大鼠牙胚组织发育过程中釉原蛋白mRNA的表达
作者：隋 文 洪咏龙 肖明振
单位：西安第四军医大学口腔医学院 710032
关键词：釉原蛋白；牙胚；大鼠；原位杂交
大鼠牙胚组织发育过程中釉原蛋白mRNA的表达〔摘要〕 目的：观察釉原蛋白(Am)基因在大鼠牙胚组织发育过程中的表达。方法：采用原位杂交的方法，检测大鼠孕期17、18、19 d和出生后1、3、5、7、9 d牙胚中成釉细胞Am mRNA的表达。结果：从出生后1 d至出生后9 d大鼠第一磨牙牙胚中均检测到Am mRNA的表达，其中出生后第5 d表达最高，成釉细胞分泌完成后Am 的表达下降。成牙本质细胞在发育的任何时期均未见到Am 的表达。结论：釉原蛋白基因的转录只发生在牙胚发育的早期，前成釉细胞极化阶段和成釉细胞分泌阶段；发育成熟的釉基质中没有釉原蛋白。成牙本质细胞不表达釉原蛋白基因。
Amelogenin mRNA expression in developing embryonic rat teeth
, http://www.100md.com
Sui Wen, Hong Yonglong, Xiao Mingzheng.Department of Oral
Conservation,Stomatological College,Fourth Military Medical University,Xi'an 710032
〔Abstract〕Objective:To observe gene expression of amelogenin (Am) in developing embryonic wistar rat teeth.Methords:Am mRNA expression was studied with in situ hybridization.Results:Am mRNA was observed in neonatal rats (1 to 9-day-old).The highest mRNA level was found in the teeth of 5-day-old rat ,after completion of the secretory phase,Am mRNA expression reduced.There was no expression in odontoblasts.Conclusions:Amelogenin gene expression transcription occurs as early as in the polarised stage of pre-ameloblasts and in the secretory stages.There are no expressions in maturation of enaml.Odontoblasts do not transcribe the amelogenin gene.
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Key words Amelogenin;Tooth germ;In situ hybridization ;Rat
釉原蛋白(amelogenin，Am)是一族在牙釉质形成过程中的组织特异性的细胞外基质蛋白，它是由来源于原始口腔上皮的、特异性的上皮细胞——成釉细胞合成和分泌的[1]。釉原蛋白占釉质蛋白质的90%，其组成成分不是单一的，至少有9种成分，Mr 20 000～27 000，它对釉质的形成至关重要。釉原蛋白具有较复杂的生物学特性，目前以大鼠为模型探讨釉原蛋白在牙胚发育的具体时期的表达未见报道。本研究利用标记的釉原蛋白探针，对大鼠牙胚不同发育阶段釉原蛋白的表达进行原位杂交研究，探讨其生物学意义，为进一步研究釉质的生物矿化机理以及釉原蛋白的功能提供基础。
1 材料和方法
1.1 标本的制备
, http://www.100md.com
大鼠孕期为20 d，选择怀孕17、18、19 d(以E17、E18、E19表示)、出生后1、3、5、7、9 d(以PN1、PN3、PN5、PN7、PN9表示)的Wistar 大鼠，置体积分数为75%乙醇中消毒10 s，颈部横断，鼠胚头用Hank 液冲洗，取出下颌骨沿矢状切开，去除皮肤，浸入新配制的40 g/L多聚甲醛 4 ℃ 固定过夜，梯度酒精脱水，石蜡包埋，切片(厚8 μm)。玻片事先用APES处理，4 ℃保存备用。
1.2 探针及标记
用我们已克隆出的大鼠Am基因( Am cDNA 660bp)标记探针，探针的标记按照Dig-DNA Labeling Kit方法进行(Boehringer Mannheim Biochemical产品)。
1.3 原位杂交
石蜡切片经常规脱蜡至DEPC水及0.1 mol/L PBS(pH7.4)后,分别用0.2 mol/L HCl和蛋白酶K 处理, 梯度酒精脱水后室温干燥组织片。42 ℃杂交20 h后，分别经2×SCC、1×SCC、buffer Ⅰ、bufferⅡ依次充分洗涤。正常羊血清封闭50 min后,滴加抗标记碱性磷酸酶地高辛抗体30 min(37 ℃)，经bufferⅠ、bufferⅢ洗涤后用显色液(bufferⅢ 1000 μl、左旋米唑0.24 mg、NBT 4.5 μl及BCIP 3.5 μl)暗处显色，TE液(10 mmol/L Tris-HCl, 1 mmol/L EDTA, pH8.0) 终止反应,常规脱水透明封片。
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2 结 果
在第一磨牙帽状期(E17)和早期钟状期(E18、E19)的前成釉细胞中未见到Am mRNA的表达。最早观察到Am基因mRNA表达的是在PN1(钟状期)的前成釉细胞中(图1)。PN3(钟状期中期)在部分正在极化的成釉细胞中可见到表达，与 PN1相比在成釉细胞中的表达逐渐升高，成牙本质细胞中未见到表达(图2)。PN5(晚期钟状期)成釉细胞中 mRNA表达信号最强(图3)。PN7:在完全极化的成釉细胞中的表达下降。PN9:牙釉质与前期牙本质形成期，在成熟的、分泌后期的成釉细胞中可检测到比较弱的信号表达。成熟釉质和牙本质中均未检测到表达信号(图4)。
图1 PN1开始检测到Am mRNA的表达
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图2 PN3 Am mRNA表达信号增强
图3 PN5 Am mRNA表达信号最强
图4 PN9成熟釉质和牙本质中均未检测到Am mRNA表达信号
3 讨 论
牙胚的发育是一个复杂的、连续的生物学过程。在这一过程中，上皮与间充质相互作用，诱导牙胚组织细胞的增殖和分化，大鼠第一磨牙牙胚是研究成牙本质细胞和成釉细胞分化的良好模型，因为它包含了未分化的前期成牙本质细胞和内釉细胞以及正在分化的、尚未成熟的、成熟的成牙本质细胞和成釉细胞。同时它也是研究釉质矿化的良好模型，釉质矿化的整个过程都可以观察到。
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釉原蛋白是细胞外釉基质的主要蛋白种类，依据不同的种属从Mr 20 000～27 000，富含疏水性的脯氨酸。其基因结构、染色体定位和一级结构基本清楚，不同种属的釉原蛋白氨基酸序列高度同源[2]。釉原蛋白的转录与成釉细胞最初的极化有关。一旦基因开始表达，釉原蛋白随之转录[3]。内釉上皮细胞的分化是由外胚间充质细胞相互作用诱导的，以后内釉上皮细胞开始分化为成釉细胞并表达釉原蛋白。在釉基质成熟阶段，成釉细胞降低釉原蛋白的含量。虽然关于釉原蛋白确切的功能目前还不清楚，但它在釉质生物矿化的过程中起着决定性的作用，它参与Ca的转运，控制釉质晶体的生长和大小[2]。
关于釉原蛋白的异质性，有两个机理：一是在釉质发育阶段细胞外蛋白酶对新生釉原蛋白分子的降解，产生了一系列小的蛋白片段[4]；二是釉原蛋白转录时的交叉剪切[5]，这种交叉剪切发生在多种种属中，如牛、人、猪、小鼠、大鼠。有一些这样交叉剪切的mRNA 可以在蛋白水平上检测到[6]。我们用于原位杂交的探针是从大鼠cDNA质粒中转录的，包括所有七个交叉剪切位点的大部分编码序列。釉原蛋白交叉剪切的mRNA 已经在钟状期、分泌期、成熟期的成釉细胞中检测到[7]，因此在大鼠釉质发育的不同时期检测的杂交信号可以代表不同的交叉剪切产生的mRNA。
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本实验检测了釉原蛋白在Wistar 大鼠牙胚发育各期的转录，显示大鼠下颌第一磨牙最早可以检测到Am mRNA是在出生后第1 d(钟状期、前成釉细胞正在极化的时期)。出生后前四 天成釉细胞Am mRNA 水平逐渐升高，到第5 d达到最高，以后随着成釉细胞分化完成，成熟期成釉细胞中的表达持续在一个较低的水平。成牙本质细胞中未检测到表达。因此可以说Am mRNA 在分泌性成釉细胞中高表达，在分泌后期细胞中的表达逐渐下降，分泌完成以后不表达。釉原蛋白量在整个分泌阶段逐渐升高，成熟阶段的早期达到高峰，然后快速下降。成熟釉质的细胞外基质中釉原蛋白分解消失。
细胞分泌和表达的基础是细胞核内基因组有选择的逐渐关闭或开放，导致某些成分的表达被抑制，而某些特异性蛋白表达开始并逐步增强[8]。但细胞核内基因组有选择性表达并导致成釉细胞分泌、分化的调控因子有哪些，他们分别调控哪些基因的关闭和哪些基因的开放，迄今为止仍不清楚。
参考文献
, http://www.100md.com
1 Karg HA, Burger EH, Lyaruu DM, et al. Gene expression and immunolocalization of amelogenins in developing embryonic and neonatal hamster teeth. Cell Tissue Res, 1997,288:545
2 Deutsch D, Catalano-Sherman J, Dafni L, et al.Enamel matrix proteins and ameloblast biology. Connect Tissue Res. 1995,32:97
3 Krishnan H, Trawich S,Witz H. The chemistry and biology of mineralized tissue.Biochemistry,1996,25:4879
, 百拇医药
4 Robinson C,Kirkham J,Brookes SJ, et al. The chemistry of enamel development. Int J Dev Biol, 1995,31:145
5 Simmer JP. Alternative splicing of amelogenins.Connect Tissue Res, 1997,32:134
6 Robinson C , Brookes SJ, Shore RC, et al. The developing enamel matrix:Nature and function. Eur J Oral Sci, 1998,106:282
7 Girodot M, Sire JY. Evolution of the amelogenin gene in toothed and toothless vertebrates.Dev Biol,1998,106:501
8 Paine ML, Krebsbach PH, Chen LS. Protein-to-protein interactions: Criteria defining the assembly of the enamel organic matrix. J Dent Res, 1998,77:496
(收稿日期：1998-10-20 修回：1999-01-08), 百拇医药
单位：西安第四军医大学口腔医学院 710032
关键词：釉原蛋白；牙胚；大鼠；原位杂交
大鼠牙胚组织发育过程中釉原蛋白mRNA的表达〔摘要〕 目的：观察釉原蛋白(Am)基因在大鼠牙胚组织发育过程中的表达。方法：采用原位杂交的方法，检测大鼠孕期17、18、19 d和出生后1、3、5、7、9 d牙胚中成釉细胞Am mRNA的表达。结果：从出生后1 d至出生后9 d大鼠第一磨牙牙胚中均检测到Am mRNA的表达，其中出生后第5 d表达最高，成釉细胞分泌完成后Am 的表达下降。成牙本质细胞在发育的任何时期均未见到Am 的表达。结论：釉原蛋白基因的转录只发生在牙胚发育的早期，前成釉细胞极化阶段和成釉细胞分泌阶段；发育成熟的釉基质中没有釉原蛋白。成牙本质细胞不表达釉原蛋白基因。
Amelogenin mRNA expression in developing embryonic rat teeth
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Sui Wen, Hong Yonglong, Xiao Mingzheng.Department of Oral
Conservation,Stomatological College,Fourth Military Medical University,Xi'an 710032
〔Abstract〕Objective:To observe gene expression of amelogenin (Am) in developing embryonic wistar rat teeth.Methords:Am mRNA expression was studied with in situ hybridization.Results:Am mRNA was observed in neonatal rats (1 to 9-day-old).The highest mRNA level was found in the teeth of 5-day-old rat ,after completion of the secretory phase,Am mRNA expression reduced.There was no expression in odontoblasts.Conclusions:Amelogenin gene expression transcription occurs as early as in the polarised stage of pre-ameloblasts and in the secretory stages.There are no expressions in maturation of enaml.Odontoblasts do not transcribe the amelogenin gene.
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Key words Amelogenin;Tooth germ;In situ hybridization ;Rat
釉原蛋白(amelogenin，Am)是一族在牙釉质形成过程中的组织特异性的细胞外基质蛋白，它是由来源于原始口腔上皮的、特异性的上皮细胞——成釉细胞合成和分泌的[1]。釉原蛋白占釉质蛋白质的90%，其组成成分不是单一的，至少有9种成分，Mr 20 000～27 000，它对釉质的形成至关重要。釉原蛋白具有较复杂的生物学特性，目前以大鼠为模型探讨釉原蛋白在牙胚发育的具体时期的表达未见报道。本研究利用标记的釉原蛋白探针，对大鼠牙胚不同发育阶段釉原蛋白的表达进行原位杂交研究，探讨其生物学意义，为进一步研究釉质的生物矿化机理以及釉原蛋白的功能提供基础。
1 材料和方法
1.1 标本的制备
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大鼠孕期为20 d，选择怀孕17、18、19 d(以E17、E18、E19表示)、出生后1、3、5、7、9 d(以PN1、PN3、PN5、PN7、PN9表示)的Wistar 大鼠，置体积分数为75%乙醇中消毒10 s，颈部横断，鼠胚头用Hank 液冲洗，取出下颌骨沿矢状切开，去除皮肤，浸入新配制的40 g/L多聚甲醛 4 ℃ 固定过夜，梯度酒精脱水，石蜡包埋，切片(厚8 μm)。玻片事先用APES处理，4 ℃保存备用。
1.2 探针及标记
用我们已克隆出的大鼠Am基因( Am cDNA 660bp)标记探针，探针的标记按照Dig-DNA Labeling Kit方法进行(Boehringer Mannheim Biochemical产品)。
1.3 原位杂交
石蜡切片经常规脱蜡至DEPC水及0.1 mol/L PBS(pH7.4)后,分别用0.2 mol/L HCl和蛋白酶K 处理, 梯度酒精脱水后室温干燥组织片。42 ℃杂交20 h后，分别经2×SCC、1×SCC、buffer Ⅰ、bufferⅡ依次充分洗涤。正常羊血清封闭50 min后,滴加抗标记碱性磷酸酶地高辛抗体30 min(37 ℃)，经bufferⅠ、bufferⅢ洗涤后用显色液(bufferⅢ 1000 μl、左旋米唑0.24 mg、NBT 4.5 μl及BCIP 3.5 μl)暗处显色，TE液(10 mmol/L Tris-HCl, 1 mmol/L EDTA, pH8.0) 终止反应,常规脱水透明封片。
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2 结 果
在第一磨牙帽状期(E17)和早期钟状期(E18、E19)的前成釉细胞中未见到Am mRNA的表达。最早观察到Am基因mRNA表达的是在PN1(钟状期)的前成釉细胞中(图1)。PN3(钟状期中期)在部分正在极化的成釉细胞中可见到表达，与 PN1相比在成釉细胞中的表达逐渐升高，成牙本质细胞中未见到表达(图2)。PN5(晚期钟状期)成釉细胞中 mRNA表达信号最强(图3)。PN7:在完全极化的成釉细胞中的表达下降。PN9:牙釉质与前期牙本质形成期，在成熟的、分泌后期的成釉细胞中可检测到比较弱的信号表达。成熟釉质和牙本质中均未检测到表达信号(图4)。
图1 PN1开始检测到Am mRNA的表达
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图2 PN3 Am mRNA表达信号增强
图3 PN5 Am mRNA表达信号最强
图4 PN9成熟釉质和牙本质中均未检测到Am mRNA表达信号
3 讨 论
牙胚的发育是一个复杂的、连续的生物学过程。在这一过程中，上皮与间充质相互作用，诱导牙胚组织细胞的增殖和分化，大鼠第一磨牙牙胚是研究成牙本质细胞和成釉细胞分化的良好模型，因为它包含了未分化的前期成牙本质细胞和内釉细胞以及正在分化的、尚未成熟的、成熟的成牙本质细胞和成釉细胞。同时它也是研究釉质矿化的良好模型，釉质矿化的整个过程都可以观察到。
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釉原蛋白是细胞外釉基质的主要蛋白种类，依据不同的种属从Mr 20 000～27 000，富含疏水性的脯氨酸。其基因结构、染色体定位和一级结构基本清楚，不同种属的釉原蛋白氨基酸序列高度同源[2]。釉原蛋白的转录与成釉细胞最初的极化有关。一旦基因开始表达，釉原蛋白随之转录[3]。内釉上皮细胞的分化是由外胚间充质细胞相互作用诱导的，以后内釉上皮细胞开始分化为成釉细胞并表达釉原蛋白。在釉基质成熟阶段，成釉细胞降低釉原蛋白的含量。虽然关于釉原蛋白确切的功能目前还不清楚，但它在釉质生物矿化的过程中起着决定性的作用，它参与Ca的转运，控制釉质晶体的生长和大小[2]。
关于釉原蛋白的异质性，有两个机理：一是在釉质发育阶段细胞外蛋白酶对新生釉原蛋白分子的降解，产生了一系列小的蛋白片段[4]；二是釉原蛋白转录时的交叉剪切[5]，这种交叉剪切发生在多种种属中，如牛、人、猪、小鼠、大鼠。有一些这样交叉剪切的mRNA 可以在蛋白水平上检测到[6]。我们用于原位杂交的探针是从大鼠cDNA质粒中转录的，包括所有七个交叉剪切位点的大部分编码序列。釉原蛋白交叉剪切的mRNA 已经在钟状期、分泌期、成熟期的成釉细胞中检测到[7]，因此在大鼠釉质发育的不同时期检测的杂交信号可以代表不同的交叉剪切产生的mRNA。
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本实验检测了釉原蛋白在Wistar 大鼠牙胚发育各期的转录，显示大鼠下颌第一磨牙最早可以检测到Am mRNA是在出生后第1 d(钟状期、前成釉细胞正在极化的时期)。出生后前四 天成釉细胞Am mRNA 水平逐渐升高，到第5 d达到最高，以后随着成釉细胞分化完成，成熟期成釉细胞中的表达持续在一个较低的水平。成牙本质细胞中未检测到表达。因此可以说Am mRNA 在分泌性成釉细胞中高表达，在分泌后期细胞中的表达逐渐下降，分泌完成以后不表达。釉原蛋白量在整个分泌阶段逐渐升高，成熟阶段的早期达到高峰，然后快速下降。成熟釉质的细胞外基质中釉原蛋白分解消失。
细胞分泌和表达的基础是细胞核内基因组有选择的逐渐关闭或开放，导致某些成分的表达被抑制，而某些特异性蛋白表达开始并逐步增强[8]。但细胞核内基因组有选择性表达并导致成釉细胞分泌、分化的调控因子有哪些，他们分别调控哪些基因的关闭和哪些基因的开放，迄今为止仍不清楚。
参考文献
, http://www.100md.com
1 Karg HA, Burger EH, Lyaruu DM, et al. Gene expression and immunolocalization of amelogenins in developing embryonic and neonatal hamster teeth. Cell Tissue Res, 1997,288:545
2 Deutsch D, Catalano-Sherman J, Dafni L, et al.Enamel matrix proteins and ameloblast biology. Connect Tissue Res. 1995,32:97
3 Krishnan H, Trawich S,Witz H. The chemistry and biology of mineralized tissue.Biochemistry,1996,25:4879
, 百拇医药
4 Robinson C,Kirkham J,Brookes SJ, et al. The chemistry of enamel development. Int J Dev Biol, 1995,31:145
5 Simmer JP. Alternative splicing of amelogenins.Connect Tissue Res, 1997,32:134
6 Robinson C , Brookes SJ, Shore RC, et al. The developing enamel matrix:Nature and function. Eur J Oral Sci, 1998,106:282
7 Girodot M, Sire JY. Evolution of the amelogenin gene in toothed and toothless vertebrates.Dev Biol,1998,106:501
8 Paine ML, Krebsbach PH, Chen LS. Protein-to-protein interactions: Criteria defining the assembly of the enamel organic matrix. J Dent Res, 1998,77:496
(收稿日期：1998-10-20 修回：1999-01-08), 百拇医药