口腔粘膜癌变过程中细胞角蛋白CK10和CK13的变化
作者：聂敏海 曾光明 李秉琦 何志秀 陈谦明 周 敏 曾 昕
单位：华西医科大学口腔医学院 610041 (聂敏海 现在泸州医学院口腔系工作)
关键词：口腔；癌前状态；角蛋白
口腔粘膜癌变过程中细胞角蛋白CK10和CK13的变化〔摘要〕 目的：探讨细胞角蛋白CK10和CK13在口腔粘膜癌变过程的各阶段组织中的分布和表达强度。方法：用LSAB免疫组化染色方法对口腔正常粘膜、上皮单纯增生、上皮异常增生和口腔磷癌切片进行染色，光镜观察。结果：正常颊粘膜和口底舌腹粘膜基底上层CK10表达阴性，CK13表达强阳性；上皮过度不全角化时，CK10表达可为阳性 ，CK13表达减少；上皮过度正角化时，CK10在基底上层呈强阳性表达，CK13表达进一步减少甚至缺失。随上皮异常增生程度加重，基底上层细胞CK10和CK13表达减少甚至缺失。在口腔浸润癌中，不管分化程度如何，CK13均表达阴性，而CK10在分化较好的癌细胞及癌巢中呈阳性表达。结论：CK13表达减少或缺失可作为口腔癌前病变诊断的辅助指标，CK10可为口腔癌的分化程度及其预后判定提供帮助。
, http://www.100md.com
Expressionof CK10 and CK13 in oral carcinogenesis
Nie Minhai, Zeng Guangming, Li Bingqi, et al.College of Stomatology,West China University of Medical Sciences, Chengdu 610041
〔Abstract〕Objective:To investigate the distribution and expression of Cytokeratin 10(CK10) and cytokeratin 13(CK13) in oral carcinogenesis.Methods:LSAB immunohistochemical method was used to stain the tissue sections of normal oral mucosa,epithelial hyperplasia, epithelial dysplasia and oral squamous cell carcinomas.The stained sections were observed under light microscopy.The results were described and analysed semiquantitatively with rank sum test.Results:CK10 was negative and CK13 was strongly positive in normal buccal mucosa,ventral tongue and mouth floor.CK10 was positive and CK13 expression decreased in parahyperkeratosis.CK10 was strongly expressed and CK13 decreased or disappeared in orthohyperkeratosis.With the development of dysplasia CK10 and CK13 expression decreased,even disappeared.CK13 was negative in oral invasive cancer cells,but CK10 was positive in cancer nest or some well differentiated cancer cells.Conclusion:The reduction or disappearance of CK13 expression can be one of the additional variables for diagnosing oral cancer and CK10 expression may be useful to evaluate the differentiation degree and prognosis of oral cancer.
, 百拇医药
Key words Mouth;Precancerous condition;Keratin
细胞角蛋白(cytokeratin ,CK)是中间丝蛋白的主要组成成分，主要表达于上皮细胞，随细胞类型和分化程度不同而表达类型有差异。CK由多基因家族编码。根据其相对分子质量(Mr)和等电点不同分为两型〔1〕，I型为酸性，Mr为40 000～64 000，包括编号9～20(CK9～CK20)角蛋白多肽，Ⅱ型为中性或碱性，Mr为52 000～68 000，包括编号1～8(CK1～CK8)的角蛋白多肽。通常CK在上皮中以“角蛋白对”的形式表达，“角蛋白对”由一个I型角蛋白分子和比其大Mr 8 000的Ⅱ型角蛋白分子构成。CK具有高度的细胞和组织特异性。通常复层上皮的基底层表达CK5/CK14，角化上皮的基底上层表达CK1/CK10，非角化上皮的基底上层表达CK4/CK13。细胞角蛋白在上皮细胞中含量丰富且稳定，因而如能作为口腔癌前病变和口腔癌的标志将具有优越性。本研究的目的是检测CK10和CK13在从正常粘膜到口腔癌的各阶段组织中的变化，以探讨细胞角蛋白作为口腔癌前病变标志的可能性。
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 标本来源 正常粘膜来自尸检。病变粘膜来自半年内全身或局部未用过激素类或维甲酸类药物的门诊患者，局麻下活检， 组织经体积分数为10%的中性福尔马林液固定，石蜡包埋，5 μm连续切片用于HE染色作病理诊断和免疫组化染色。
1.2 试剂 鼠抗人CK10单克隆抗体(DE-K10)，鼠抗人CK13单克隆抗体(DE-K13)，均为ZYMED公司产品，购自福州迈新公司。LSAB试剂盒、DAB为DAKO公司产品。
1.3 免疫组化方法 CK10抗体采用不预处理的LSAB法，用正常牙龈组织作阳性对照；CK13抗体采用胰酶处理的LSAB法，用无角化的颊粘膜作阳性对照，二者均采用PBS代替一抗作阴性对照。
1.4 结果的分析方法 HE切片的诊断由两位有经验的病理医生盲法读片确认。免疫组化结果采用半定量法判定：-阴性，±阳性细胞占基底上层的25%以下，+阳性细胞占基底上层的25%～50%,++阳性细胞占基底上层的50%～75%，+++阳性细胞占基底上层的75%以上。结果采用秩和检验分析。
, 百拇医药
2 结 果
2.1 临床病理资料 研究对象的临床病理资料见表1。
表1 研究对象的临床病理资料
病理诊断
例数
平均年龄
部位
颊
舌背
舌腹口底
龈
正常粘膜
, http://www.100md.com 13
45
5
4
2
2
上皮单纯增生
无过度角化
13
55
5
5
2
1
, http://www.100md.com
有过度角化
18
50
7
7
3
1
轻度上皮异常增生
18
51
8
3
5
2
, 百拇医药
中度上皮异常增生
16
52
9
6
1
0
重度上皮异常增生
15
53
6
3
6
0
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浸润癌
14
48
5
1
7
1
2.2 免疫组化染色结果 CK10和CK13为终末分化标志，不表达于基底层细胞，而分别表达于不同分化类型上皮基底上层细胞的胞浆中
正常粘膜：正常颊粘膜和口底舌腹粘膜为无角化上皮，CK10表达阴性，而基底上层CK13表达阳性(+++)；舌背粘膜为不全角化上皮，基底上层CK10表达(+)；牙龈粘膜为角化上皮，基底上层CK10表达(+++)，舌背和牙龈基底上层CK13表达(+)
, 百拇医药
上皮单纯增生：单纯增生而无过度角化的口腔上皮，颊和舌腹CK10表达阴性，CK13在基底上层表达(++)。舌背和牙龈上皮CK10阳性(+)的细胞位于棘层浅层，CK13表达(+)。
颊和舌腹粘膜上皮过度正角化时，CK10在基底上层呈强阳性表达(+++)，过度不全角化时，CK10表达为阳性(+～++)，与CK10阴性的无角化的粘膜分界明显。舌背上皮有过度角化时，CK10表达阳性(+～++)，牙龈过度角化时，CK10表达阳性(++)。而CK13在各部位过度不全角化时表达减少，过度正角化时表达进一步减少甚至缺失。此时CK10和CK13的表达与其它各组比较有显著性差异(P<0.05)。
上皮异常增生时，不论有无角化，CK10均在异常增生处上皮全层呈阴性表达。随异型性加重，CK13阳性细胞趋向表层，阳性细胞数减少，部分完全阴性(图1)，轻、中、重度上皮异常增生三者相比有显著性差异，随异常增生程度加重，CK13表达减少。
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图 1 上皮异常增生时CK13的表达 ×40.2 随异常增生程度加重，CK13表达减少
在口腔浸润癌中，不管分化程度如何，CK13均表达阴性，而CK10在高分化鳞癌的癌巢中心分化较好的细胞中呈阳性表达(图2)，在中分化鳞癌和低分化鳞癌中，个别分化较好的癌细胞也呈阳性表达，这与CK10作为角化标志的角色是相适应的。CK10和CK13的表达与其它各组比较有显著性差异(P<0.05)。
图2 高分化磷癌中CK10表达 ×28.5 在癌巢及分化的癌细胞中CK10表达阳性。
3 讨 论
CK是上皮细胞细胞骨架的主要组成成分之一，其作用不太清楚，推测与细胞机械强度的维持和细胞内信号传导有关。
, 百拇医药
本研究发现在上皮单纯增生的组织中，如果没有异常角化，则CK10和CK13的表达与正常组织表达相似但减少。而有过度角化存在时，则表达形式发生紊乱，颊和舌腹上皮基底上层表达CK10，而CK13表达减少，与CK10作为角化标志相吻合。
在口腔癌前病变和口腔癌中，CK13和CK10表达减少甚至缺失，与Heyden等〔2〕的研究结果相似。在口腔高分化鳞癌中，未检测到CK13，而CK10在癌巢中心分化较好的细胞表达，但Ogden等〔3〕却在高分化鳞癌中也检测到少量CK13。口腔内发生癌前病变的高危险区域通常为颊口角区、口底舌腹和软腭复合体，这些部位上皮均无角化，因而研究这些部位病变上皮CK13的表达更具有意义。
CK1/CK10为角化标志，CK4/CK13为复层上皮标志，CK5/CK14为基底细胞标志，CK10和CK13不表达于基底细胞层。Heyden等〔2〕研究发现上皮中、重度异常增生时，上皮全层均表达CK14而不表达CK13和CK10，而我们的研究发现CK13在轻、中、重度上皮异常增生时逐渐减少，表达部位逐渐移向角化层，结合Heyden等的研究结果，我们推测CK13仅表达于成熟的棘层细胞，而不表达于新形成的棘层细胞和具异型性的细胞，因而在口腔癌中未检测到CK13。CK10作为角化标志，表达于终末分化时具有角化能力和将要角化的细胞。因此，CK10和CK13与上皮细胞的分化密切相关，CK13的正常表达缺失预示着上皮的分裂增殖能力增强。
, 百拇医药
CK的表达不仅与部位有关，而且与细胞类型和分化程度有关。本研究发现CK13和CK10在口腔癌前病变和口腔癌中表达减少或缺失，说明病变上皮的细胞类型和分化程度发生了改变。因CK表达的调控机理不清楚，故这种变化是病变的结果还是原因，目前尚无定论。Branhet等〔4〕局部用维甲酸治疗扁平苔藓和白斑时发现CK1/CK10消失，可能是由于维甲酸通过其核受体和角蛋白基因的直接作用而抑制CK10基因表达。CK的调控发生于转录水平〔5、6〕和(或)转录后水平〔7〕。但CK基因怎样调节上皮分化，CK基因与癌基因和抑制癌基因之间的相互关系，尚需进一步研究。
CK连接细胞膜和核膜，除维持细胞的机械强度外，不同的CK是否介导不同信号的传递，从而使细胞表现不同的分化和增殖状态?总之，CK的变化是口腔癌前病变中发生较早的事件，CK13表达减少或缺失可作为口腔癌前病变诊断的辅助指标，CK10可为口腔癌的分化程度及其预后判定提供帮助。
, 百拇医药
本课题为四川省卫生厅科学研究基金资助，编号 960040
参考文献
1Velden LAVD,Schaafsma HE,Mannii JJ,et al.Cytokeratin expression in no rmal and premalignant head and neck epithelia:An overview.Head Neck,1993,15(2):133
2 Heyden A,Huitfeldt HS,Koppang HS,et al.Cytokeratins as epithelial differentiation markers in premalignant and malignant oral lesions.J Oral Pathol Med,1992,21(1):7
3 Odgen GR,Chisholm DM,Adi M,et al.Cytokeratin expression in oral cancer and its relationship to tumor differentiation.J Oral Pathol Med,1993,22(1):82
, 百拇医药
4 Branchet MC,Boisnic S,Pascal F,et al.Topical tretinoin in the treatment of lichen planus and leukoplakia of oral mucosa.A biochemical evaluation of the keratinization.Ann Dermatol Venereol,1994,121(6):464
5 Fuchs E,Green H.Regulation of terminal differentiation of cultured human keratinocytes by vitamin A.Cell,1981,25(3):617
6 Marley JJ,Robinson PA,Hume WJ.Expression of human cytokeratin 14 in normal,premalignant and malignant oral tissue following isolation by plaque differential hybridisation.Eur J Cancer B Oral Oncol,1994,30B(5):305
7 Winter H,Schweizer J.Keratin synthesis in normal mouse epithelia and in squamous cell carcinoma:Evidence in tumors for masked mRNA species coding for high molecular weight keratin polypeptides.Proc Natl Acad Sci USA,1983,80(21):6480
(收稿：1998-10-26 修回：1999-02-15), 百拇医药
单位：华西医科大学口腔医学院 610041 (聂敏海 现在泸州医学院口腔系工作)
关键词：口腔；癌前状态；角蛋白
口腔粘膜癌变过程中细胞角蛋白CK10和CK13的变化〔摘要〕 目的：探讨细胞角蛋白CK10和CK13在口腔粘膜癌变过程的各阶段组织中的分布和表达强度。方法：用LSAB免疫组化染色方法对口腔正常粘膜、上皮单纯增生、上皮异常增生和口腔磷癌切片进行染色，光镜观察。结果：正常颊粘膜和口底舌腹粘膜基底上层CK10表达阴性，CK13表达强阳性；上皮过度不全角化时，CK10表达可为阳性 ，CK13表达减少；上皮过度正角化时，CK10在基底上层呈强阳性表达，CK13表达进一步减少甚至缺失。随上皮异常增生程度加重，基底上层细胞CK10和CK13表达减少甚至缺失。在口腔浸润癌中，不管分化程度如何，CK13均表达阴性，而CK10在分化较好的癌细胞及癌巢中呈阳性表达。结论：CK13表达减少或缺失可作为口腔癌前病变诊断的辅助指标，CK10可为口腔癌的分化程度及其预后判定提供帮助。
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Expressionof CK10 and CK13 in oral carcinogenesis
Nie Minhai, Zeng Guangming, Li Bingqi, et al.College of Stomatology,West China University of Medical Sciences, Chengdu 610041
〔Abstract〕Objective:To investigate the distribution and expression of Cytokeratin 10(CK10) and cytokeratin 13(CK13) in oral carcinogenesis.Methods:LSAB immunohistochemical method was used to stain the tissue sections of normal oral mucosa,epithelial hyperplasia, epithelial dysplasia and oral squamous cell carcinomas.The stained sections were observed under light microscopy.The results were described and analysed semiquantitatively with rank sum test.Results:CK10 was negative and CK13 was strongly positive in normal buccal mucosa,ventral tongue and mouth floor.CK10 was positive and CK13 expression decreased in parahyperkeratosis.CK10 was strongly expressed and CK13 decreased or disappeared in orthohyperkeratosis.With the development of dysplasia CK10 and CK13 expression decreased,even disappeared.CK13 was negative in oral invasive cancer cells,but CK10 was positive in cancer nest or some well differentiated cancer cells.Conclusion:The reduction or disappearance of CK13 expression can be one of the additional variables for diagnosing oral cancer and CK10 expression may be useful to evaluate the differentiation degree and prognosis of oral cancer.
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Key words Mouth;Precancerous condition;Keratin
细胞角蛋白(cytokeratin ,CK)是中间丝蛋白的主要组成成分，主要表达于上皮细胞，随细胞类型和分化程度不同而表达类型有差异。CK由多基因家族编码。根据其相对分子质量(Mr)和等电点不同分为两型〔1〕，I型为酸性，Mr为40 000～64 000，包括编号9～20(CK9～CK20)角蛋白多肽，Ⅱ型为中性或碱性，Mr为52 000～68 000，包括编号1～8(CK1～CK8)的角蛋白多肽。通常CK在上皮中以“角蛋白对”的形式表达，“角蛋白对”由一个I型角蛋白分子和比其大Mr 8 000的Ⅱ型角蛋白分子构成。CK具有高度的细胞和组织特异性。通常复层上皮的基底层表达CK5/CK14，角化上皮的基底上层表达CK1/CK10，非角化上皮的基底上层表达CK4/CK13。细胞角蛋白在上皮细胞中含量丰富且稳定，因而如能作为口腔癌前病变和口腔癌的标志将具有优越性。本研究的目的是检测CK10和CK13在从正常粘膜到口腔癌的各阶段组织中的变化，以探讨细胞角蛋白作为口腔癌前病变标志的可能性。
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1 材料和方法
1.1 标本来源 正常粘膜来自尸检。病变粘膜来自半年内全身或局部未用过激素类或维甲酸类药物的门诊患者，局麻下活检， 组织经体积分数为10%的中性福尔马林液固定，石蜡包埋，5 μm连续切片用于HE染色作病理诊断和免疫组化染色。
1.2 试剂 鼠抗人CK10单克隆抗体(DE-K10)，鼠抗人CK13单克隆抗体(DE-K13)，均为ZYMED公司产品，购自福州迈新公司。LSAB试剂盒、DAB为DAKO公司产品。
1.3 免疫组化方法 CK10抗体采用不预处理的LSAB法，用正常牙龈组织作阳性对照；CK13抗体采用胰酶处理的LSAB法，用无角化的颊粘膜作阳性对照，二者均采用PBS代替一抗作阴性对照。
1.4 结果的分析方法 HE切片的诊断由两位有经验的病理医生盲法读片确认。免疫组化结果采用半定量法判定：-阴性，±阳性细胞占基底上层的25%以下，+阳性细胞占基底上层的25%～50%,++阳性细胞占基底上层的50%～75%，+++阳性细胞占基底上层的75%以上。结果采用秩和检验分析。
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2 结 果
2.1 临床病理资料 研究对象的临床病理资料见表1。
表1 研究对象的临床病理资料
病理诊断
例数
平均年龄
部位
颊
舌背
舌腹口底
龈
正常粘膜
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45
5
4
2
2
上皮单纯增生
无过度角化
13
55
5
5
2
1
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有过度角化
18
50
7
7
3
1
轻度上皮异常增生
18
51
8
3
5
2
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中度上皮异常增生
16
52
9
6
1
0
重度上皮异常增生
15
53
6
3
6
0
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浸润癌
14
48
5
1
7
1
2.2 免疫组化染色结果 CK10和CK13为终末分化标志，不表达于基底层细胞，而分别表达于不同分化类型上皮基底上层细胞的胞浆中
正常粘膜：正常颊粘膜和口底舌腹粘膜为无角化上皮，CK10表达阴性，而基底上层CK13表达阳性(+++)；舌背粘膜为不全角化上皮，基底上层CK10表达(+)；牙龈粘膜为角化上皮，基底上层CK10表达(+++)，舌背和牙龈基底上层CK13表达(+)
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上皮单纯增生：单纯增生而无过度角化的口腔上皮，颊和舌腹CK10表达阴性，CK13在基底上层表达(++)。舌背和牙龈上皮CK10阳性(+)的细胞位于棘层浅层，CK13表达(+)。
颊和舌腹粘膜上皮过度正角化时，CK10在基底上层呈强阳性表达(+++)，过度不全角化时，CK10表达为阳性(+～++)，与CK10阴性的无角化的粘膜分界明显。舌背上皮有过度角化时，CK10表达阳性(+～++)，牙龈过度角化时，CK10表达阳性(++)。而CK13在各部位过度不全角化时表达减少，过度正角化时表达进一步减少甚至缺失。此时CK10和CK13的表达与其它各组比较有显著性差异(P<0.05)。
上皮异常增生时，不论有无角化，CK10均在异常增生处上皮全层呈阴性表达。随异型性加重，CK13阳性细胞趋向表层，阳性细胞数减少，部分完全阴性(图1)，轻、中、重度上皮异常增生三者相比有显著性差异，随异常增生程度加重，CK13表达减少。
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图 1 上皮异常增生时CK13的表达 ×40.2 随异常增生程度加重，CK13表达减少
在口腔浸润癌中，不管分化程度如何，CK13均表达阴性，而CK10在高分化鳞癌的癌巢中心分化较好的细胞中呈阳性表达(图2)，在中分化鳞癌和低分化鳞癌中，个别分化较好的癌细胞也呈阳性表达，这与CK10作为角化标志的角色是相适应的。CK10和CK13的表达与其它各组比较有显著性差异(P<0.05)。
图2 高分化磷癌中CK10表达 ×28.5 在癌巢及分化的癌细胞中CK10表达阳性。
3 讨 论
CK是上皮细胞细胞骨架的主要组成成分之一，其作用不太清楚，推测与细胞机械强度的维持和细胞内信号传导有关。
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本研究发现在上皮单纯增生的组织中，如果没有异常角化，则CK10和CK13的表达与正常组织表达相似但减少。而有过度角化存在时，则表达形式发生紊乱，颊和舌腹上皮基底上层表达CK10，而CK13表达减少，与CK10作为角化标志相吻合。
在口腔癌前病变和口腔癌中，CK13和CK10表达减少甚至缺失，与Heyden等〔2〕的研究结果相似。在口腔高分化鳞癌中，未检测到CK13，而CK10在癌巢中心分化较好的细胞表达，但Ogden等〔3〕却在高分化鳞癌中也检测到少量CK13。口腔内发生癌前病变的高危险区域通常为颊口角区、口底舌腹和软腭复合体，这些部位上皮均无角化，因而研究这些部位病变上皮CK13的表达更具有意义。
CK1/CK10为角化标志，CK4/CK13为复层上皮标志，CK5/CK14为基底细胞标志，CK10和CK13不表达于基底细胞层。Heyden等〔2〕研究发现上皮中、重度异常增生时，上皮全层均表达CK14而不表达CK13和CK10，而我们的研究发现CK13在轻、中、重度上皮异常增生时逐渐减少，表达部位逐渐移向角化层，结合Heyden等的研究结果，我们推测CK13仅表达于成熟的棘层细胞，而不表达于新形成的棘层细胞和具异型性的细胞，因而在口腔癌中未检测到CK13。CK10作为角化标志，表达于终末分化时具有角化能力和将要角化的细胞。因此，CK10和CK13与上皮细胞的分化密切相关，CK13的正常表达缺失预示着上皮的分裂增殖能力增强。
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CK的表达不仅与部位有关，而且与细胞类型和分化程度有关。本研究发现CK13和CK10在口腔癌前病变和口腔癌中表达减少或缺失，说明病变上皮的细胞类型和分化程度发生了改变。因CK表达的调控机理不清楚，故这种变化是病变的结果还是原因，目前尚无定论。Branhet等〔4〕局部用维甲酸治疗扁平苔藓和白斑时发现CK1/CK10消失，可能是由于维甲酸通过其核受体和角蛋白基因的直接作用而抑制CK10基因表达。CK的调控发生于转录水平〔5、6〕和(或)转录后水平〔7〕。但CK基因怎样调节上皮分化，CK基因与癌基因和抑制癌基因之间的相互关系，尚需进一步研究。
CK连接细胞膜和核膜，除维持细胞的机械强度外，不同的CK是否介导不同信号的传递，从而使细胞表现不同的分化和增殖状态?总之，CK的变化是口腔癌前病变中发生较早的事件，CK13表达减少或缺失可作为口腔癌前病变诊断的辅助指标，CK10可为口腔癌的分化程度及其预后判定提供帮助。
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本课题为四川省卫生厅科学研究基金资助，编号 960040
参考文献
1Velden LAVD,Schaafsma HE,Mannii JJ,et al.Cytokeratin expression in no rmal and premalignant head and neck epithelia:An overview.Head Neck,1993,15(2):133
2 Heyden A,Huitfeldt HS,Koppang HS,et al.Cytokeratins as epithelial differentiation markers in premalignant and malignant oral lesions.J Oral Pathol Med,1992,21(1):7
3 Odgen GR,Chisholm DM,Adi M,et al.Cytokeratin expression in oral cancer and its relationship to tumor differentiation.J Oral Pathol Med,1993,22(1):82
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4 Branchet MC,Boisnic S,Pascal F,et al.Topical tretinoin in the treatment of lichen planus and leukoplakia of oral mucosa.A biochemical evaluation of the keratinization.Ann Dermatol Venereol,1994,121(6):464
5 Fuchs E,Green H.Regulation of terminal differentiation of cultured human keratinocytes by vitamin A.Cell,1981,25(3):617
6 Marley JJ,Robinson PA,Hume WJ.Expression of human cytokeratin 14 in normal,premalignant and malignant oral tissue following isolation by plaque differential hybridisation.Eur J Cancer B Oral Oncol,1994,30B(5):305
7 Winter H,Schweizer J.Keratin synthesis in normal mouse epithelia and in squamous cell carcinoma:Evidence in tumors for masked mRNA species coding for high molecular weight keratin polypeptides.Proc Natl Acad Sci USA,1983,80(21):6480
(收稿：1998-10-26 修回：1999-02-15), 百拇医药