牛腱胶原混合软骨细胞再造软骨的实验研究
作者：陈富林 杨维东 毛天球 陶凯 顾晓明 李媛 赵家林
单位：西安第四军医大学口腔医学院 (陈富林 杨维东 毛天球 陶凯 李媛 710032)；陕西宝鸡宝泰医用生物制品公司 (赵家林)
关键词：软骨；胶原；组织工程
实用口腔医学杂志990520 〔摘要〕 目的：用组织工程方法再造软骨。方法：分离、培养、扩传兔软骨细胞，接种于牛跟腱Ⅰ型胶原中形成软骨细胞/胶原凝胶复合物，倒置显微镜下观察细胞在凝胶中的生长情况。将复合物植入动物体内1、2月，观察软骨的再造情况。结果：软骨细胞在胶原凝胶中生长良好，植入体内1个月，形成软骨样组织，2个月时再造出成熟的软骨。结论：采用体外培养软骨细胞，接种于胶原凝胶中，是再造软骨组织的有效方法。
Experimental research on the neocartilage reproduction
, http://www.100md.com
employing the method of tissue engineering
Chen Fulin, Yang Weidong, Mao Tianqiu,et al.Stomatological College，Fourth Military Medical University，Xi'an 710032
〔Abstract〕Objective: To reproduce cartilage with tissue engineering technique. Method: Rabbit ear chondrocytes were isolated and cultured in vitro and seeded into bovine type Ⅰ collagen to form chondrocyte/collagen gel composition. Chondrocytes growth in the gel and reproduction of cartilage by the composition were observed with in vitro and in vivo experiments. Results: Chondrocytes grew well in collagen gel in vitro. One month after implantation of the composition, cartilage was observed in the specimen, mature cartilage was observed in two months. Conclusion: Type I collagen/chondrocyte composition implantation is effective for tissue engineering of cartilage.
, 百拇医药
Key words Cartilage;Collagen;Tissue engineering
软骨组织的自身修复能力很低，而且供区非常有限，因而各种原因所致的软骨缺损和畸形的治疗一直是一个临床难题。组织工程学是近年来发展起来的一门新学科, 是材料学、工程学和生命科学共同发展并相互融合的产物, 其最基本的思路是在体外分离、培养细胞, 将一定量的细胞接种到生物支架中, 通过细胞之间的相互粘附、生长繁殖、分泌细胞外基质, 从而形成具有一定结构和功能的组织或器官〔1〕。本研究将培养的软骨细胞接种于胶原凝胶中，对细胞在凝胶中的生长和软骨的形成情况进行了观察。
1 材料与方法
1.1 材料
新西兰兔(第四军医大学实验动物中心),牛跟腱Ⅰ型胶原(陕西宝泰医用生物制品公司)。Ⅱ型胶原酶(Sigma), DMEM培养液(Gibco), 胎牛血清(浙江清湖犊牛利用研究所)。胰蛋白酶(Sigma)。
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1.2 方法
1.2.1 兔耳软骨细胞的分离、培养 软骨细胞分离方法见参考文献〔2，3〕。将分离的软骨细胞用DMEM培养液(含体积分数为10%胎牛血清，青霉素，维生素C，谷氨酰胺)稀释至1×103/ ml，接种于75 ml细胞培养瓶内，每3 d换液一次，细胞长满后用2.5 g/L胰酶消化后，传代扩增〔2，3〕。
1.2.2 软骨细胞接种 取第二代软骨细胞，2.5 g/L胰酶消化后，1000 r/min离心3 min收集细胞，漂洗后计数，接种于4 ℃牛跟腱Ⅰ型胶原溶液中，使细胞终浓度为40×106/ ml，迅速用1 mol/L的NaOH将溶液的pH值调整为7.2左右，然后加入DMEM培养液使之成为胶原凝胶，倒置显微镜下观察细胞在胶原凝胶中的生长情况。培养5 d后，取一个复合物固定于福尔马林中，切片后HE染色观察细胞在胶原凝胶中的生长。
, 百拇医药
1.2.3 软骨细胞/胶原凝胶复合物的植入 软骨细胞/胶原凝胶复合物在体外培养5 d后，无菌条件下植入供体兔背部皮下组织中，分别于植入后1、2月取材，进行大体标本观察；福尔马林固定，切片后染色观察软骨的形成情况，并与正常兔耳软骨对照。
2 结 果
2.1 兔耳软骨细胞的分离、培养 消化后16 h，消化液内有大量小圆形细胞，接种于培养瓶内后24 h，细胞贴壁、伸展，为多边形和三角形，原代细胞7～10 d长满整个培养瓶。
2.2 软骨细胞在胶原凝胶中的生长 新形成的胶原凝胶为半透明状，软骨细胞呈球状分布于其中，24 h后细胞伸展成为梭形，并开始增殖，以后胶原凝胶不断收缩，其透明度也不断下降。切片后HE染色观察，软骨细胞在胶原凝胶中生长情况良好，并充分伸展。
2.3 软骨形成情况的观察 大体标本观察:软骨细胞/胶原凝胶复合物植入供体兔背部皮下组织中1月后，形成约0.5 cm×0.5 cm×1.0 cm大小的结节，表面为纤维组织包裹，质地稍硬，无明显弹性；植入2月后形成的组织质地坚韧，富于弹性，切面为亮白色。组织学观察:1月标本内有大量合成功能旺盛的细胞，细胞外基质较少，其中可见散在的软骨岛，为软骨样组织，其中的胶原已被机体吸收(图1)；2月标本富于细胞外基质，HE染色被染成淡蓝色，其中可见大量软骨细胞位于陷窝中，细胞外基质番红 O染色强阳性，表明基质中富含糖胺多糖(图2)。
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图1 植入1月时形成软骨样组织(HE，×40)
图2 植入2月时形成软骨组织，番红 O染色
强阳性(番红 O染色，×10)
3 讨 论
组织工程技术将生命科学和工程学原理相结合, 应用于恢复、保持、改善组织的功能, 为解决目前费用昂贵的器官、组织移植和再造问题提供了新的方法, 被认为是20世纪的十大技术之一。用该方法再造组织具有3个突出优点：(1)细胞可在体外培养及增殖，只需要极少量的自体组织，就可获得足够的细胞数量用于移植；(2)可以根据缺损的形状、大小、病变程度来设计三维支架的立体形状及吸收速度；(3)再造出的为生物性组织或器官〔1〕。Freed等〔4〕将软骨细胞接种于多孔聚乙醇酸支架上，修复兔膝关节软骨缺损，6个月时缺损完全修复。曹谊林首次再造出自然形态人外耳，使该技术进入了一个崭新的阶段〔5〕。
, 百拇医药
目前在组织工程研究中得到广泛应用的材料主要是人工合成的高分子聚合物如聚乳酸(PLA)、聚乙醇酸(PGA)等,并已取得一定的结果。但此类高分子材料植入机体时可引发迟发性炎症反应，不利于细胞的生长和组织的形成，且在使用前需要进行复杂的表面处理，因此目前许多实验主要在裸鼠体内进行。
胶原蛋白广泛存在于动物的皮肤、骨骼、肌腱中，是一种由动物细胞合成的天然高分子，具有很高的同源性，目前牛Ⅰ型胶原在临床上应用广泛，具有良好的生物相容性和可吸收性。根据本实验的观察，软骨细胞可在胶原凝胶中充分伸展，生长良好，植入体内后一个月形成了软骨样组织，植入体内后二个月时成功地再造出了软骨组织，细胞外基质番红 O染色强阳性。表明通过软骨细胞培养，接种于胶原凝胶中后植入体内，是再造软骨的有效方法。
各种原因所致的软骨缺损和畸形一直是临床治疗的难题，主要原因是软骨的再生能力差和供区有限。用组织工程方法可以成功地再造出软骨，为这一临床难题的解决提供了一种新方法。本研究中使用的为第二代软骨细胞，所以再造出的软骨，其大小还不能满足临床治疗的需要，这主要是因为软骨细胞在体外长期培养时存在反分化倾向，无法获得足够的细胞数用于移植。研究表明软骨细胞传至4～5代后则开始反分化为成纤维细胞，丧失软骨细胞的表型〔2〕，因此，如何在体外调控软骨细胞的生长，应是今后研究的重点问题。
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本项目由国家自然科学基金(编号 39779762)和军队医药卫生科研基金(编号98M104)资助
参考文献
1张涤生综述.组织工程学简介. 中华整形烧伤外科杂志，1998,14(3):218
2 陈富林，毛天球，冯雪,等.兔关节软骨细胞的分离、纯化和鉴定.现代口腔医学杂志,1998,12(4)：263
3 杨维东,陈富林,陶凯,等.兔动物模型在组织工程骨、软骨研究中的应用.实用口腔医学杂志,1999,(5):374
4 Freed LE, Grande DA, Linbing Z, et al. Joint resurfacing using allograft chondrocytes and synthetic biodegradable polymer scaffolds. J Biomed Mater Res,1994,28:891
5 Yilin Cao, Vacantc J P,Moony G,et al. Chondrocytes seeded onto polymer template of ear for ear reconstruction. Plast Reconstr Surg, 1997,47(2):297
(收稿：1999-07-26), http://www.100md.com
单位：西安第四军医大学口腔医学院 (陈富林 杨维东 毛天球 陶凯 李媛 710032)；陕西宝鸡宝泰医用生物制品公司 (赵家林)
关键词：软骨；胶原；组织工程
实用口腔医学杂志990520 〔摘要〕 目的：用组织工程方法再造软骨。方法：分离、培养、扩传兔软骨细胞，接种于牛跟腱Ⅰ型胶原中形成软骨细胞/胶原凝胶复合物，倒置显微镜下观察细胞在凝胶中的生长情况。将复合物植入动物体内1、2月，观察软骨的再造情况。结果：软骨细胞在胶原凝胶中生长良好，植入体内1个月，形成软骨样组织，2个月时再造出成熟的软骨。结论：采用体外培养软骨细胞，接种于胶原凝胶中，是再造软骨组织的有效方法。
Experimental research on the neocartilage reproduction
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employing the method of tissue engineering
Chen Fulin, Yang Weidong, Mao Tianqiu,et al.Stomatological College，Fourth Military Medical University，Xi'an 710032
〔Abstract〕Objective: To reproduce cartilage with tissue engineering technique. Method: Rabbit ear chondrocytes were isolated and cultured in vitro and seeded into bovine type Ⅰ collagen to form chondrocyte/collagen gel composition. Chondrocytes growth in the gel and reproduction of cartilage by the composition were observed with in vitro and in vivo experiments. Results: Chondrocytes grew well in collagen gel in vitro. One month after implantation of the composition, cartilage was observed in the specimen, mature cartilage was observed in two months. Conclusion: Type I collagen/chondrocyte composition implantation is effective for tissue engineering of cartilage.
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Key words Cartilage;Collagen;Tissue engineering
软骨组织的自身修复能力很低，而且供区非常有限，因而各种原因所致的软骨缺损和畸形的治疗一直是一个临床难题。组织工程学是近年来发展起来的一门新学科, 是材料学、工程学和生命科学共同发展并相互融合的产物, 其最基本的思路是在体外分离、培养细胞, 将一定量的细胞接种到生物支架中, 通过细胞之间的相互粘附、生长繁殖、分泌细胞外基质, 从而形成具有一定结构和功能的组织或器官〔1〕。本研究将培养的软骨细胞接种于胶原凝胶中，对细胞在凝胶中的生长和软骨的形成情况进行了观察。
1 材料与方法
1.1 材料
新西兰兔(第四军医大学实验动物中心),牛跟腱Ⅰ型胶原(陕西宝泰医用生物制品公司)。Ⅱ型胶原酶(Sigma), DMEM培养液(Gibco), 胎牛血清(浙江清湖犊牛利用研究所)。胰蛋白酶(Sigma)。
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1.2 方法
1.2.1 兔耳软骨细胞的分离、培养 软骨细胞分离方法见参考文献〔2，3〕。将分离的软骨细胞用DMEM培养液(含体积分数为10%胎牛血清，青霉素，维生素C，谷氨酰胺)稀释至1×103/ ml，接种于75 ml细胞培养瓶内，每3 d换液一次，细胞长满后用2.5 g/L胰酶消化后，传代扩增〔2，3〕。
1.2.2 软骨细胞接种 取第二代软骨细胞，2.5 g/L胰酶消化后，1000 r/min离心3 min收集细胞，漂洗后计数，接种于4 ℃牛跟腱Ⅰ型胶原溶液中，使细胞终浓度为40×106/ ml，迅速用1 mol/L的NaOH将溶液的pH值调整为7.2左右，然后加入DMEM培养液使之成为胶原凝胶，倒置显微镜下观察细胞在胶原凝胶中的生长情况。培养5 d后，取一个复合物固定于福尔马林中，切片后HE染色观察细胞在胶原凝胶中的生长。
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1.2.3 软骨细胞/胶原凝胶复合物的植入 软骨细胞/胶原凝胶复合物在体外培养5 d后，无菌条件下植入供体兔背部皮下组织中，分别于植入后1、2月取材，进行大体标本观察；福尔马林固定，切片后染色观察软骨的形成情况，并与正常兔耳软骨对照。
2 结 果
2.1 兔耳软骨细胞的分离、培养 消化后16 h，消化液内有大量小圆形细胞，接种于培养瓶内后24 h，细胞贴壁、伸展，为多边形和三角形，原代细胞7～10 d长满整个培养瓶。
2.2 软骨细胞在胶原凝胶中的生长 新形成的胶原凝胶为半透明状，软骨细胞呈球状分布于其中，24 h后细胞伸展成为梭形，并开始增殖，以后胶原凝胶不断收缩，其透明度也不断下降。切片后HE染色观察，软骨细胞在胶原凝胶中生长情况良好，并充分伸展。
2.3 软骨形成情况的观察 大体标本观察:软骨细胞/胶原凝胶复合物植入供体兔背部皮下组织中1月后，形成约0.5 cm×0.5 cm×1.0 cm大小的结节，表面为纤维组织包裹，质地稍硬，无明显弹性；植入2月后形成的组织质地坚韧，富于弹性，切面为亮白色。组织学观察:1月标本内有大量合成功能旺盛的细胞，细胞外基质较少，其中可见散在的软骨岛，为软骨样组织，其中的胶原已被机体吸收(图1)；2月标本富于细胞外基质，HE染色被染成淡蓝色，其中可见大量软骨细胞位于陷窝中，细胞外基质番红 O染色强阳性，表明基质中富含糖胺多糖(图2)。
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图1 植入1月时形成软骨样组织(HE，×40)
图2 植入2月时形成软骨组织，番红 O染色
强阳性(番红 O染色，×10)
3 讨 论
组织工程技术将生命科学和工程学原理相结合, 应用于恢复、保持、改善组织的功能, 为解决目前费用昂贵的器官、组织移植和再造问题提供了新的方法, 被认为是20世纪的十大技术之一。用该方法再造组织具有3个突出优点：(1)细胞可在体外培养及增殖，只需要极少量的自体组织，就可获得足够的细胞数量用于移植；(2)可以根据缺损的形状、大小、病变程度来设计三维支架的立体形状及吸收速度；(3)再造出的为生物性组织或器官〔1〕。Freed等〔4〕将软骨细胞接种于多孔聚乙醇酸支架上，修复兔膝关节软骨缺损，6个月时缺损完全修复。曹谊林首次再造出自然形态人外耳，使该技术进入了一个崭新的阶段〔5〕。
, 百拇医药
目前在组织工程研究中得到广泛应用的材料主要是人工合成的高分子聚合物如聚乳酸(PLA)、聚乙醇酸(PGA)等,并已取得一定的结果。但此类高分子材料植入机体时可引发迟发性炎症反应，不利于细胞的生长和组织的形成，且在使用前需要进行复杂的表面处理，因此目前许多实验主要在裸鼠体内进行。
胶原蛋白广泛存在于动物的皮肤、骨骼、肌腱中，是一种由动物细胞合成的天然高分子，具有很高的同源性，目前牛Ⅰ型胶原在临床上应用广泛，具有良好的生物相容性和可吸收性。根据本实验的观察，软骨细胞可在胶原凝胶中充分伸展，生长良好，植入体内后一个月形成了软骨样组织，植入体内后二个月时成功地再造出了软骨组织，细胞外基质番红 O染色强阳性。表明通过软骨细胞培养，接种于胶原凝胶中后植入体内，是再造软骨的有效方法。
各种原因所致的软骨缺损和畸形一直是临床治疗的难题，主要原因是软骨的再生能力差和供区有限。用组织工程方法可以成功地再造出软骨，为这一临床难题的解决提供了一种新方法。本研究中使用的为第二代软骨细胞，所以再造出的软骨，其大小还不能满足临床治疗的需要，这主要是因为软骨细胞在体外长期培养时存在反分化倾向，无法获得足够的细胞数用于移植。研究表明软骨细胞传至4～5代后则开始反分化为成纤维细胞，丧失软骨细胞的表型〔2〕，因此，如何在体外调控软骨细胞的生长，应是今后研究的重点问题。
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本项目由国家自然科学基金(编号 39779762)和军队医药卫生科研基金(编号98M104)资助
参考文献
1张涤生综述.组织工程学简介. 中华整形烧伤外科杂志，1998,14(3):218
2 陈富林，毛天球，冯雪,等.兔关节软骨细胞的分离、纯化和鉴定.现代口腔医学杂志,1998,12(4)：263
3 杨维东,陈富林,陶凯,等.兔动物模型在组织工程骨、软骨研究中的应用.实用口腔医学杂志,1999,(5):374
4 Freed LE, Grande DA, Linbing Z, et al. Joint resurfacing using allograft chondrocytes and synthetic biodegradable polymer scaffolds. J Biomed Mater Res,1994,28:891
5 Yilin Cao, Vacantc J P,Moony G,et al. Chondrocytes seeded onto polymer template of ear for ear reconstruction. Plast Reconstr Surg, 1997,47(2):297
(收稿：1999-07-26), http://www.100md.com