盐酸氮芥对Tca8113 细胞即时杀伤效应的观察
作者：梁荣奇 吴繁来 张永福
单位：广西柳州市工人医院口腔科(梁荣奇 吴繁来)；江西医学院口腔系(张永福)
关键词：
实用口腔医学杂志990444 肿瘤手术中，用抗癌药物盐酸氮芥冲洗或湿敷创面，洗涤器械，以打击脱落的癌细胞，已被列为无瘤操作常规。但是其不同的浓度及作用时间是否能有效地抑制癌细胞，尚无有关实验根据。本实验目的在于评价盐酸氮芥在不同的作用时间及浓度条件下的抗癌效应。
1 材料和方法
1.1 细胞系
人舌鳞状细胞癌Tca8113细胞，上海第二医科大学第九人民医院建株。培养条件：37 ℃，φ=5% CO2细胞培养箱。培养液用美国产RPMI 1640，含φ=15%小牛血清。用2.5 g/L胰蛋白酶消化收集细胞。选用处于对数生长期细胞作实验。适应48 h后投药处理。
, 百拇医药
1.2 抗癌药物
盐酸氮芥注射剂(nitrogen mastard,HN2)规格5g/L，上海海普制药厂生产。参照临床常用冲洗浓度50 mg/L，作倍数稀释成下列浓度：100 mg/L，50 mg/L,25 mg/L,12.5 mg/L。以9 g/L生理盐水稀释。对照组为9 g/L生理盐水溶液。
1.3 方法
1.3.1 盐酸氮芥不同作用时间及浓度的即时杀伤细胞效应。取HN2的下列浓度:12.5、25、50、100 mg/L，分别作用癌细胞5、15、30 min。实验用24孔培养板，每孔加入细胞悬液1 ml(105细胞)，培养48 h后作实验处理。即倒去上层培养液，每孔加入1 ml HN2溶液，对照孔加入9 g/L生理盐水1 ml。终止作用后去除药液，再用37 ℃ Hank液(pH=6.8～7.0)洗涤3次。最后每孔加入1 ml新鲜培养液，培养24 h。用3 g/L台盼蓝计数活细胞数，共进行4次复孔实验〔1〕。
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1.3.2 药物作用后对残余活细胞再增殖能力的影响。实验分组及方法同1.3.1所述。共设置2个复孔。每天观察细胞生长情况，每4 d更换培养液1次。细胞悬浮、碎裂作为死亡标准〔2〕。
1.3.3 结果统计:以计量资数计算统计结果，用方差分析方法。
2 结 果
2.1 即时杀伤癌细胞效应
以抑制率≥50%为有效抑制浓度。表1为HN2对癌细胞数的影响。表明HN2的即时杀伤效应呈现时间及浓度依赖性。HN2作用5、15、30 min，最低有效抑制浓度分别为：50 mg/L：抑制率=52.2%,5 min；25 mg/L：抑制率=53.4%，15 min；12.5 mg/L：抑制率=56.6%，30 min。
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表1 HN2不同浓度不同作用时间对癌细胞数的影响
分组
30 min
15min
5min
活细胞数×107/L①
活细胞×107/L①
细胞数×107/L①
±s(孔)
抑制率%±s(孔)
, 百拇医药
抑制率%±s(孔)
抑制率%
生理盐水
21.75±0.58
21.97±0.83
24.18±0.72
12.5 mg/L
9.43±5.39③
56.6
16.04±6.22②③
, http://www.100md.com
27.0
14.00±2.89③
42.0
25.0 mg/L
9.10±3.12
58.2
10.24±1.79
53.4
14.24±2.04③
41.0
50.0 mg/L
8.23±3.08③
, 百拇医药
62.2
10.55±1.17②
52.0
11.57±2.78②
52.2
100.0 mg/L
4.61±3.37②③
78.8
6.24±2.22②③
71.6
6.41±3.41②
, 百拇医药
73.5
①为4次复孔的均值； ②剂量相邻两组比较P<0.05， ③时间相邻两组比较P<0.05,余为P>0.05表2 HN2作用于癌细胞结果的方差分析 变异来源
ss
ν
MS
F
P
时间变异
31.29
2
15.65
, 百拇医药
7.08
<0.05
剂量变异
467.98
4
116.99
52.94
<0.01
误差
17.66
8
2.21
总变异
, http://www.100md.com
516.93
14
2.2 HN2作用后对残余细胞增殖的影响
生理盐水作用5、15、30 min后，再继续进行细胞培养，细胞受到轻度抑制，但仍能继续增殖。而HN2组，无论高浓度或低浓度，细胞均不能再生长。各实验组的癌细胞死亡时间分别为：100 mg/L→2 d,4 d,6 d;50 mg/L→4 d,6 d,6 d;25m/L→5 d,7 d,8 d;12.5mg/L→6 d,8 d,8 d(从左向右分别为30 min，15 min，5 min作用时间)。
3 讨 论
恶性肿瘤手术后复发是当今癌瘤外科最棘手的问题，术后复发的原因中相当一部分为种植复发。因此，术中用一些抗癌药物冲洗创面已被视为恶性肿瘤手术规范。Madonld等〔2〕，首先对Walkel 256瘤小鼠用HN2 10～20 mg/L作创面冲洗，抑制率为98%以上。并且认为，用9 g/L生理盐水冲洗，不能有效打击脱落的癌细胞。HN2对口腔癌的作用如何，尚无有关的实验依据。基于此，作者以Tca8113细胞作为体外模型，更准确地为临床提供一些有关依据。
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本实验结果显示HN2的即时杀伤癌细胞效果表现为时间及浓度的依赖性。而且残余的活细胞均不能再增殖生长。可能的解释是，HN2是一种烷化剂类抗癌药物，分子结构上有活跃的烷化基团，能够有效地、不可逆转地抑制细胞DNA的合成〔3〕。
多数抗癌药物(如氮芥)均能抑制手术后创口的愈合，而且与其浓度及时间有关。从临床实用出发，选择最低有效浓度及时间，可最大限度地减少抗癌药物的副作用。本实验观察到，HN2最低有效浓度及时间为：25 mg/L，5 min；50 mg/L，15 min；12.5 mg/L，30 min。
参考文献
1 大星章一，营野晴夫主编.人癌细胞培养.北京：科学技术出版社，1979.66
2 Mcdonald Go,Gines SM,Cole M,et al.Wound irrigation in cancer surgery.Am Med Assoc Arch Surg,1960,80:60
3 王炎,韩锐.主编.肿瘤药物治疗.北京：人民卫生出版社，1987.53
(收稿：1998-07-10 修回：1998-12-15), 百拇医药
单位：广西柳州市工人医院口腔科(梁荣奇 吴繁来)；江西医学院口腔系(张永福)
关键词：
实用口腔医学杂志990444 肿瘤手术中，用抗癌药物盐酸氮芥冲洗或湿敷创面，洗涤器械，以打击脱落的癌细胞，已被列为无瘤操作常规。但是其不同的浓度及作用时间是否能有效地抑制癌细胞，尚无有关实验根据。本实验目的在于评价盐酸氮芥在不同的作用时间及浓度条件下的抗癌效应。
1 材料和方法
1.1 细胞系
人舌鳞状细胞癌Tca8113细胞，上海第二医科大学第九人民医院建株。培养条件：37 ℃，φ=5% CO2细胞培养箱。培养液用美国产RPMI 1640，含φ=15%小牛血清。用2.5 g/L胰蛋白酶消化收集细胞。选用处于对数生长期细胞作实验。适应48 h后投药处理。
, 百拇医药
1.2 抗癌药物
盐酸氮芥注射剂(nitrogen mastard,HN2)规格5g/L，上海海普制药厂生产。参照临床常用冲洗浓度50 mg/L，作倍数稀释成下列浓度：100 mg/L，50 mg/L,25 mg/L,12.5 mg/L。以9 g/L生理盐水稀释。对照组为9 g/L生理盐水溶液。
1.3 方法
1.3.1 盐酸氮芥不同作用时间及浓度的即时杀伤细胞效应。取HN2的下列浓度:12.5、25、50、100 mg/L，分别作用癌细胞5、15、30 min。实验用24孔培养板，每孔加入细胞悬液1 ml(105细胞)，培养48 h后作实验处理。即倒去上层培养液，每孔加入1 ml HN2溶液，对照孔加入9 g/L生理盐水1 ml。终止作用后去除药液，再用37 ℃ Hank液(pH=6.8～7.0)洗涤3次。最后每孔加入1 ml新鲜培养液，培养24 h。用3 g/L台盼蓝计数活细胞数，共进行4次复孔实验〔1〕。
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1.3.2 药物作用后对残余活细胞再增殖能力的影响。实验分组及方法同1.3.1所述。共设置2个复孔。每天观察细胞生长情况，每4 d更换培养液1次。细胞悬浮、碎裂作为死亡标准〔2〕。
1.3.3 结果统计:以计量资数计算统计结果，用方差分析方法。
2 结 果
2.1 即时杀伤癌细胞效应
以抑制率≥50%为有效抑制浓度。表1为HN2对癌细胞数的影响。表明HN2的即时杀伤效应呈现时间及浓度依赖性。HN2作用5、15、30 min，最低有效抑制浓度分别为：50 mg/L：抑制率=52.2%,5 min；25 mg/L：抑制率=53.4%，15 min；12.5 mg/L：抑制率=56.6%，30 min。
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表1 HN2不同浓度不同作用时间对癌细胞数的影响
分组
30 min
15min
5min
活细胞数×107/L①
活细胞×107/L①
细胞数×107/L①
±s(孔)抑制率%
±s(孔), 百拇医药
抑制率%
±s(孔)抑制率%
生理盐水
21.75±0.58
21.97±0.83
24.18±0.72
12.5 mg/L
9.43±5.39③
56.6
16.04±6.22②③
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27.0
14.00±2.89③
42.0
25.0 mg/L
9.10±3.12
58.2
10.24±1.79
53.4
14.24±2.04③
41.0
50.0 mg/L
8.23±3.08③
, 百拇医药
62.2
10.55±1.17②
52.0
11.57±2.78②
52.2
100.0 mg/L
4.61±3.37②③
78.8
6.24±2.22②③
71.6
6.41±3.41②
, 百拇医药
73.5
①为4次复孔的均值； ②剂量相邻两组比较P<0.05， ③时间相邻两组比较P<0.05,余为P>0.05表2 HN2作用于癌细胞结果的方差分析 变异来源
ss
ν
MS
F
P
时间变异
31.29
2
15.65
, 百拇医药
7.08
<0.05
剂量变异
467.98
4
116.99
52.94
<0.01
误差
17.66
8
2.21
总变异
, http://www.100md.com
516.93
14
2.2 HN2作用后对残余细胞增殖的影响
生理盐水作用5、15、30 min后，再继续进行细胞培养，细胞受到轻度抑制，但仍能继续增殖。而HN2组，无论高浓度或低浓度，细胞均不能再生长。各实验组的癌细胞死亡时间分别为：100 mg/L→2 d,4 d,6 d;50 mg/L→4 d,6 d,6 d;25m/L→5 d,7 d,8 d;12.5mg/L→6 d,8 d,8 d(从左向右分别为30 min，15 min，5 min作用时间)。
3 讨 论
恶性肿瘤手术后复发是当今癌瘤外科最棘手的问题，术后复发的原因中相当一部分为种植复发。因此，术中用一些抗癌药物冲洗创面已被视为恶性肿瘤手术规范。Madonld等〔2〕，首先对Walkel 256瘤小鼠用HN2 10～20 mg/L作创面冲洗，抑制率为98%以上。并且认为，用9 g/L生理盐水冲洗，不能有效打击脱落的癌细胞。HN2对口腔癌的作用如何，尚无有关的实验依据。基于此，作者以Tca8113细胞作为体外模型，更准确地为临床提供一些有关依据。
, http://www.100md.com
本实验结果显示HN2的即时杀伤癌细胞效果表现为时间及浓度的依赖性。而且残余的活细胞均不能再增殖生长。可能的解释是，HN2是一种烷化剂类抗癌药物，分子结构上有活跃的烷化基团，能够有效地、不可逆转地抑制细胞DNA的合成〔3〕。
多数抗癌药物(如氮芥)均能抑制手术后创口的愈合，而且与其浓度及时间有关。从临床实用出发，选择最低有效浓度及时间，可最大限度地减少抗癌药物的副作用。本实验观察到，HN2最低有效浓度及时间为：25 mg/L，5 min；50 mg/L，15 min；12.5 mg/L，30 min。
参考文献
1 大星章一，营野晴夫主编.人癌细胞培养.北京：科学技术出版社，1979.66
2 Mcdonald Go,Gines SM,Cole M,et al.Wound irrigation in cancer surgery.Am Med Assoc Arch Surg,1960,80:60
3 王炎,韩锐.主编.肿瘤药物治疗.北京：人民卫生出版社，1987.53
(收稿：1998-07-10 修回：1998-12-15), 百拇医药