-1对滑膜组织的侵袭性具有重要的调节作用，这种调节作用的可能途径是：PAI-1与uPA和uPAR结合形成复合物，滑膜细胞等对复合物产生内吞效应，使uPA在溶酶体中降解，而uPAR被再循环至细胞表面，此过程可调节uPA分泌的变化，调节uPAR在细胞的表达，PAI-1通过此途径促进滑膜细胞表面纤溶酶激活机制而产生功能性循环的作用，导致关节炎症情况下，细胞外基质成分的不断降解，最终是关节软骨和骨组织受到侵袭和破坏，使关节炎患者丧失关节的正常功能。因此，临床上如能有效地抑制关节局部滑膜组织中PAI-1的表达，切断滑膜细胞表面纤溶酶激活机制，从而能有效控制关节炎的破坏性，改善病人预后。
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为进一步明确PAI-1在RA炎性破坏中的作用，我们还利用ELISA方法定量将RA与OA患者及健康献血员血浆中PAI-1的含量和活性进行了比较。结果显示，RA患者血浆中PAI-1的含量和活性均显著高于OA组(P值均<0.05)和正常对照组(P<0.01和P<0.05)，这与Ronday等[6]报道的14例RA患者血浆中PAI-1含量高于OA的结果相一致。在本研究中，我们还同时比较了RA患者自身的滑液和血浆中PAI-1抗原含量和活性，结果是滑液中PAI-1抗原含量和活性均显著高于其自身血浆(P<0.001和P<0.05)，RA患者滑液与血浆中PAI-1抗原含量的差异，一方面可能与关节局部滑膜成纤维细胞、软骨细胞、单核/巨噬细胞和内皮细胞均能分泌PAI-1有关；另一方面是PAI-1的产生还受体内多种炎性细胞因子包括白细胞介素(IL)-1、IL-6、肿瘤坏死因子α和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)等的调节，这些细胞因子的局部调节影响PAI-1的产生[7，8]。此外，通过多元回归分析还发现，RA患者滑液和血浆中PAI-1的含量与通常临床上用来反映RA患者病情活动的指标血沉、C反应蛋白(CRP)、类风湿因子(RF)、血小板均存在一定的相关性，其中滑液中PAI-1的含量与血浆中检测得到的RF和CRP的相关性均达到了显著性意义(P<0.001和P<0.05)，这一重要结果提示，可将PAI-1作为反映RA病情的另一有用指标而用于临床。
, 百拇医药
我们从定量和定性两方面均证实了RA滑膜、滑液和血浆中的PAI、尤其是PAI-1的表达高于OA患者和正常对照组，这种PAI在RA中表达的上调，提示在RA发生、发展过程中可能存在着一种PAI-1的激活机制。实际上，PAI-1的表达水平在多种恶性组织中明显升高，在乳腺癌患者中已作为诊断与预后判断的指标[9，10] 。此外，RA中PAI-1或许有独立于uPA之外的功能，如报道PAI-1参与血管的生成调节，这也可能是PAI-1升高与RA滑膜细胞类肿瘤细胞样高度增殖具有紧密相关性的原因之一。目前的研究发现RA有很多方面类似于局限侵袭性生长的恶性肿瘤：滑膜细胞高度增生并伴有大量淋巴细胞浸润以形成血管翳、细胞之间不表现出接触抑制、血管翳向邻近软骨和骨组织侵袭，这种作用类似于肿瘤细胞分泌多种蛋白酶降解细胞外基质引起肿瘤的侵袭和转移。在OA的研究中尚未有类似的发现，这可能与PAI在RA、OA两种疾病中表达的差异有关，其详细的机制还在探讨之中。
总之，RA患者滑膜、滑液和血浆中的PAI，尤其是PAI-1的表达水平与RA患者病情活动密切相关，其可作为临床上反映RA病情的有用指标，但至于PAI-1能否象在乳腺癌患者中作为诊断与判断预后的指标而应用于RA的临床实践中，则还需更多的探索和更完善的检测手段。
, 百拇医药
基金项目：军队“九五”医药卫生科研基金资助项目(98Q098)
参考文献
1，Daneri NA，Macias LG, Oceguera VA, et al. Urokinase-type plasminogen activator and plasminogen activator inhibitors (PAI-1 and PAI-2) in extracts of invasive cervical carcinoma and precursor lesions. Eur J Cancer，1998,34: 566-569.
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3，Altman RD. Criteria for classification of clinical osteoarthritis. J Rheumatol，1991,18:10-12.
4，Cevinic MM, Generini S, Partsch G, et al. Synoviocytes from osteoarthritis and rheumatoid arthritis produce plasminogen activators and plasminogen activator inhibitor-1 and display u-PA receptors on their surface. Life Sci,1998，63:441-453.
5，Ronday HK，Smits HH，Quax PH，et al. Bone matrix degradation by the plasminogen activation system. Possible mechanism of bone destruction in arthritis.Br J Rheumatol，1997，36：9-15.
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6，Ronday HK，Smits HH，Van-Muijen GH， et al. Difference in expression of the plasminogen activation system in synovial tissue of patients with rheumatoid arthritis and osteoarthritis. Br J Rheumatol，1996，35：416-423.
7，Campell IK, Last K, Novak U, et al. Recombinant human interleukin-1 inhibits plasminogen activator inhibitor-1(PAI-1) production by human articular cartilage and chondrocytes. Biochem Biophys Res Commun, 1991,174:251-257.
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9，Cho JY, Chung HC, Noh SH, et al. High level of urokinase-type plasminogen activator is a new prognostic marker in patients with gastric carcinoma. Cancer ，1997， 79: 878-883.
10，Knoop A, Andreasen PA, Andersen H, et al. Prognostic significance of urokinase-type plasminogen activator and plasminogen activator inhibitor-1 in primary breast cancer. Br J Cancer， 1998, 77: 932-940.
收稿日期：2000-01-04, 百拇医药
单位：杨春花(北京，解放军总医院风湿科 100853)；黄烽(北京，解放军总医院风湿科 100853)
关键词：关节炎，类风湿；纤溶酶原激活物抑制剂；免疫组织化学
中华内科杂志001012 【摘要】 目的 检测Ⅰ型和Ⅱ型纤溶酶原激活物抑制剂(PAI-1和PAI-2)在类风湿关节炎(RA)患者滑膜组织中的定位和表达，同时测定RA患者滑液和血浆中PAI-1的含量和活性，并分析其临床意义。方法 运用免疫组织化学方法检测了24例RA、18例骨关节炎(OA)和6例正常滑膜组织中PAI-1和PAI-2的定位及其表达；采用ELISA双抗体夹心法测定46例RA和8例OA患者血浆、14例RA滑液和12例正常对照血浆中PAI-1的含量和活性。结果 24例RA滑膜组织，全部呈PAI-1阳性染色，8例呈PAI-2阳性染色,阳性细胞主要定位在滑膜衬里层；18例OA中，9例呈PAI-1阳性染色，阳性细胞分布部位类似于RA,未检出PAI-2阳性信号；6例正常滑膜组织中均未检测到PAI-1和PAI-2阳性染色。RA患者滑液中PAI-1的含量和活性显著高于其自身血浆(P<0.001和P<0.05)；而RA患者血浆中PAI-1的含量及活性亦明显高于OA组(P<0.05， P<0.000 1)和正常对照组(P<0.000 1， P<0.001)；并且RA患者滑液和血浆中PAI-1的含量和活性与RA患者病情活动指标呈正相关。结论 PAI-1和PAI-2在RA滑膜组织中表达增高，其中PAI-1增高更显著，PAI-1在RA滑液和血浆中的含量和活性均明显高于OA和正常对照组，且与RA 病情密切相关，说明PAI、尤其是PAI-1在RA的发病过程中起着重要作用。
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Detection and significance of plasminogen activator inhibitor in synovial tissue，synovial fluid and plasma from patients with rheumatoid arthritis
YANG Chunhua HUANG Feng
(General Hospital of PLA, Beijing 100853, China)
【Abstract】 Objective To study the distribution and expression of type-1 plasminogen activator inhibitor(PAI-1) and type-2 plasminogen activator inhibitor (PAI-2) in synovial tissue from rheumatoid arthritis(RA) and measure the antigen levels and activity in synovial fluid and plasma of patients with RA. Methods Immuno-histochemical analysis was used to detect PAI-1 and PAI-2 expression and distribution in synovial tissue from 24 RA patients, 18 osteoarthritis (OA) patients and 6 normal subjects. PAI-1 and PAI-2 antigen concentration and activity were determined with ELISA sandwich method. Results In RA patients, positive staining of PAI-1 and PAI-2 was seen respectively in all the 24 cases and 8 of the 24cases; positive expression was distributed mainly in the synovial lining area. In OA patients, positive staining of PAI-1 was detected in 8 cases and its positive distribution was similar to that in RA. No PAI-2 positive staining was seen in all the OA cases. In 6 normal subjects with normal synovial tissue,the staining was negative. The concentration and activity of PAI-1 in RA synovial fluid(SF) were significantly higher than those in the plasma(P<0.001and P<0.05). The concentration and activity of PAI-1 in the plasma of RA were also much higher than those in the plasma of OA(P<0.05 and P<0.000 1)and healthy subjects(P<0.000 1and P<0.001). The concentration and activity of PAI-1 in SF and plasma of RA correlated positively. Conclusion The up-regulated expression of PAI-1 and PAI-2 and the concentration and activity of PAI-1 in SF and plasma were significantly higher in RA than those in OA and healthy subjects, suggesting PAI especially PAI-1 may play an important role in the pathogenesis of RA.
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【Key words】 Arthritis，rheumatoid； Plasminogen activator inhibitor； Immunohistochemistry
组织型纤溶酶原激活物(tPA)和尿激酶型纤溶酶原激活物 (uPA)可使纤溶酶原转变为纤溶酶，降解细胞外基质和基底膜成分，参与纤溶、炎症、细胞迁移、排卵、肿瘤浸润和转移等许多生理和病理过程。Ⅰ型纤溶酶原激活物抑制剂(PAI-1)是这两者主要的快速作用的抑制剂，它能抑制纤溶酶原激活物(PA)介导的纤溶活性，被认为是体内最重要的纤溶活性调节者，因而PAI-1在类风湿关节炎(RA)等炎症及肿瘤组织中的表达和含量备受关注[1，2]。我们检测了RA患者滑膜、滑液和血浆中PAI-1的定位、定量和活性，并结合临床资料分析了PAI-1与RA患者病情活动的关系，探讨了利用这一方法对RA进行诊断和预后分析的可能性。
材料和方法
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1.标本采取：24例RA滑膜组织均取自解放军总医院手术切除标本，经常规甲醛固定，石蜡包埋。6例正常滑膜组织均取自无关节病变的截肢患者。46例RA患者血浆，其中14例合并收集同一患者滑液及8例骨关节炎(OA)患者血浆均取自解放军总医院住院患者。14例正常对照血浆取自解放军总医院输血科无血缘关系的健康献血员。分别抽取上述RA患者及正常人静脉血，并于同一天抽吸RA患者滑液，在30 min内置4℃冷冻离心15 min，在所有吸取血浆和滑液上清中均加入1/10的0.13 mol/L枸橼酸钠抗凝，-80℃保存备用。所有RA诊断均符合美国风湿病协会1987年制订的RA诊断标准。OA诊断均符合1991年Altman[3]诊断标准。
2.免疫组织化学检测：PAI-1鼠单克隆抗体和PAI-2兔多克隆抗体购自上海医科大学分子遗传学研究室。过氧化物酶标记的链霉卵白素(SP)染色试剂盒为美国ZYMED公司产品。采用SP免疫组织化学技术检测。染色步骤：石蜡切片常规脱蜡，10%的正常羊血清室温封闭20 min，依次加入一抗，生物素标记的二抗，辣根过氧化物酶标记的SP，DAB-H2O2显色溶液，苏木素复染，中性树脂胶封片，显微镜下观察结果。每个步骤间用PBS冲洗5 min×3次。每份标本设立阴性对照：(1)分别用PBS代替一抗、二抗和辣根过氧化物酶标记的SP，其余步骤不变；(2)正常滑膜石蜡切片同步进行染色。结果判定在高倍显微镜下进行。结果判断：凡细胞浆中出现明显的棕色或棕黄色颗粒为PAI-1或PAI-2蛋白阳性细胞。在RA和OA中，根据阳性细胞占全部细胞的比例分为：(-)：无阳性细胞或阳性细胞数<10%；(+)：阳性细胞占10%～40%；(++)：阳性细胞超过40%～70%；(+++)：阳性细胞>70%。
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3.PAI-1含量测定：ELISA试剂盒购自比利时INNOGENETICS公司，完全按照试剂盒提供的操作流程进行。
4.PAI-1活性测定：PAI-1活性测定试剂盒购自上海医科大学分子遗传学研究室，完全根据试剂盒说明书进行。
5.统计学处理：实验结果以平均数±标准差(
±s)表示。两组之间计量资料的比较采用t检验；以直线相关回归方法检验结果的相关性。计算机软件用美国CRC发行的Stata软件(4.0)。检验水准α=0.05。结果
1. RA、OA患者和对照组的一般资料：见表1。
2. PAI-1免疫组化结果： 24例RA滑膜组织中，全部检出PAI-1阳性染色，其中(+++)17例，(++)5例，(+)2例；检出8例PAI-2阳性染色，(+++)1例，(++)5例，(+)2例，(-)16例。 PAI-1和PAI-2蛋白阳性细胞主要分布在滑膜衬里层和滑膜下层，其中滑膜衬里细胞、巨噬细胞样细胞、单核细胞和部分浸润的浆细胞胞浆中呈明显的阳性染色；大部分滑膜下层的小血管内皮细胞亦呈阳性染色。18例OA中，9例呈PAI-1阳性反应，分别为(+++)2例，(++)2例，(+)5例，(-)9例，阳性细胞分布部位类似于RA；未检出PAI-2阳性反应。6例正常滑膜组织中均未检测到PAI-1和PAI-2阳性染色。
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表1 RA、OA患者和正常对照组临床和实验室资料比较(
±s) 项目RA(46例)
OA(8例)
正常组(14例)
性别(女/男)
35/11
5/3
4/10
年龄(岁)
46.59±
16.33
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58.46±
38.32
27.23±
20.42
病程(年)
7.52±
7.91
10.44±
7.42
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血沉(mm/1h)
50.38±
29.09
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9.50±
7.58
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C反应蛋白(mg/L)
39.0 ±
43.3
6.1 ±
4.4
-
血小板(×109/L)
279.39±
79.08
, 百拇医药
200.39±
75.84
178.21±
88.65
类风湿因子(IU/ml)
172.05±
203.10
<20
-
3. 各组样品中PAI-1抗原含量和PAI-1活性测定结果：见表2。
4. PAI-1含量与RA病情活动的关系：见表3。表2 RA、OA和正常组血浆和滑液中PAI-1含量及活性测定结果比较(
±s) 组别, 百拇医药
例数
标本
PAI-1含量(μg/L)
P值
PAI-1活性
(IU/mg)
P值
RA
14
滑液
83.97±
19.77
-
, 百拇医药
11.50±
0.70
-
RA
46
血浆
59.92±27.13*
0.004 2
9.97±
2.18*
0.013
OA
, 百拇医药
8
血浆
38.60±10.86**
0.029 1
5.26±
3.0**
0.000 1
正常组
12
血浆
30.53±
12.64△
, 百拇医药
0.000 4
7.81±
2.93△
0.003 3
注：* RA滑液组与自身血浆对比；** RA血浆与OA血浆对比；△RA血浆与正常对照组对比表3 血浆和滑液中PAI-1含量与反映RA病情活动的血液学指标的相关性比较 组别
血浆(46例)
滑液(14例)
相关系数
P值
相关系数
, http://www.100md.com
P值
ESR
0.145 4
0.739
0.543 1
0.868
CRP
0.318 4
0.109
0.517 5
0.027
RF
0.203 4
, http://www.100md.com
0.396
0.694 2
<0.001
PLT
0.089 2
0.836
0.212 1
0.055
讨论 uPA通过与细胞膜上的uPAR专一性结合后，直接降解细胞外基质。uPA活性也受到多种物质的抑制性调节，其中包括uPA的生理性抑制剂 PAI-1，2，3和PN(proteinase nexin)。PAI-1和PAI-2是正常人血浆中PA的主要抑制剂，其中PAI-1的作用更为重要。PAI-1是一种由379个氨基酸组成的糖蛋白，分子量约50 000，PAI-1能快速与tPA和uPA结合，抑制它们的活性，是人体纤溶系统中主要的调节因子。关节滑膜成纤维细胞、软骨细胞、内皮细胞、单核细胞和多形核白细胞均能合成uPA、PAI-1和PAI-2，正常情况下，这些细胞可能主要负责在局部产生uPA和PAI，维持整个uPA系统的平衡，但在关节炎等病理情况下其详细的作用机制和涉及的成分还很不清楚[4，5]。在本研究中，我们主要检测了PAI-1和PAI-2在RA滑膜组织中的定位和分布以及定量分析了PAI-1在RA患者滑液、血浆中的含量和活性，并同时与OA患者和正常对照组进行比较，分析PAI在关节炎中可能发挥的作用。
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免疫组化结果显示，所有RA滑膜组织中均检出了PAI-1的阳性染色、8例检出了PAI-2阳性染色，PAI-1和PAI-2的强染色信号主要分布在RA患者的滑膜衬里层；在OA患者，只在少数病例检测到相对弱的PAI-1阳性染色，OA和正常滑膜组织中均未检出PAI-2的阳性染色。由此可见，PAI-1和PAI-2主要分布在增殖和侵袭性生长的滑膜组织，以适应这部分组织同时表达增强的uPA和uPAR，PAI-1对滑膜组织的侵袭性具有重要的调节作用，这种调节作用的可能途径是：PAI-1与uPA和uPAR结合形成复合物，滑膜细胞等对复合物产生内吞效应，使uPA在溶酶体中降解，而uPAR被再循环至细胞表面，此过程可调节uPA分泌的变化，调节uPAR在细胞的表达，PAI-1通过此途径促进滑膜细胞表面纤溶酶激活机制而产生功能性循环的作用，导致关节炎症情况下，细胞外基质成分的不断降解，最终是关节软骨和骨组织受到侵袭和破坏，使关节炎患者丧失关节的正常功能。因此，临床上如能有效地抑制关节局部滑膜组织中PAI-1的表达，切断滑膜细胞表面纤溶酶激活机制，从而能有效控制关节炎的破坏性，改善病人预后。
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为进一步明确PAI-1在RA炎性破坏中的作用，我们还利用ELISA方法定量将RA与OA患者及健康献血员血浆中PAI-1的含量和活性进行了比较。结果显示，RA患者血浆中PAI-1的含量和活性均显著高于OA组(P值均<0.05)和正常对照组(P<0.01和P<0.05)，这与Ronday等[6]报道的14例RA患者血浆中PAI-1含量高于OA的结果相一致。在本研究中，我们还同时比较了RA患者自身的滑液和血浆中PAI-1抗原含量和活性，结果是滑液中PAI-1抗原含量和活性均显著高于其自身血浆(P<0.001和P<0.05)，RA患者滑液与血浆中PAI-1抗原含量的差异，一方面可能与关节局部滑膜成纤维细胞、软骨细胞、单核/巨噬细胞和内皮细胞均能分泌PAI-1有关；另一方面是PAI-1的产生还受体内多种炎性细胞因子包括白细胞介素(IL)-1、IL-6、肿瘤坏死因子α和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)等的调节，这些细胞因子的局部调节影响PAI-1的产生[7，8]。此外，通过多元回归分析还发现，RA患者滑液和血浆中PAI-1的含量与通常临床上用来反映RA患者病情活动的指标血沉、C反应蛋白(CRP)、类风湿因子(RF)、血小板均存在一定的相关性，其中滑液中PAI-1的含量与血浆中检测得到的RF和CRP的相关性均达到了显著性意义(P<0.001和P<0.05)，这一重要结果提示，可将PAI-1作为反映RA病情的另一有用指标而用于临床。
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我们从定量和定性两方面均证实了RA滑膜、滑液和血浆中的PAI、尤其是PAI-1的表达高于OA患者和正常对照组，这种PAI在RA中表达的上调，提示在RA发生、发展过程中可能存在着一种PAI-1的激活机制。实际上，PAI-1的表达水平在多种恶性组织中明显升高，在乳腺癌患者中已作为诊断与预后判断的指标[9，10] 。此外，RA中PAI-1或许有独立于uPA之外的功能，如报道PAI-1参与血管的生成调节，这也可能是PAI-1升高与RA滑膜细胞类肿瘤细胞样高度增殖具有紧密相关性的原因之一。目前的研究发现RA有很多方面类似于局限侵袭性生长的恶性肿瘤：滑膜细胞高度增生并伴有大量淋巴细胞浸润以形成血管翳、细胞之间不表现出接触抑制、血管翳向邻近软骨和骨组织侵袭，这种作用类似于肿瘤细胞分泌多种蛋白酶降解细胞外基质引起肿瘤的侵袭和转移。在OA的研究中尚未有类似的发现，这可能与PAI在RA、OA两种疾病中表达的差异有关，其详细的机制还在探讨之中。
总之，RA患者滑膜、滑液和血浆中的PAI，尤其是PAI-1的表达水平与RA患者病情活动密切相关，其可作为临床上反映RA病情的有用指标，但至于PAI-1能否象在乳腺癌患者中作为诊断与判断预后的指标而应用于RA的临床实践中，则还需更多的探索和更完善的检测手段。
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基金项目：军队“九五”医药卫生科研基金资助项目(98Q098)
参考文献
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5，Ronday HK，Smits HH，Quax PH，et al. Bone matrix degradation by the plasminogen activation system. Possible mechanism of bone destruction in arthritis.Br J Rheumatol，1997，36：9-15.
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收稿日期：2000-01-04, 百拇医药