BALB/C近交系小鼠腭裂模型的建立及形态学观察
作者：吕红兵 李 鑫 金 岩 董绍忠
单位：西安第四军医大学口腔医学院 710032
关键词：腭裂；维生素A酸类；地塞米松；动物模型
BALB〔摘要〕 目的：研究维甲酸和地塞米松联合用药对BALB/C 近交系小鼠腭部发育的影响。方法：将BALB/C 系孕鼠分为给药组和对照组，在妊娠第12 d分别给药，并于妊娠期第138, 1320, 148, 1420, 158, 1520, 168 d处死孕鼠，取胎鼠头部做冠状切片，HE 染色，进行观察。结果：维甲酸和地塞米松联合用药可诱导BALB/C 系小鼠形成腭裂，其主要原因是腭突上抬延迟。结论：维甲酸和地塞米松联合应用诱导BALB/C 近交系小鼠形成腭裂是一种稳定的腭裂动物模型。
, 百拇医药
The establishment of cleft palate model and observation of
its morphogenesis in BALB/C mice
Lu Hongbing,Li Xin,Jin Yan,et al.Department of Oral Pathology,Stomatological College,Fourth Military Medical University,Xi'an 710032
〔Abstract〕Objective:To study the effects of retinoic acid(RA) and dexamethasone (DEX) on the palate development in BALB/C mice.Method:Pregnant BALB/C mice were divided into treated group and control group.In the treated group,the mice were dosed on GD12 with RA(100 mg/kg) and DEX(10 mg/kg).The mice were killed on day 138,1220,148,1420,158，1520,168,respectively.The coronal sections of the heads of the embryonic mice were prepared,stained with HE and observed microscopically.Result:Cleft palate was induced in BALB/C mice by the coadministration of RA with DEX,because the development of palate shelves was delayed.Conclusion:Coadministion of RA with DEX can induce cleft palate in BALB/C mice,and can be used to establish stable model of cleft palate.
, 百拇医药
Key Words Cleft palate;Retinoic acid;Dexamethasone;Animal model
小鼠的腭部发育与腭裂形成与人十分相似，目前对人的腭裂研究多以小鼠来替代，但由于小鼠种系繁多，且对各种药物的敏感性不同，因而腭裂的动物模型也多种多样 。 国外学者多采用C57BL/6N 系小鼠进行研究，但因饲养条件、药物种类等要求均较高，且受动物种系所限，因此不适合于国内腭裂研究的大量开展[1]。本试验采用常用的两种药物维甲酸(retinoic acid, RA)和地塞米松(dexamethone,DEX)作为复合型致畸剂，诱导常用的BALB/C 近交系小鼠产生腭裂，为今后腭裂的大量研究提供了可靠的动物模型。
1 材料与方法
1.1 实验动物 前一天将8～10 周的BALB/C近交系小鼠，按3∶1的雌雄比例同笼，次日上午8:00观察雌鼠的阴栓形成情况，有阴栓者为受孕鼠，并将该日定为妊娠GD 0 d(gestation day,GD)。在GD1215(表示妊娠期第12 d第15 h)，将14 只孕鼠按1:1 的比例随机分为给药组和对照组，同时给药。给药组：管饲维甲酸(每千克体重给100 mg)(上海第六制药厂)，同时腹腔注射地塞米松(每千克体重给10 mg)。对照组：管饲无菌生理盐水(每千克体重给10 mg), 同时腹腔注射无菌生理盐水(每千克体重给10 mg)。
, http://www.100md.com
1.2 标本制备及染色 分别于GD138、1320、148、1420、158、1520、168用脱椎法处死孕鼠，取出胎鼠，将头部标本固定于40 g/L多聚甲醛，脱水后常规石蜡包埋，做5 μm冠状切片，HE 染色，光镜下观察腭部发育。
2 结 果
从形态上观察，BALB/C 系小鼠腭部的正常发育大致可分为五个阶段：① 腭突发生期; ② 腭突向下垂直生长期; ③ 腭突上抬期; ④ 腭突水平生长期，⑤ 腭突融合期。以下各个时间点是BALB/C系小鼠腭部的正常发育情况：GD1220至GD138，舌体占据了口腔的大部分空间，此时腭突刚刚形成，侧腭突沿着舌体两侧向下生长。GD138至GD1420，随着舌体的生长，侧腭突继续向下生长(图1)。GD1420至GD1520,下颌骨的发育使得舌体继续下降，腭突逐步开始上抬(图2)。GD1520腭突上抬并向水平方向生长。GD168两侧腭突已经融合(图3)。
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图1 对照组GD148，腭突开始沿舌体两侧下降，HE染色，×20
图2 对照组GD158，腭突开始上抬，HE染色，×20
图3 对照组GD168，腭突已完全融合，HE染色，×20
给药组GD13, GD14 与对照组相比无明显变化，腭突的生长方式都是垂直向下生长，GD158至GD1520，对照组腭突开始上抬，而给药组的腭突单侧或双侧上抬延迟。在GD168，对照组的腭突已完全融合，给药组由于腭突上抬延迟，两侧腭突不能完全融合(图4)。GD1520和GD168共取胎鼠19 只，其中单侧或双侧腭裂的有16 只，腭裂发生率达84.2%。
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图4 给药组GD168，两侧腭突不能融合，HE染色，×20
3 讨 论
研究表明，BALB/C 近交系小鼠的腭部发育为妊娠期第13至16 d。RA 和DEX 联合用药对腭突垂直生长期无明显作用，其作用时间主要在GD15 的腭突上抬期。给药后，腭突上抬明显延迟，比对照组上抬期约晚12 h，以致两侧腭突不能融合。
BALB/C 近交系小鼠在医学研究中应用十分广泛，该小鼠对温度、环境、水分、饲料的要求都不高，一般的实验室都可以饲养，且繁殖力强，产仔多，每窝约8～12 只，很适合建立腭裂的动物模型。目前国外的腭裂研究多用C57BL/6N近交系小鼠，较少采用BALB/C 系小鼠，可能是因为RA 等致畸药物诱导BALB/C 系小鼠的腭裂发生率不太高。本文研究结果表明，RA和DEX 联合用药，其腭裂发生率可达84.2%。作者也尝试用C57BL/6N 近交系小鼠做腭裂试验，发现在GD10 给RA (每千克体重给100 mg)后，腭裂发生率确实可达100%，但该种系小鼠体形较小，饲养条件要求较高，如温度要求在18～25 ℃之间，过冷过热均不利于小鼠的生长，而且在妊娠期间要经常给予高脂饲料，另外，C57BL/6N 系小鼠繁殖力较低，每窝约5～8 只，产后易食仔鼠，这些不利因素都给腭裂研究带来了困难。与C57BL/6N 系小鼠的腭部发育相比，BALB/C 近交系小鼠的腭部发育要晚12 h左右，其他种系如A系、NIH 系则存在应用不够普及的缺点。因此，与C57BL/6N 系和其他种系的小鼠比较，BALB/C 系小鼠的优点十分明显。
, 百拇医药
维甲酸是维生素A的衍生物，其临床应用十分广泛，例如在白血病的治疗中，它可诱导早幼粒细胞向中幼粒细胞、晚幼粒细胞的分化，也可以诱导分化较差的肿瘤细胞向成熟的细胞分化，还可以促进正常的未分化间充质细胞向成熟细胞的分化。体外试验表明维甲酸可诱导未分化间充质细胞分化为骨细胞和软骨细胞[2]。因此，维甲酸诱导腭裂的发生可能与它诱导未分化间充质细胞的过早分化有关。也有学者认为RA 改变了面部突起间充质细胞内的信号分子Shh 及其受体Patched 的表达所引起的[3]。Abbott 等人用RA 诱导C57BL/6N 系小鼠产生腭裂，并观察了腭突中TGF-βs 随时间的变化。在给药组和对照组中，TGF-β1的表达都是逐渐升高，而 TGF-α和TGF-β2 的表达则有所变化[4]。 地塞米松可与细胞膜上的受体结合，正常情况下，其受体在分化旺盛的细胞中和活跃的骨形态发生区表达较多，用地塞米松诱导小鼠产生腭裂后，其受体的表达量发生变化，进而引起各种生长因子如：TGF-α、TGF-βs、EGF等的变化，使细胞的生长和分化状态发生改变[5]。 Chepenik等人[6]的实验表明， 用地塞米松可使腭突细胞中的annexins表达升高，annexins与细胞的生长、细胞膜融合、信号转导有关，在腭裂的发生有重要作用。
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本实验研究表明，RA 和DEX 联合应用可诱导BALB/C 产生腭裂，这种方法无论是药物种类，还是小鼠种系，要求都不高，适用于以后研究的广泛开展。
参考文献
1 Birnbaum LS, Harris MW, Stocking LM, et al. Retinoic acid and 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin selectively enhance tetraogenesis in C57BL/6N mice. Toxicol Appl Pharmacol, 1989,98:487
2. Lammer EJ,Chen DT, Hoar RM, et al. Retinoic acid embryopathy. N Engl J Med, 1985,313:837
3. Helms JA, Kim CH, Hu D, et al. Sonic hedgehog participates in craniofacial morphogenesis and is down-regulated by teratogenic doses of retinoic acid. Dev Biol, 1997, 187(1): 25
, 百拇医药
4. Abbott BD, Harris MW, Birnbaum LS. Comparisons of the effects of TCDD and hydrocortisone on growth factor expression provide insight into their interaction in the embryonic mouse palate. Teratology, 1992,45:35
5. Abbott BD, Mcnabb FMA, Lau L. Glucocorticoid receptor expression during the development of the embryonic mouse secondary palate. J Craniofac Genet Dev Biol, 1994,14:87
6. Chepenik KP,Shipman-Appasamy P, Ahn N, et al. Developmental regulation of various annexins in the embryonic palate of the mouse: Dexamethasone affects expression of annexin-1. J Craniofac Genet Dev Biol, 1995,15(4): 171
(收稿：1998-05-18 修回：1999-01-10), 百拇医药
单位：西安第四军医大学口腔医学院 710032
关键词：腭裂；维生素A酸类；地塞米松；动物模型
BALB〔摘要〕 目的：研究维甲酸和地塞米松联合用药对BALB/C 近交系小鼠腭部发育的影响。方法：将BALB/C 系孕鼠分为给药组和对照组，在妊娠第12 d分别给药，并于妊娠期第138, 1320, 148, 1420, 158, 1520, 168 d处死孕鼠，取胎鼠头部做冠状切片，HE 染色，进行观察。结果：维甲酸和地塞米松联合用药可诱导BALB/C 系小鼠形成腭裂，其主要原因是腭突上抬延迟。结论：维甲酸和地塞米松联合应用诱导BALB/C 近交系小鼠形成腭裂是一种稳定的腭裂动物模型。
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The establishment of cleft palate model and observation of
its morphogenesis in BALB/C mice
Lu Hongbing,Li Xin,Jin Yan,et al.Department of Oral Pathology,Stomatological College,Fourth Military Medical University,Xi'an 710032
〔Abstract〕Objective:To study the effects of retinoic acid(RA) and dexamethasone (DEX) on the palate development in BALB/C mice.Method:Pregnant BALB/C mice were divided into treated group and control group.In the treated group,the mice were dosed on GD12 with RA(100 mg/kg) and DEX(10 mg/kg).The mice were killed on day 138,1220,148,1420,158，1520,168,respectively.The coronal sections of the heads of the embryonic mice were prepared,stained with HE and observed microscopically.Result:Cleft palate was induced in BALB/C mice by the coadministration of RA with DEX,because the development of palate shelves was delayed.Conclusion:Coadministion of RA with DEX can induce cleft palate in BALB/C mice,and can be used to establish stable model of cleft palate.
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Key Words Cleft palate;Retinoic acid;Dexamethasone;Animal model
小鼠的腭部发育与腭裂形成与人十分相似，目前对人的腭裂研究多以小鼠来替代，但由于小鼠种系繁多，且对各种药物的敏感性不同，因而腭裂的动物模型也多种多样 。 国外学者多采用C57BL/6N 系小鼠进行研究，但因饲养条件、药物种类等要求均较高，且受动物种系所限，因此不适合于国内腭裂研究的大量开展[1]。本试验采用常用的两种药物维甲酸(retinoic acid, RA)和地塞米松(dexamethone,DEX)作为复合型致畸剂，诱导常用的BALB/C 近交系小鼠产生腭裂，为今后腭裂的大量研究提供了可靠的动物模型。
1 材料与方法
1.1 实验动物 前一天将8～10 周的BALB/C近交系小鼠，按3∶1的雌雄比例同笼，次日上午8:00观察雌鼠的阴栓形成情况，有阴栓者为受孕鼠，并将该日定为妊娠GD 0 d(gestation day,GD)。在GD1215(表示妊娠期第12 d第15 h)，将14 只孕鼠按1:1 的比例随机分为给药组和对照组，同时给药。给药组：管饲维甲酸(每千克体重给100 mg)(上海第六制药厂)，同时腹腔注射地塞米松(每千克体重给10 mg)。对照组：管饲无菌生理盐水(每千克体重给10 mg), 同时腹腔注射无菌生理盐水(每千克体重给10 mg)。
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1.2 标本制备及染色 分别于GD138、1320、148、1420、158、1520、168用脱椎法处死孕鼠，取出胎鼠，将头部标本固定于40 g/L多聚甲醛，脱水后常规石蜡包埋，做5 μm冠状切片，HE 染色，光镜下观察腭部发育。
2 结 果
从形态上观察，BALB/C 系小鼠腭部的正常发育大致可分为五个阶段：① 腭突发生期; ② 腭突向下垂直生长期; ③ 腭突上抬期; ④ 腭突水平生长期，⑤ 腭突融合期。以下各个时间点是BALB/C系小鼠腭部的正常发育情况：GD1220至GD138，舌体占据了口腔的大部分空间，此时腭突刚刚形成，侧腭突沿着舌体两侧向下生长。GD138至GD1420，随着舌体的生长，侧腭突继续向下生长(图1)。GD1420至GD1520,下颌骨的发育使得舌体继续下降，腭突逐步开始上抬(图2)。GD1520腭突上抬并向水平方向生长。GD168两侧腭突已经融合(图3)。
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图1 对照组GD148，腭突开始沿舌体两侧下降，HE染色，×20
图2 对照组GD158，腭突开始上抬，HE染色，×20
图3 对照组GD168，腭突已完全融合，HE染色，×20
给药组GD13, GD14 与对照组相比无明显变化，腭突的生长方式都是垂直向下生长，GD158至GD1520，对照组腭突开始上抬，而给药组的腭突单侧或双侧上抬延迟。在GD168，对照组的腭突已完全融合，给药组由于腭突上抬延迟，两侧腭突不能完全融合(图4)。GD1520和GD168共取胎鼠19 只，其中单侧或双侧腭裂的有16 只，腭裂发生率达84.2%。
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图4 给药组GD168，两侧腭突不能融合，HE染色，×20
3 讨 论
研究表明，BALB/C 近交系小鼠的腭部发育为妊娠期第13至16 d。RA 和DEX 联合用药对腭突垂直生长期无明显作用，其作用时间主要在GD15 的腭突上抬期。给药后，腭突上抬明显延迟，比对照组上抬期约晚12 h，以致两侧腭突不能融合。
BALB/C 近交系小鼠在医学研究中应用十分广泛，该小鼠对温度、环境、水分、饲料的要求都不高，一般的实验室都可以饲养，且繁殖力强，产仔多，每窝约8～12 只，很适合建立腭裂的动物模型。目前国外的腭裂研究多用C57BL/6N近交系小鼠，较少采用BALB/C 系小鼠，可能是因为RA 等致畸药物诱导BALB/C 系小鼠的腭裂发生率不太高。本文研究结果表明，RA和DEX 联合用药，其腭裂发生率可达84.2%。作者也尝试用C57BL/6N 近交系小鼠做腭裂试验，发现在GD10 给RA (每千克体重给100 mg)后，腭裂发生率确实可达100%，但该种系小鼠体形较小，饲养条件要求较高，如温度要求在18～25 ℃之间，过冷过热均不利于小鼠的生长，而且在妊娠期间要经常给予高脂饲料，另外，C57BL/6N 系小鼠繁殖力较低，每窝约5～8 只，产后易食仔鼠，这些不利因素都给腭裂研究带来了困难。与C57BL/6N 系小鼠的腭部发育相比，BALB/C 近交系小鼠的腭部发育要晚12 h左右，其他种系如A系、NIH 系则存在应用不够普及的缺点。因此，与C57BL/6N 系和其他种系的小鼠比较，BALB/C 系小鼠的优点十分明显。
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维甲酸是维生素A的衍生物，其临床应用十分广泛，例如在白血病的治疗中，它可诱导早幼粒细胞向中幼粒细胞、晚幼粒细胞的分化，也可以诱导分化较差的肿瘤细胞向成熟的细胞分化，还可以促进正常的未分化间充质细胞向成熟细胞的分化。体外试验表明维甲酸可诱导未分化间充质细胞分化为骨细胞和软骨细胞[2]。因此，维甲酸诱导腭裂的发生可能与它诱导未分化间充质细胞的过早分化有关。也有学者认为RA 改变了面部突起间充质细胞内的信号分子Shh 及其受体Patched 的表达所引起的[3]。Abbott 等人用RA 诱导C57BL/6N 系小鼠产生腭裂，并观察了腭突中TGF-βs 随时间的变化。在给药组和对照组中，TGF-β1的表达都是逐渐升高，而 TGF-α和TGF-β2 的表达则有所变化[4]。 地塞米松可与细胞膜上的受体结合，正常情况下，其受体在分化旺盛的细胞中和活跃的骨形态发生区表达较多，用地塞米松诱导小鼠产生腭裂后，其受体的表达量发生变化，进而引起各种生长因子如：TGF-α、TGF-βs、EGF等的变化，使细胞的生长和分化状态发生改变[5]。 Chepenik等人[6]的实验表明， 用地塞米松可使腭突细胞中的annexins表达升高，annexins与细胞的生长、细胞膜融合、信号转导有关，在腭裂的发生有重要作用。
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本实验研究表明，RA 和DEX 联合应用可诱导BALB/C 产生腭裂，这种方法无论是药物种类，还是小鼠种系，要求都不高，适用于以后研究的广泛开展。
参考文献
1 Birnbaum LS, Harris MW, Stocking LM, et al. Retinoic acid and 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin selectively enhance tetraogenesis in C57BL/6N mice. Toxicol Appl Pharmacol, 1989,98:487
2. Lammer EJ,Chen DT, Hoar RM, et al. Retinoic acid embryopathy. N Engl J Med, 1985,313:837
3. Helms JA, Kim CH, Hu D, et al. Sonic hedgehog participates in craniofacial morphogenesis and is down-regulated by teratogenic doses of retinoic acid. Dev Biol, 1997, 187(1): 25
, 百拇医药
4. Abbott BD, Harris MW, Birnbaum LS. Comparisons of the effects of TCDD and hydrocortisone on growth factor expression provide insight into their interaction in the embryonic mouse palate. Teratology, 1992,45:35
5. Abbott BD, Mcnabb FMA, Lau L. Glucocorticoid receptor expression during the development of the embryonic mouse secondary palate. J Craniofac Genet Dev Biol, 1994,14:87
6. Chepenik KP,Shipman-Appasamy P, Ahn N, et al. Developmental regulation of various annexins in the embryonic palate of the mouse: Dexamethasone affects expression of annexin-1. J Craniofac Genet Dev Biol, 1995,15(4): 171
(收稿：1998-05-18 修回：1999-01-10), 百拇医药