兔动物模型在组织工程骨、软骨研究中的应用
作者：杨维东 陈富林 陶凯 毛天球 陈书军 顾晓明
单位：第四军医大学口腔医学院口腔颌面外科 710032
关键词：动物模型；组织工程；骨；软骨
实用口腔医学杂志990518 〔摘要〕 目的：观察运用新西兰家兔进行组织工程骨和软骨研究的可行性。方法：分离髂骨中的骨髓基质细胞，培养扩增8 d，用地塞米松诱导分化为成骨细胞，细胞计数，并检查碱性磷酸酶活性。软骨细胞取自新西兰兔双侧耳软骨，用II型胶原酶消化，细胞计数。将成骨细胞和软骨细胞按组织工程方法建造骨组织和软骨组织。结果：10只动物中平均每只动物可获取9×106成骨细胞和60×106软骨细胞。成骨细胞碱性磷酸酶表达阳性。应用经诱导的成骨细胞和分离的软骨细胞，在动物体内成功地建造了骨组织和软骨组织。结论：新西兰兔可以作为组织工程骨和软骨研究的动物模型。
, http://www.100md.com
The feasibility of rabbit model for the study of tissue
engineering of bone and cartilage
Yang Weidong,Chen Fulin,Tao Kai,et al.Department of Oral Maxillofacial Surgery, Stomatological College, Fourth Military University, Xi'an 710032
〔Abstract〕Objective: To establish an animal model for the study of tissue engineering of bone and cartilage. Methods: Marrow stromal cells were harvested from 10 New Zealand rabbit's iliac bone. After cultured and multiplied for 8 days, dexamethasone was used to promote the osteoblastic phenotype of the cells for 3 days.The osseous phenotyp of the cells was identified by the test of alkaline phosphatase (ALP) activity. Ears of the rabbits were chosen as the sources of chondrocytes.By means of tissue engineering techniques, autogenetic osteoblastic cells/scaffold and autogenetic chondrocytes/carrier compositions were formed, and then were implanted into the dorsal subcutaneous tissue of corresponding rabbits. Results: On an average 9×106 osteoblasts and 60×106 chondrocytes can be harvested from each rabbit. The osteoblasts differentiated from marrow stromal cells expressed ALP activity. The two kinds of cells can fabricate tissue engineered bone and cartilage respectively. Conclusion: New Zealand rabbit can be used for the study of tissue engineering of bone and cartilage.
, 百拇医药
Key words Tissue engineering;Animal model;Bone;Cartilage
动物模型的价值体现在对人体生理和病理状况模拟的相似性和对临床医学指导和应用方法可重复的真实性〔1，2〕。组织工程作为近十年来新兴及快速发展研究领域，组织工程的动物模型同样经历着不断发展、不断完善的过程〔3，4〕。我们在组织工程骨和软骨的研究中，选用新西兰兔作为动物模型，获得动物的骨髓基质细胞和软骨细胞，应用组织工程方法建造骨组织和软骨组织，观察该动物模型在组织工程骨和软骨研究中的可行性，为兔动物模型在组织工程骨和软骨研究中的应用提供依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 骨髓基质细胞培养液 DMEM (Gibco)，内含β-甘油磷酸钠(Sigma)、L-抗坏血酸 (Sigma)和体积分数为10%胎牛血清。
, 百拇医药
1.1.2 地塞米松(Sigma)，II型胶原酶(Sigma)。
1.1.3 支架及载体材料 松质骨基质〔5〕(本实验室制备)，藻酸盐(Protan, Portsmouth, NH)。成年新西兰兔10只(第四军医大学实验动物研究中心提供)。
1.2 方法
1.2.1骨髓基质细胞的分离与培养 无菌条件下显露新西兰兔双侧髂骨，用牙科电钻切取髂骨。 去净髂骨周围的软组织及髂骨上缘的软骨组织。在含有抗生素的无血清DMEM培养液 中，将髂骨用剪刀剪成碎块，然后用吸管反复吹打，使髂骨中的骨髓基质细胞充分溢出， 筛网过滤，收集骨髓基质细胞。将骨髓基质细胞转移至8个细胞培养皿(20 mm×100 mm)中, 加入骨髓基质细胞培养液，置CO2孵育箱中，每2 d换液1次。
1.2.2 骨髓基质细胞的诱导 骨髓基质细胞培养至第8 d时加入10 nmol/L的地塞米松，诱导3 d, 使骨髓基质细胞转化为成骨细胞。然后用2.5 g/L胰蛋白酶消化25 min , 收集所有培养皿的细胞，用无血清DMEM漂洗3遍，进行细胞计数。
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1.2.3 软骨取材及软骨细胞的分离培养 无菌条件下取双侧新西兰兔耳，剥离兔耳表面皮肤，去净耳软骨周围软组织，经含抗生素生理盐水反复清洗后，剪成碎块。用2 g/L Ⅱ型胶原酶消化18 h后，离心、去上清液，然后用无血清DMEM漂洗3遍，细胞计数。
1.2.4 碱性磷酸酶活性检测 取5×104/ml骨髓基质细胞接种于 96 孔细胞培养板中，实验组加含地塞米松的培养液，对照组仅加入DMEM培养液。72 h后离心去上清液，加入体积分数为0.01% Triton Ⅹ-100，然后加入碱性磷酸酶反应液，用酶联免疫检测仪(410 nm)测碱性磷酸酶活性，统计学分析。
1.2.5 自体成骨细胞/支架和自体软骨细胞/载体复合物的形成 取4×106/ml由地塞米松诱导的成骨细胞与10 g/L的藻酸盐混合，注射和接种于异体松质骨基质的多孔网状支架中。取4×107/ml软骨细胞与12 g/L的藻酸盐混合。将自体成骨细胞/支架和自体软骨细胞/载体复合物植入或注射于新西兰兔皮下。移植后8周取材，进行组织学检查。
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2 结 果
2.1 细胞的获取量 骨髓基质细胞体外培养9～12 d可以长满整个培养皿，故选择第8 d加入地塞米松诱导，3 d后可使骨髓基质细胞分化为成骨细胞。细胞计数显示，按本实验方法每只成年新西兰兔平均获取的细胞量为9×106/ml。本实验取双侧兔耳，消化分离软骨细胞，平均每只成年新西兰兔可获取软骨细胞60×106/ml。由于未做软骨细胞的体外培养，扩增，故软骨细胞的最大获取量未知。
2.2 碱性磷酸酶活性检测 实验组的碱性磷酸酶的活性明显高于对照组(具体情况将另文发表)，统计学分析具有显著性差异(P<0.01)。
2.3 组织学检查 成骨细胞/支架复合物移植后8周显示，骨样组织充满松质骨基质的腔隙中，表面有成熟的骨组织沉积。软骨细胞/载体复合物注射后8周，显示有大量成熟软骨组织形成。
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3 讨 论
3.1 组织工程研究中动物模型的选择
在组织工程创立之初，最多采用的是裸鼠模型。裸鼠模型的特点是可以忽略细胞的来源及支架或载体材料与宿主之间的反应，直接研究动物体内建造组织工程组织的可行性〔4〕。由于裸鼠作为免疫缺陷动物，不能反映具有正常免疫功能的动物和人类体内的真实状况，从裸鼠模型所获取的资料需要其它动物模型的检证。因此，裸鼠模型仅限于组织工程研究的初级阶段〔3，4〕。
在组织工程骨和软骨研究中，除裸鼠模型外，其它动物模型选择的重点主要考虑是否能获取足量的成骨细胞和软骨细胞，同时也应考虑动物遗传背景的一致性和实验结果的可重复性。国外学者采用近交系大鼠进行组织工程骨和软骨的研究，用同基因细胞替代自体细胞以解决成骨细胞和软骨细胞的来源问题。然而，尽管如此细胞来源也十分有限, 若进行多动物取材和细胞培养扩增，其工作量较大。目前国内外采用猪、羊等大动物用于组织工程的研究，较好地解决了细胞来源的问题。应用这些大动物可以模拟人体进行骨髓穿刺，获取足量的骨髓基质细胞，同时取猪、羊的耳软骨还可获取大量的软骨细胞。由于猪、羊属于杂种动物，根据实验动物学原理，杂种动物实验结果的可重复性往往较差〔1,2〕，同时动物价格和饲养管理也相对复杂。
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新西兰兔属于远交系动物，其实验动物学质量高于一般杂种动物〔1,2〕。由于采用本实验方法可使新西兰兔提供足够的骨髓基质细胞和软骨细胞，同时实验中发现新西兰兔可以同时耐受髂骨和耳软骨的取材手术，无一例动物因取材手术而导致死亡，故认为新西兰兔可以用于组织工程骨及软骨的研究。虽然亦有学者取新西兰兔骨膜和顶骨作为组织工程骨的细胞来源〔6〕，但所需的成骨细胞培养周期长，程序较复杂，同时从未来临床的可适用性上，选用骨髓基质细胞更有意义。由于兔动物模型可同时获取大量的成骨细胞和软骨细胞，为采用该动物模型进行组织工程骨/软骨复合组织，乃至骨关节的组织工程建造研究提供了可能。
3.2 骨髓基质细胞和成骨细胞
骨髓基质细胞具有多向分化的特性〔7〕，本实验采用地塞米松诱导分化的骨髓基质细胞表现为明显的碱性磷酸酶活性，说明经诱导的骨髓基质细胞具有成骨细胞的表型，同时在体内成功地建造了骨组织，进一步说明采用兔动物模型在骨髓基质细胞的选择、应用和组织工程骨研究方面的可行性。目前证明骨髓基质细胞还可以诱导分化为软骨细胞、肌细胞和上皮细胞等〔7,8〕，如果将这些研究成果移植于组织工程学研究，也将赋予新西兰兔动物模型更丰富的研究内容和价值。
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4 结 论
新西兰兔可以提供足量的成骨细胞和软骨细胞，并具有遗传背景的一致性，适用于组织工程骨和软骨的研究。 新西兰兔可以提供足量的成骨细胞和软骨细胞，并具有遗传背景的一致性，适用于组织工程骨和软骨的研究。
本项目由国家自然科学基金(编号39779762)和军队医药卫生科研基金(编号98M104)资助
参考文献
1施新猷. 医学实验动物科学.西安: 陕西科学技术出版社, 1989.5
2 杨维东，彭品祥，马振国. 异体骨移植免疫原性研究中近交系小鼠动物模型的建立. 实用口腔医学杂志，1996,12(3)：177
3 Vacanti CA, Vacanti JP. Bone and cartilage reconstruction with tissue engineering approaches. Otolaryngol Clin North Am, 1994,27(1):263
, http://www.100md.com
4 Paige KT, Cima LG, Yaremchuk MJ, et al. Injectable cartilage. Plast Reconstr Surg, 1995,96(6)：1390
5 王燕，朱秀萍，吴洁. 异体骨基质凝胶的免疫原性研究. 实用口腔医学杂志，1997,13(4):258
6 Breitbart AS，Grande DA，Kessler R, et al. Tissue engineered bone repair of calvarial defects using cultured periosteal cells. Plast Reconstr Surg, 1998，101(3):567
7 Kubota H，Reid LM. Stem cell-fed maturational lineages and epithelial organogenesis. Hum Cell,1997,10(1): 51
8 Martin I，Padera RF，Vunjak Novakovic G, et al. In vitro differentiation of chick embryo bone marrow stromal cells into cartilaginous and bone-like tissues. J Orthop Res, 1998,16(2):181
(收稿：1999-07-26), 百拇医药
单位：第四军医大学口腔医学院口腔颌面外科 710032
关键词：动物模型；组织工程；骨；软骨
实用口腔医学杂志990518 〔摘要〕 目的：观察运用新西兰家兔进行组织工程骨和软骨研究的可行性。方法：分离髂骨中的骨髓基质细胞，培养扩增8 d，用地塞米松诱导分化为成骨细胞，细胞计数，并检查碱性磷酸酶活性。软骨细胞取自新西兰兔双侧耳软骨，用II型胶原酶消化，细胞计数。将成骨细胞和软骨细胞按组织工程方法建造骨组织和软骨组织。结果：10只动物中平均每只动物可获取9×106成骨细胞和60×106软骨细胞。成骨细胞碱性磷酸酶表达阳性。应用经诱导的成骨细胞和分离的软骨细胞，在动物体内成功地建造了骨组织和软骨组织。结论：新西兰兔可以作为组织工程骨和软骨研究的动物模型。
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The feasibility of rabbit model for the study of tissue
engineering of bone and cartilage
Yang Weidong,Chen Fulin,Tao Kai,et al.Department of Oral Maxillofacial Surgery, Stomatological College, Fourth Military University, Xi'an 710032
〔Abstract〕Objective: To establish an animal model for the study of tissue engineering of bone and cartilage. Methods: Marrow stromal cells were harvested from 10 New Zealand rabbit's iliac bone. After cultured and multiplied for 8 days, dexamethasone was used to promote the osteoblastic phenotype of the cells for 3 days.The osseous phenotyp of the cells was identified by the test of alkaline phosphatase (ALP) activity. Ears of the rabbits were chosen as the sources of chondrocytes.By means of tissue engineering techniques, autogenetic osteoblastic cells/scaffold and autogenetic chondrocytes/carrier compositions were formed, and then were implanted into the dorsal subcutaneous tissue of corresponding rabbits. Results: On an average 9×106 osteoblasts and 60×106 chondrocytes can be harvested from each rabbit. The osteoblasts differentiated from marrow stromal cells expressed ALP activity. The two kinds of cells can fabricate tissue engineered bone and cartilage respectively. Conclusion: New Zealand rabbit can be used for the study of tissue engineering of bone and cartilage.
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Key words Tissue engineering;Animal model;Bone;Cartilage
动物模型的价值体现在对人体生理和病理状况模拟的相似性和对临床医学指导和应用方法可重复的真实性〔1，2〕。组织工程作为近十年来新兴及快速发展研究领域，组织工程的动物模型同样经历着不断发展、不断完善的过程〔3，4〕。我们在组织工程骨和软骨的研究中，选用新西兰兔作为动物模型，获得动物的骨髓基质细胞和软骨细胞，应用组织工程方法建造骨组织和软骨组织，观察该动物模型在组织工程骨和软骨研究中的可行性，为兔动物模型在组织工程骨和软骨研究中的应用提供依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 骨髓基质细胞培养液 DMEM (Gibco)，内含β-甘油磷酸钠(Sigma)、L-抗坏血酸 (Sigma)和体积分数为10%胎牛血清。
, 百拇医药
1.1.2 地塞米松(Sigma)，II型胶原酶(Sigma)。
1.1.3 支架及载体材料 松质骨基质〔5〕(本实验室制备)，藻酸盐(Protan, Portsmouth, NH)。成年新西兰兔10只(第四军医大学实验动物研究中心提供)。
1.2 方法
1.2.1骨髓基质细胞的分离与培养 无菌条件下显露新西兰兔双侧髂骨，用牙科电钻切取髂骨。 去净髂骨周围的软组织及髂骨上缘的软骨组织。在含有抗生素的无血清DMEM培养液 中，将髂骨用剪刀剪成碎块，然后用吸管反复吹打，使髂骨中的骨髓基质细胞充分溢出， 筛网过滤，收集骨髓基质细胞。将骨髓基质细胞转移至8个细胞培养皿(20 mm×100 mm)中, 加入骨髓基质细胞培养液，置CO2孵育箱中，每2 d换液1次。
1.2.2 骨髓基质细胞的诱导 骨髓基质细胞培养至第8 d时加入10 nmol/L的地塞米松，诱导3 d, 使骨髓基质细胞转化为成骨细胞。然后用2.5 g/L胰蛋白酶消化25 min , 收集所有培养皿的细胞，用无血清DMEM漂洗3遍，进行细胞计数。
, 百拇医药
1.2.3 软骨取材及软骨细胞的分离培养 无菌条件下取双侧新西兰兔耳，剥离兔耳表面皮肤，去净耳软骨周围软组织，经含抗生素生理盐水反复清洗后，剪成碎块。用2 g/L Ⅱ型胶原酶消化18 h后，离心、去上清液，然后用无血清DMEM漂洗3遍，细胞计数。
1.2.4 碱性磷酸酶活性检测 取5×104/ml骨髓基质细胞接种于 96 孔细胞培养板中，实验组加含地塞米松的培养液，对照组仅加入DMEM培养液。72 h后离心去上清液，加入体积分数为0.01% Triton Ⅹ-100，然后加入碱性磷酸酶反应液，用酶联免疫检测仪(410 nm)测碱性磷酸酶活性，统计学分析。
1.2.5 自体成骨细胞/支架和自体软骨细胞/载体复合物的形成 取4×106/ml由地塞米松诱导的成骨细胞与10 g/L的藻酸盐混合，注射和接种于异体松质骨基质的多孔网状支架中。取4×107/ml软骨细胞与12 g/L的藻酸盐混合。将自体成骨细胞/支架和自体软骨细胞/载体复合物植入或注射于新西兰兔皮下。移植后8周取材，进行组织学检查。
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2 结 果
2.1 细胞的获取量 骨髓基质细胞体外培养9～12 d可以长满整个培养皿，故选择第8 d加入地塞米松诱导，3 d后可使骨髓基质细胞分化为成骨细胞。细胞计数显示，按本实验方法每只成年新西兰兔平均获取的细胞量为9×106/ml。本实验取双侧兔耳，消化分离软骨细胞，平均每只成年新西兰兔可获取软骨细胞60×106/ml。由于未做软骨细胞的体外培养，扩增，故软骨细胞的最大获取量未知。
2.2 碱性磷酸酶活性检测 实验组的碱性磷酸酶的活性明显高于对照组(具体情况将另文发表)，统计学分析具有显著性差异(P<0.01)。
2.3 组织学检查 成骨细胞/支架复合物移植后8周显示，骨样组织充满松质骨基质的腔隙中，表面有成熟的骨组织沉积。软骨细胞/载体复合物注射后8周，显示有大量成熟软骨组织形成。
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3 讨 论
3.1 组织工程研究中动物模型的选择
在组织工程创立之初，最多采用的是裸鼠模型。裸鼠模型的特点是可以忽略细胞的来源及支架或载体材料与宿主之间的反应，直接研究动物体内建造组织工程组织的可行性〔4〕。由于裸鼠作为免疫缺陷动物，不能反映具有正常免疫功能的动物和人类体内的真实状况，从裸鼠模型所获取的资料需要其它动物模型的检证。因此，裸鼠模型仅限于组织工程研究的初级阶段〔3，4〕。
在组织工程骨和软骨研究中，除裸鼠模型外，其它动物模型选择的重点主要考虑是否能获取足量的成骨细胞和软骨细胞，同时也应考虑动物遗传背景的一致性和实验结果的可重复性。国外学者采用近交系大鼠进行组织工程骨和软骨的研究，用同基因细胞替代自体细胞以解决成骨细胞和软骨细胞的来源问题。然而，尽管如此细胞来源也十分有限, 若进行多动物取材和细胞培养扩增，其工作量较大。目前国内外采用猪、羊等大动物用于组织工程的研究，较好地解决了细胞来源的问题。应用这些大动物可以模拟人体进行骨髓穿刺，获取足量的骨髓基质细胞，同时取猪、羊的耳软骨还可获取大量的软骨细胞。由于猪、羊属于杂种动物，根据实验动物学原理，杂种动物实验结果的可重复性往往较差〔1,2〕，同时动物价格和饲养管理也相对复杂。
, http://www.100md.com
新西兰兔属于远交系动物，其实验动物学质量高于一般杂种动物〔1,2〕。由于采用本实验方法可使新西兰兔提供足够的骨髓基质细胞和软骨细胞，同时实验中发现新西兰兔可以同时耐受髂骨和耳软骨的取材手术，无一例动物因取材手术而导致死亡，故认为新西兰兔可以用于组织工程骨及软骨的研究。虽然亦有学者取新西兰兔骨膜和顶骨作为组织工程骨的细胞来源〔6〕，但所需的成骨细胞培养周期长，程序较复杂，同时从未来临床的可适用性上，选用骨髓基质细胞更有意义。由于兔动物模型可同时获取大量的成骨细胞和软骨细胞，为采用该动物模型进行组织工程骨/软骨复合组织，乃至骨关节的组织工程建造研究提供了可能。
3.2 骨髓基质细胞和成骨细胞
骨髓基质细胞具有多向分化的特性〔7〕，本实验采用地塞米松诱导分化的骨髓基质细胞表现为明显的碱性磷酸酶活性，说明经诱导的骨髓基质细胞具有成骨细胞的表型，同时在体内成功地建造了骨组织，进一步说明采用兔动物模型在骨髓基质细胞的选择、应用和组织工程骨研究方面的可行性。目前证明骨髓基质细胞还可以诱导分化为软骨细胞、肌细胞和上皮细胞等〔7,8〕，如果将这些研究成果移植于组织工程学研究，也将赋予新西兰兔动物模型更丰富的研究内容和价值。
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4 结 论
新西兰兔可以提供足量的成骨细胞和软骨细胞，并具有遗传背景的一致性，适用于组织工程骨和软骨的研究。 新西兰兔可以提供足量的成骨细胞和软骨细胞，并具有遗传背景的一致性，适用于组织工程骨和软骨的研究。
本项目由国家自然科学基金(编号39779762)和军队医药卫生科研基金(编号98M104)资助
参考文献
1施新猷. 医学实验动物科学.西安: 陕西科学技术出版社, 1989.5
2 杨维东，彭品祥，马振国. 异体骨移植免疫原性研究中近交系小鼠动物模型的建立. 实用口腔医学杂志，1996,12(3)：177
3 Vacanti CA, Vacanti JP. Bone and cartilage reconstruction with tissue engineering approaches. Otolaryngol Clin North Am, 1994,27(1):263
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4 Paige KT, Cima LG, Yaremchuk MJ, et al. Injectable cartilage. Plast Reconstr Surg, 1995,96(6)：1390
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6 Breitbart AS，Grande DA，Kessler R, et al. Tissue engineered bone repair of calvarial defects using cultured periosteal cells. Plast Reconstr Surg, 1998，101(3):567
7 Kubota H，Reid LM. Stem cell-fed maturational lineages and epithelial organogenesis. Hum Cell,1997,10(1): 51
8 Martin I，Padera RF，Vunjak Novakovic G, et al. In vitro differentiation of chick embryo bone marrow stromal cells into cartilaginous and bone-like tissues. J Orthop Res, 1998,16(2):181
(收稿：1999-07-26), 百拇医药