脂质体介导c-myc反义核酸对HL-60细胞作用的研究
作者：陈琳 卓光生 陈志哲 张学敏
单位：福州，福建省血液病研究所、福建医科大学附属协和医院 350001
关键词：白血病；脂质体；基因，；c-myc；寡核苷类，反义
中华内科杂志001004 【摘要】 目的 探讨脂质体介导c-myc反义核酸的抗肿瘤作用。方法 用人工合成互补于c-myc基因5′端转录起始部位的反义-寡核苷酸(AS-ODN)，直接转染HL-60细胞，或以脂质体lipofectin为载体进行基因转染实验，研究HL-60细胞在基因治疗后的形态和功能变化。结果 脂质体介导的c-myc反义核酸可抑制约50%HL-60细胞的增殖；促进细胞分化成熟，四唑氮蓝(NBT)还原率从空白组29%上升至56%，并诱导17%的细胞凋亡。免疫组化显示c-myc 蛋白阳性率从空白组(80.00±3.02)%下降至(41.67±4.56)%；逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)显示c-myc 基因的PCR扩增条带明显减弱; DNA电泳显示典型的凋亡梯形降解条带。单纯ODN无上述作用。结论 脂质体介导AS-ODN可抑制HL-60细胞的恶性表型。应用脂质体可提高细胞对反义核酸的摄取率，减少反义核酸用量。
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Effects of c-myc antisense oligodeoxynucleotide transfected by liposome on HL-60 cells
CHEN Lin ZHUO Guangsheng CHEN Zhizhe
(Fujian Institute of Hematology, The Union Hospital of Fujian Medical University, Fuzhou 350001, China)
【Abstract】 Objective To investigate a delivery system for administering antisense oligodeoxynucleotide (AS-ODN) to HL-60 cells and study the antitumor effects of c-myc antisense oligodeoxynucleotide. Methods Human leukemia cell line HL-60 was transfected with a synthetic oligodeoxynucleotide(ODN) complementary to the 5′ end region of c-myc gene. In addition, the changes of function and morphology were observed after transfection of cationic liposome. Results HL-60 cells incubated with c-myc AS-ODN/ lipofectin complex were about 50% decreased in the 4th day as compared with control cells (P<0.05). About 56% of HL-60 cells exposed to c-myc AS-ODN/lipofectin complex were NBT-positive and showed morphological changes with differentiated phenotype compared with 29% of untreated cells. The expression of the c-myc in the treated cells decreased markedly. The levels of c-myc protein after treatment decreased from (80.00±3. 02)% to (41.67±4.56)% (P<0.01). c-myc AS-ODN induced HL-60 cells apoptosis which morphological changes of apoptotic cells were investigated by fluorescence microsopy. A ladder-like pattern of DNA fragmentation was demonstrated on agorose gel electrophoresis and 17% apoptotic cells were found with flow cytometry. Conclusions Antisense oligodeoxynucleotide can suppress the maligant phenotype of HL-60 cells and enhancement of the effect was observed by adding lipofectin.
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【Key words】 Leukemia; liposome; Gene c-myc; Antisense oligodeoxynucleotide
原癌基因c-myc参与调控细胞的增殖、分化和凋亡过程，在多种血液系统恶性肿瘤细胞中有很高的表达。我们采用阳离子脂质体介导c-myc反义核酸转染白血病细胞株HL-60细胞，观察其对细胞增殖、分化、凋亡的影响以及c-myc mRNA及蛋白表达水平的变化，探讨反义核酸的作用机制。
材料与方法
1.细胞及培养体系：HL-60细胞引自福建省医学科学研究所，按常规方法培养。
2. 硫代磷酸化寡脱氧核苷酸(PS-ODN)的合成、纯化、定量：互补于c-myc基因5′端转录起始码及其后四个密码子的反义链(5′-AACGTTGAGGGGCAT-3′)及其无义链(5′-CATTTCTTGCTCTCC-3′)[1]由本所合成，硫化试剂是四乙基秋兰姆二硫化物(Perkin Elmer公司)，OPC柱纯化，紫外分光光度计定量。
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3. 寡核苷酸的转染及生长曲线测定：PS-ODN分别溶于不含小牛血清及抗生素的RPMI 1640液中，浓度为1 μg/ μl。分取6.5 μl寡核苷酸溶液加入93.5 μl不含小牛血清及抗生素的RPMI 1640中，此为A液；取10 μl脂质体lipofectin(为DOTMA与DOPE 1：1 [W/W]的混合物，GIBCO/BRL Inc.)溶于不含小牛血清及抗生素的RPMI 1640中，此为B液。A、B液分置室温30 min后轻柔混匀，室温作用15 min。同时取对数生长期的HL-60细胞为4.0×104与A、B液混匀后调成0.9 ml，转染6 h后各加入小牛血清0.1 ml。实验分组,如表1。
表1 实验各组A、B液的含量 组别
A液(μl)
B液(μl)
PS-ODN
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1640
脂质体
1640
空白对照组
0
100
0
100
无义组
6.5
93.5
0
100
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反义组
6.5
93.5
0
100
脂质体组
0
100
10
90
脂质体无义组
6.5
93.5
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10
90
脂质体反义组
6.5
93.5
10
90
将各组HL-60细胞分别接种于96孔培养板中，每孔0.2 ml,每天各取3个平行孔，0.4%锥虫蓝拒染法计算活细胞数，连续计数4 d，重复上述操作3次，绘制生长曲线。
4. 细胞分化能力测定:离心收集上述各组培养48 h的HL-60细胞为3×104，于10%小牛血清RPMI 1640中培养，继续追加PS-ODN，终浓度1 μmol/L，共培养5 d。第3天各组加10%小牛血清1640液1 ml。第6天收集各组细胞进行涂片，瑞氏-姬姆萨染色观察细胞形态。同时各组细胞用1/15 mol/L PBS洗涤、离心后，加1%NBT(Serva)100 μl及终浓度为100 μg/L TPA(GIBCO/BRL)，在37℃孵育1 h，离心后涂片，瑞氏染色，计数NBT染色阳性细胞百分比。
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5. c-myc蛋白及mRNA表达检测: (1)取上述各组细胞涂片置冷丙酮中固定，按链霉素抗生物素蛋白-过氧化酶SP试剂盒进行免疫组化染色，实验同时设阴性对照。(2)提取总RNA，测定OD260：OD280≥1.8，取1 μg于1%琼脂糖凝胶电泳，在紫外光下显示出清晰的28s及18s两条rRNA带，说明提取RNA完整性好。按Promega反转录试剂盒说明书进行cDNA的合成。然后进行c-myc 基因的PCR扩增，2%琼脂糖凝胶电泳，于凝胶图像分析仪上观察并拍照。
6. 细胞凋亡的检测: (1) AO/EB荧光染色法：按陈丽娟等[2]方法操作。(2) 流式细胞仪检测：取各组作用96 h的HL-60细胞，离心沉淀，用1/15 mol/L PBS洗涤后加入Kenesis 50试剂盒(Bio-Rad)中，置18～25℃暗室孵育30 min，于流式细胞仪上做DNA倍体分析。(3) DNA凋亡片段抽提与电泳：按快速法抽提DNA[3]，取5 μg DNA用1.5%琼脂糖凝胶，2V/cm凝胶电压电泳3 h，观察、摄片。
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7. 统计学分析:采用SPSS软件包分析，多组均数间的比较，检验方差齐性后行方差分析。
结果
1. 脂质体介导c-myc反义核酸对HL-60细胞增殖的抑制: 脂质体介导c-myc反义核酸组HL-60细胞增殖受到抑制(P<0.05)，于第4天最明显，而空白组、无义组、反义组、脂质体组、脂质体无义组细胞增殖抑制不明显，见表2。锥虫蓝染色显示各组均无死细胞比例的升高。
2. 脂质体介导反义核酸对HL-60细胞分化的影响: 空白组HL-60细胞未见分化成熟的改变。NBT还原率29%。脂质体转染c-myc反义核酸组HL-60细胞可见部分细胞分化成熟为中幼粒、晚幼粒甚至杆状核细胞。胞浆增多，胞核缩小，核染色质浓集，核仁减少至消失，显示向成熟方向分化，NBT还原率上升至56%。
3. c-myc蛋白表达的抑制: 细胞免疫组化结果
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表2 脂质体介导c-myc反义核酸对HL-60细胞增殖的影响(104/ml，
±s) 组别
第1天
第2天
第3天
第4天
空白对照组
9.39±0.60
20.28±
0.94
58.78±
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1.39
75.67±
3.04
无义组
9.17±
0.56
20.22±
1.09
57.28±
0.91
75.22±
2.41
反义组
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9.22±
0.44
20.11±
0.99
56.33±
1.17
74.89±
1.63
脂质体组
9.33±
0.71
19.89±
1.08
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56.11±
4.19
71.61±
3.82**
脂质体无义组
9.28±
0.26
20.11±
0.89
54.83±
3.22**
71.17±
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5.06**
脂质体反义组
9.22±
0.57
14.23±
0.51*
31.72±
1.68*
41.13±
2.15*
F1=0.206
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F2=60.848
F3=163.208
F4=156.144
注：与其他五组经Q检验有显著性差别*P<0.05;与空白对照组经Q检验有显著性差别**P<0.05
显示c-myc蛋白阳性率，由空白组(80.00±3.02)%下降至脂质体反义组的(41.67±4.56)%(P<0.01)，且c-myc阳性细胞胞核着红色程度减弱。
4. c-myc mRNA表达的抑制:RT-PCR检测c-myc mRNA水平显示脂质体反义核酸组较各对照组c-myc 基因的PCR扩增条带明显减弱,见图1。
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图1 RT-PCR检测各组HL-60细胞c-myc mRNA水平的变化
5. 脂质体介导反义核酸对细胞凋亡的影响: AO/EB染色显示各对照组未见凋亡细胞，胞核胞质呈黄绿色均匀荧光,见图2。脂质体反义核酸组HL-60细胞可见致密浓染的黄绿色碎片，即凋亡细胞,见图3。流式细胞仪检测空白组细胞凋亡率为0%，脂质体反义核酸组凋亡率17%。DNA电泳显示脂质体反义核酸组有凋亡特征的DNA改变，即呈典型的DNA降解“梯状”条带片段，而空白组未出现,见图4。
讨论
在人白血病中c-myc基因的扩增和过度表达产生的磷酸化蛋白质(P65)使信号传导和程序化死亡等正常功能发生变化，可能是导致白血病的机制之一。此与白血病病程演变、预后等密切相关。Kimura等[4]应用c-myc反义核酸抑制HL-60细胞c-myc的表达和细胞增殖，同时诱导细胞凋亡，为反义技术进行基因治疗提供理论依据。脂质体作为核
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图4 HL-60细胞处理前后DNA凝胶电泳
酸转染剂，由于具有高效、安全、低毒、方便等优点而得到广泛应用。本研究采用的脂质体lipofectin是由DOTMA和DOPE 1∶1(W/W)构成，与带负电荷的DNA磷酸骨架结合形成复合体进入细胞，使反义核酸得到保护，不致于被细胞外环境中核酸酶所降解，并且大大提高了反义核酸的摄入量，使其在胞内达到有效浓度到达靶部位与靶基因结合，达到封闭阻断靶基因的目的。
Holt等[5] 和Wickstrom等[1]实验结果表明：5 μmol/L c-myc 反义核酸(AS- ODN)作用于HL - 60细胞5 d后细胞增殖抑制率约50%。 本研究发现：应用lipofectin转染c-myc反义核酸达到HL-60细胞增殖抑制率约50%时所需c-myc反义核酸浓度仅为1 μmol/L，而空白组、1 μmol/L 反义组等均未出现细胞增殖抑制。这说明单纯反义核酸组由于药物剂量仅1 μmol/L，细胞摄入量少，不足以达到有效浓度而产生抑制作用。脂质体能有效提高反义核酸的摄入，增加胞内药物浓度，从而抑制基因表达。Williams等[6]应用阳离子脂质体lipofectin介导c-myc AS-ODN转染淋巴瘤细胞，在激光共聚焦显微镜下直接观察到细胞内FITC-标记的c-myc AS-ODN量较对照组显著增加，同时发现脂质体转染0.36 μmol/L c-myc AS-ODN作用5 h与单用9 μmol/L c-myc AS-ODN作用96 h可对细胞产生相同的抑制效应。表明脂质体转染反义核酸不仅能减少反义核酸用量，提高作用效果，而且反义核酸产生作用的时间明显缩短，从而更高效迅速抑制基因表达。本研究也证实了这点，脂质体转染反义核酸后对HL-60细胞增殖的抑制，在第2天开始即与其余五组均有显著性意义。其作用机制是由于阳离子脂质体与带阴离子的核酸分子相互吸引结合成复合体，在适当的脂质体/DNA比值下复合体仍带阳离子，易与带阴离子的细胞膜结合，通过膜融合、与细胞表面特异性受体结合[7]或经包绕嵌入(coated-pit)和非包绕嵌入(noncoated-pit)途径通过细胞胞饮作用轻易地透过胞膜[8]。脂质体还可能造成胞膜结构不稳定，少数复合体直接穿过细胞膜而进入胞浆，更高效地转染DNA进入细胞内。
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本研究结果显示：c-myc反义核酸作用具有以下特点：(1)具有序列特异性：从本研究结果明显看出只有通过脂质体介导c-myc反义核酸才能够抑制HL-60细胞增殖及c-myc mRNA和蛋白的表达，并诱导细胞分化和凋亡。这是由于c-myc mRNA起始码区有一膨松环，其中有一段弱的碱基配对区，这一区域易被与其序列互补的反义寡聚脱氧核苷酸杂交形成稳定的双链，导致翻译受抑制，阻断了基因的表达[1]，故表现出序列特异性的特点。(2)具有作用不彻底性：从本结果可以看出，c-myc反义核酸对细胞的反义效应只发生在部分HL-60细胞中，作用并不彻底，这可能与不同个体的细胞之间存在异质性有关[5]。(3)反义作用效应：包括抑制细胞增殖，促进分化，诱导凋亡，c-myc mRNA和蛋白表达水平减低等。本实验结果显示脂质体转染1 μmol /L c-myc反义核酸组HL-60细胞于第4天增殖抑制最明显。而且发现锥虫蓝染色显示死细胞比例并不升高，提示AS-ODN这种抑制并非直接的细胞毒作用。在c-myc反义核酸作用下，部分细胞表现相对成熟细胞的某些形态特征，NBT还原率从对照组的29%上升到56%，这说明增殖受抑的细胞有向成熟分化的趋势。而细胞向成熟分化可能也是细胞增殖抑制的原因之一。本研究第4天用RT-PCR法检测c-myc mRNA水平有明显下降，说明c-myc反义核酸能在转录水平抑制基因的表达。
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图2 对照组HL-60细胞，可见胞核及胞质呈均匀荧光
图3 脂质体转染c-myuc 反义核酸组HL-60细胞，可见凋 亡细胞；核固缩碎裂成密度较高的小体
参考文献
1，Wickstrom EL, Bacon TA, Gonzalez A, et al. Human promyelocytic leukemia HL-60 cell proliferation and c-myc protein expression are inhibited by an antisense pentadecadeoxynucleotide targeted against c-myc mRNA. Proc Natl Acad Sci U S A，1988, 85:1028-1032.
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2，陈丽娟，盛瑞兰，汪承亚，等. AO/EB荧光染色法测定阿糖胞苷诱导HL-60细胞凋亡. 中华血液学杂志，1998， 19:41-42.
3，姜泊，张亚历，周殿元，等. 分子生物学常用实验方法. 第1版. 北京：人民军医出版社，1996. 174-177.
4，Kimura S, Maekawa T，Hirakawa K, et al. Alterations of c-myc expression by antisense oligodeoxynucleotides enhance the induction of apoptosis in HL-60 cells. Cancer Res，1995，55: 1379-1384.
5，Holt JT，Redner RL, Nienhuis AW, et al. An oligomer complementary to c-myc mRNA inhibits proliferation of HL-60 promyelocytic cells and induces differentiation. Mol Cell Biol，1988，8:963-973.
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6，Williams SA，Chang L，Buzby JS，et al. Cationic lipids reduce time and dose of c-myc antisense oligodeoxynucleotides required to specifically inhibit Burkitt′s lymphoma cell growth. Leukemia, 1996, 10:1980-1989.
7，Kam MH. Gene therapy. Singapore： World Scientific Publishing Co, 1994. 107-129.
8，Zhou X, Huang L. DNA transfection mediated by cationic liposomes containing lipopolylysine: characterization and mechanism of action. Biochim Biophys Acta, 1994, 1189:195-203.
收稿日期：1999-12-20, 百拇医药
单位：福州，福建省血液病研究所、福建医科大学附属协和医院 350001
关键词：白血病；脂质体；基因，；c-myc；寡核苷类，反义
中华内科杂志001004 【摘要】 目的 探讨脂质体介导c-myc反义核酸的抗肿瘤作用。方法 用人工合成互补于c-myc基因5′端转录起始部位的反义-寡核苷酸(AS-ODN)，直接转染HL-60细胞，或以脂质体lipofectin为载体进行基因转染实验，研究HL-60细胞在基因治疗后的形态和功能变化。结果 脂质体介导的c-myc反义核酸可抑制约50%HL-60细胞的增殖；促进细胞分化成熟，四唑氮蓝(NBT)还原率从空白组29%上升至56%，并诱导17%的细胞凋亡。免疫组化显示c-myc 蛋白阳性率从空白组(80.00±3.02)%下降至(41.67±4.56)%；逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)显示c-myc 基因的PCR扩增条带明显减弱; DNA电泳显示典型的凋亡梯形降解条带。单纯ODN无上述作用。结论 脂质体介导AS-ODN可抑制HL-60细胞的恶性表型。应用脂质体可提高细胞对反义核酸的摄取率，减少反义核酸用量。
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Effects of c-myc antisense oligodeoxynucleotide transfected by liposome on HL-60 cells
CHEN Lin ZHUO Guangsheng CHEN Zhizhe
(Fujian Institute of Hematology, The Union Hospital of Fujian Medical University, Fuzhou 350001, China)
【Abstract】 Objective To investigate a delivery system for administering antisense oligodeoxynucleotide (AS-ODN) to HL-60 cells and study the antitumor effects of c-myc antisense oligodeoxynucleotide. Methods Human leukemia cell line HL-60 was transfected with a synthetic oligodeoxynucleotide(ODN) complementary to the 5′ end region of c-myc gene. In addition, the changes of function and morphology were observed after transfection of cationic liposome. Results HL-60 cells incubated with c-myc AS-ODN/ lipofectin complex were about 50% decreased in the 4th day as compared with control cells (P<0.05). About 56% of HL-60 cells exposed to c-myc AS-ODN/lipofectin complex were NBT-positive and showed morphological changes with differentiated phenotype compared with 29% of untreated cells. The expression of the c-myc in the treated cells decreased markedly. The levels of c-myc protein after treatment decreased from (80.00±3. 02)% to (41.67±4.56)% (P<0.01). c-myc AS-ODN induced HL-60 cells apoptosis which morphological changes of apoptotic cells were investigated by fluorescence microsopy. A ladder-like pattern of DNA fragmentation was demonstrated on agorose gel electrophoresis and 17% apoptotic cells were found with flow cytometry. Conclusions Antisense oligodeoxynucleotide can suppress the maligant phenotype of HL-60 cells and enhancement of the effect was observed by adding lipofectin.
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【Key words】 Leukemia; liposome; Gene c-myc; Antisense oligodeoxynucleotide
原癌基因c-myc参与调控细胞的增殖、分化和凋亡过程，在多种血液系统恶性肿瘤细胞中有很高的表达。我们采用阳离子脂质体介导c-myc反义核酸转染白血病细胞株HL-60细胞，观察其对细胞增殖、分化、凋亡的影响以及c-myc mRNA及蛋白表达水平的变化，探讨反义核酸的作用机制。
材料与方法
1.细胞及培养体系：HL-60细胞引自福建省医学科学研究所，按常规方法培养。
2. 硫代磷酸化寡脱氧核苷酸(PS-ODN)的合成、纯化、定量：互补于c-myc基因5′端转录起始码及其后四个密码子的反义链(5′-AACGTTGAGGGGCAT-3′)及其无义链(5′-CATTTCTTGCTCTCC-3′)[1]由本所合成，硫化试剂是四乙基秋兰姆二硫化物(Perkin Elmer公司)，OPC柱纯化，紫外分光光度计定量。
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3. 寡核苷酸的转染及生长曲线测定：PS-ODN分别溶于不含小牛血清及抗生素的RPMI 1640液中，浓度为1 μg/ μl。分取6.5 μl寡核苷酸溶液加入93.5 μl不含小牛血清及抗生素的RPMI 1640中，此为A液；取10 μl脂质体lipofectin(为DOTMA与DOPE 1：1 [W/W]的混合物，GIBCO/BRL Inc.)溶于不含小牛血清及抗生素的RPMI 1640中，此为B液。A、B液分置室温30 min后轻柔混匀，室温作用15 min。同时取对数生长期的HL-60细胞为4.0×104与A、B液混匀后调成0.9 ml，转染6 h后各加入小牛血清0.1 ml。实验分组,如表1。
表1 实验各组A、B液的含量 组别
A液(μl)
B液(μl)
PS-ODN
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1640
脂质体
1640
空白对照组
0
100
0
100
无义组
6.5
93.5
0
100
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反义组
6.5
93.5
0
100
脂质体组
0
100
10
90
脂质体无义组
6.5
93.5
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10
90
脂质体反义组
6.5
93.5
10
90
将各组HL-60细胞分别接种于96孔培养板中，每孔0.2 ml,每天各取3个平行孔，0.4%锥虫蓝拒染法计算活细胞数，连续计数4 d，重复上述操作3次，绘制生长曲线。
4. 细胞分化能力测定:离心收集上述各组培养48 h的HL-60细胞为3×104，于10%小牛血清RPMI 1640中培养，继续追加PS-ODN，终浓度1 μmol/L，共培养5 d。第3天各组加10%小牛血清1640液1 ml。第6天收集各组细胞进行涂片，瑞氏-姬姆萨染色观察细胞形态。同时各组细胞用1/15 mol/L PBS洗涤、离心后，加1%NBT(Serva)100 μl及终浓度为100 μg/L TPA(GIBCO/BRL)，在37℃孵育1 h，离心后涂片，瑞氏染色，计数NBT染色阳性细胞百分比。
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5. c-myc蛋白及mRNA表达检测: (1)取上述各组细胞涂片置冷丙酮中固定，按链霉素抗生物素蛋白-过氧化酶SP试剂盒进行免疫组化染色，实验同时设阴性对照。(2)提取总RNA，测定OD260：OD280≥1.8，取1 μg于1%琼脂糖凝胶电泳，在紫外光下显示出清晰的28s及18s两条rRNA带，说明提取RNA完整性好。按Promega反转录试剂盒说明书进行cDNA的合成。然后进行c-myc 基因的PCR扩增，2%琼脂糖凝胶电泳，于凝胶图像分析仪上观察并拍照。
6. 细胞凋亡的检测: (1) AO/EB荧光染色法：按陈丽娟等[2]方法操作。(2) 流式细胞仪检测：取各组作用96 h的HL-60细胞，离心沉淀，用1/15 mol/L PBS洗涤后加入Kenesis 50试剂盒(Bio-Rad)中，置18～25℃暗室孵育30 min，于流式细胞仪上做DNA倍体分析。(3) DNA凋亡片段抽提与电泳：按快速法抽提DNA[3]，取5 μg DNA用1.5%琼脂糖凝胶，2V/cm凝胶电压电泳3 h，观察、摄片。
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7. 统计学分析:采用SPSS软件包分析，多组均数间的比较，检验方差齐性后行方差分析。
结果
1. 脂质体介导c-myc反义核酸对HL-60细胞增殖的抑制: 脂质体介导c-myc反义核酸组HL-60细胞增殖受到抑制(P<0.05)，于第4天最明显，而空白组、无义组、反义组、脂质体组、脂质体无义组细胞增殖抑制不明显，见表2。锥虫蓝染色显示各组均无死细胞比例的升高。
2. 脂质体介导反义核酸对HL-60细胞分化的影响: 空白组HL-60细胞未见分化成熟的改变。NBT还原率29%。脂质体转染c-myc反义核酸组HL-60细胞可见部分细胞分化成熟为中幼粒、晚幼粒甚至杆状核细胞。胞浆增多，胞核缩小，核染色质浓集，核仁减少至消失，显示向成熟方向分化，NBT还原率上升至56%。
3. c-myc蛋白表达的抑制: 细胞免疫组化结果
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表2 脂质体介导c-myc反义核酸对HL-60细胞增殖的影响(104/ml，
±s) 组别第1天
第2天
第3天
第4天
空白对照组
9.39±0.60
20.28±
0.94
58.78±
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1.39
75.67±
3.04
无义组
9.17±
0.56
20.22±
1.09
57.28±
0.91
75.22±
2.41
反义组
, 百拇医药
9.22±
0.44
20.11±
0.99
56.33±
1.17
74.89±
1.63
脂质体组
9.33±
0.71
19.89±
1.08
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56.11±
4.19
71.61±
3.82**
脂质体无义组
9.28±
0.26
20.11±
0.89
54.83±
3.22**
71.17±
, 百拇医药
5.06**
脂质体反义组
9.22±
0.57
14.23±
0.51*
31.72±
1.68*
41.13±
2.15*
F1=0.206
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F2=60.848
F3=163.208
F4=156.144
注：与其他五组经Q检验有显著性差别*P<0.05;与空白对照组经Q检验有显著性差别**P<0.05
显示c-myc蛋白阳性率，由空白组(80.00±3.02)%下降至脂质体反义组的(41.67±4.56)%(P<0.01)，且c-myc阳性细胞胞核着红色程度减弱。
4. c-myc mRNA表达的抑制:RT-PCR检测c-myc mRNA水平显示脂质体反义核酸组较各对照组c-myc 基因的PCR扩增条带明显减弱,见图1。
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图1 RT-PCR检测各组HL-60细胞c-myc mRNA水平的变化
5. 脂质体介导反义核酸对细胞凋亡的影响: AO/EB染色显示各对照组未见凋亡细胞，胞核胞质呈黄绿色均匀荧光,见图2。脂质体反义核酸组HL-60细胞可见致密浓染的黄绿色碎片，即凋亡细胞,见图3。流式细胞仪检测空白组细胞凋亡率为0%，脂质体反义核酸组凋亡率17%。DNA电泳显示脂质体反义核酸组有凋亡特征的DNA改变，即呈典型的DNA降解“梯状”条带片段，而空白组未出现,见图4。
讨论
在人白血病中c-myc基因的扩增和过度表达产生的磷酸化蛋白质(P65)使信号传导和程序化死亡等正常功能发生变化，可能是导致白血病的机制之一。此与白血病病程演变、预后等密切相关。Kimura等[4]应用c-myc反义核酸抑制HL-60细胞c-myc的表达和细胞增殖，同时诱导细胞凋亡，为反义技术进行基因治疗提供理论依据。脂质体作为核
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图4 HL-60细胞处理前后DNA凝胶电泳
酸转染剂，由于具有高效、安全、低毒、方便等优点而得到广泛应用。本研究采用的脂质体lipofectin是由DOTMA和DOPE 1∶1(W/W)构成，与带负电荷的DNA磷酸骨架结合形成复合体进入细胞，使反义核酸得到保护，不致于被细胞外环境中核酸酶所降解，并且大大提高了反义核酸的摄入量，使其在胞内达到有效浓度到达靶部位与靶基因结合，达到封闭阻断靶基因的目的。
Holt等[5] 和Wickstrom等[1]实验结果表明：5 μmol/L c-myc 反义核酸(AS- ODN)作用于HL - 60细胞5 d后细胞增殖抑制率约50%。 本研究发现：应用lipofectin转染c-myc反义核酸达到HL-60细胞增殖抑制率约50%时所需c-myc反义核酸浓度仅为1 μmol/L，而空白组、1 μmol/L 反义组等均未出现细胞增殖抑制。这说明单纯反义核酸组由于药物剂量仅1 μmol/L，细胞摄入量少，不足以达到有效浓度而产生抑制作用。脂质体能有效提高反义核酸的摄入，增加胞内药物浓度，从而抑制基因表达。Williams等[6]应用阳离子脂质体lipofectin介导c-myc AS-ODN转染淋巴瘤细胞，在激光共聚焦显微镜下直接观察到细胞内FITC-标记的c-myc AS-ODN量较对照组显著增加，同时发现脂质体转染0.36 μmol/L c-myc AS-ODN作用5 h与单用9 μmol/L c-myc AS-ODN作用96 h可对细胞产生相同的抑制效应。表明脂质体转染反义核酸不仅能减少反义核酸用量，提高作用效果，而且反义核酸产生作用的时间明显缩短，从而更高效迅速抑制基因表达。本研究也证实了这点，脂质体转染反义核酸后对HL-60细胞增殖的抑制，在第2天开始即与其余五组均有显著性意义。其作用机制是由于阳离子脂质体与带阴离子的核酸分子相互吸引结合成复合体，在适当的脂质体/DNA比值下复合体仍带阳离子，易与带阴离子的细胞膜结合，通过膜融合、与细胞表面特异性受体结合[7]或经包绕嵌入(coated-pit)和非包绕嵌入(noncoated-pit)途径通过细胞胞饮作用轻易地透过胞膜[8]。脂质体还可能造成胞膜结构不稳定，少数复合体直接穿过细胞膜而进入胞浆，更高效地转染DNA进入细胞内。
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本研究结果显示：c-myc反义核酸作用具有以下特点：(1)具有序列特异性：从本研究结果明显看出只有通过脂质体介导c-myc反义核酸才能够抑制HL-60细胞增殖及c-myc mRNA和蛋白的表达，并诱导细胞分化和凋亡。这是由于c-myc mRNA起始码区有一膨松环，其中有一段弱的碱基配对区，这一区域易被与其序列互补的反义寡聚脱氧核苷酸杂交形成稳定的双链，导致翻译受抑制，阻断了基因的表达[1]，故表现出序列特异性的特点。(2)具有作用不彻底性：从本结果可以看出，c-myc反义核酸对细胞的反义效应只发生在部分HL-60细胞中，作用并不彻底，这可能与不同个体的细胞之间存在异质性有关[5]。(3)反义作用效应：包括抑制细胞增殖，促进分化，诱导凋亡，c-myc mRNA和蛋白表达水平减低等。本实验结果显示脂质体转染1 μmol /L c-myc反义核酸组HL-60细胞于第4天增殖抑制最明显。而且发现锥虫蓝染色显示死细胞比例并不升高，提示AS-ODN这种抑制并非直接的细胞毒作用。在c-myc反义核酸作用下，部分细胞表现相对成熟细胞的某些形态特征，NBT还原率从对照组的29%上升到56%，这说明增殖受抑的细胞有向成熟分化的趋势。而细胞向成熟分化可能也是细胞增殖抑制的原因之一。本研究第4天用RT-PCR法检测c-myc mRNA水平有明显下降，说明c-myc反义核酸能在转录水平抑制基因的表达。
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图2 对照组HL-60细胞，可见胞核及胞质呈均匀荧光
图3 脂质体转染c-myuc 反义核酸组HL-60细胞，可见凋 亡细胞；核固缩碎裂成密度较高的小体
参考文献
1，Wickstrom EL, Bacon TA, Gonzalez A, et al. Human promyelocytic leukemia HL-60 cell proliferation and c-myc protein expression are inhibited by an antisense pentadecadeoxynucleotide targeted against c-myc mRNA. Proc Natl Acad Sci U S A，1988, 85:1028-1032.
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2，陈丽娟，盛瑞兰，汪承亚，等. AO/EB荧光染色法测定阿糖胞苷诱导HL-60细胞凋亡. 中华血液学杂志，1998， 19:41-42.
3，姜泊，张亚历，周殿元，等. 分子生物学常用实验方法. 第1版. 北京：人民军医出版社，1996. 174-177.
4，Kimura S, Maekawa T，Hirakawa K, et al. Alterations of c-myc expression by antisense oligodeoxynucleotides enhance the induction of apoptosis in HL-60 cells. Cancer Res，1995，55: 1379-1384.
5，Holt JT，Redner RL, Nienhuis AW, et al. An oligomer complementary to c-myc mRNA inhibits proliferation of HL-60 promyelocytic cells and induces differentiation. Mol Cell Biol，1988，8:963-973.
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6，Williams SA，Chang L，Buzby JS，et al. Cationic lipids reduce time and dose of c-myc antisense oligodeoxynucleotides required to specifically inhibit Burkitt′s lymphoma cell growth. Leukemia, 1996, 10:1980-1989.
7，Kam MH. Gene therapy. Singapore： World Scientific Publishing Co, 1994. 107-129.
8，Zhou X, Huang L. DNA transfection mediated by cationic liposomes containing lipopolylysine: characterization and mechanism of action. Biochim Biophys Acta, 1994, 1189:195-203.
收稿日期：1999-12-20, 百拇医药