神经端侧缝合术后肌肉的组织学变化
作者：张 琪 顾晓明
单位：西安第四军医大学口腔医学院颌面外科 710032
关键词：外科吻合术；神经肌肉；免疫组织化学
神经端侧缝合术后肌肉的组织学变化〔摘要〕 目的：研究神经端侧缝合术后靶肌肉的组织学变化和运动终板再生。方法：10只SD雄性大鼠分成A、B两组。A组：切断右侧腓总神经，将远侧断端以端侧缝合术式吻合到同侧胫神经外膜开窗部.。B组：切断右侧腓总神经，并将两断端分离。两组左侧后肢作为正常对照。术后2月作行为学检查。胫前肌取材行H E染色，胆碱酯酶染色和突触素免疫组化染色。结果：神经端侧缝合术后受体神经的靶肌肉功能得以恢复。组织学形态接近正常，神经肌肉接头可有效重建。结论：①神经端侧缝合术是一种有效的神经修复方法；②突触素组化染色用于研究运动终板的重建优于以往的胆碱酯酶染色法。
Histological observation of target muscle after end-to-side neurorrhaphy
, 百拇医药
Zhang Qi, Gu Xiaoming.Dept of Oral Maxillofacial Surgery, Stomatological Hospital, Fourth Military Medical University, Xi'an 710032
〔Abstract〕 Objective:To observe the histological changes and nerve muscle junction(NMJ) in the target muscle after end-to-side neurorrhaphy. Methods: 10 SD rats were randomly divided into two groups: Right common peroneal nerve was amputated, in group I the distal stump was sutured to the ipsilateral tibial nerve by the end-to-side way through an epineural window. In group Ⅱ the amputated right common peroneal nerve was severed as denervated control. The left legs of all rats were taken as normal control. After 2 months, all the rats were subjected to walking track analysis and histological examination. Results:The target muscle got partly functional recovery after end-to-side nurorrhaphy. New NMJ can be revived. Conclusion: ① The reinnervation of muscle can be recovered effectively by collateral sprouting after end-to-side neurorrhaphy. ② Synaptophysin immunohistochemical staining is an useful technique to study the reinnervation of muscle.
, 百拇医药
Key words Surgical anastomosis;Nearomuscular junction(NMJ); Immunohistochemistry
神经端侧缝合术是在不切断供体神经纤维的前提下利用供体神经侧枝性生芽，达到修复神经损伤目的〔1〕。对该方法能否诱导神经再生、并使靶器官功能得以恢复、以及恢复的程度尚有分歧〔2,3〕。目前，研究多限于吻合口部的轴突再生情况，对于术后靶器官变化的研究尚未见报道。我们设计了该实验，以期通过对靶器官组织变化的研究，对靶器官功能恢复情况和该方法的可行性作初步探讨。
1 材料和方法
1.1 实验动物
健康雄性SD大鼠10只(第四军医大学实验动物中心提供)，体重200 g左右，简单数字法随机分成2组，每组5只。A组右侧后肢为实验侧，B组右侧后肢为失神经对照侧。左侧为正常对照。
, 百拇医药
1.2 手术方法
严格无菌操作。A组于右侧股正中切开，暴露神经，切断腓总神经，结扎中枢侧断端。在胫神经外侧纵行切开外膜1 mm，修成圆形小窗，以11-0无创缝线将腓总神经远侧断端与胫神经开窗部做外膜缝合。B组将右侧腓总神经切断，结扎断端。两组左侧不作处理。术后动物不作特殊功能训练。
1.3 行为学观察
术后2月见失神经组右侧足趾屈曲，不能伸展，行走靠足外侧支撑平衡；端侧吻合术组术侧足趾均能主动伸展，行走时展趾距更大。驱赶行走30 min后，表现出展趾距变小，足蜷缩等类似腓总神经损伤表现。
1.4 取材及切片
切取双侧胫前肌，在最大横径部沿肌纤维方向作冰冻连续切片15张，厚25 μm。5片用于乙酰胆碱脂酶(AChE)染色；5片用于AChE加Gros染色；5片用于突触素(SYP)免疫组化染色。切片入丙酮固定，干燥后冷冻保存，余留肌组织作HE染色。
, 百拇医药
1.5 胆碱酯酶组化染色
切片滴加胆碱酯酶孵育液，4 ℃过夜，水洗，封片。行Gros银染者水洗后，200 g/L硝酸银避光浸染45 min，体积分数为20%福尔马林洗，水洗，加氨银液显色，用200 g/L 20%氨水终止反应，水洗后，滴加2 g/L氯化金，入500 g/L硫代硫酸钠。封片。
1.6 免疫组织化学染色
切片浸入体积分数为0.3% H2O2 30 min，滴加ABB封闭剂，水洗后加1∶20工作血清(DaCo公司)室温30 min，加一抗1∶50兔抗SYP多抗(DaCo公司)，4 ℃过夜；0.01 mol/L PBS洗3次，滴加1∶100羊抗兔抗体(DaCo公司)37 ℃ 30 min, PBS洗3次，加SABC复合物(武汉博士德公司)30 min，PBS洗3次，DAB显色。脱水透明，封片。以PBS代替一抗作为阴性对照。
, 百拇医药
2 结 果
2.1 HE染色 失神经肌肌细胞广泛萎缩，呈多样性，个别肿胀崩解，核居中，肌纤维间及肌束间纤维组织增多。端侧缝合术组肌纤维形态大小接近正常，在小范围有轻度萎缩，肌束内外有少量纤维增生，但明显区别于失神经肌肉的表现。
2.2 AChE染色 镜下正常胫前肌终板带窄，由大小一致的棕黑色盘状着色区排列而成。着色区位于肌纤维表面(图1 A)。Gros法复染后可见部分终板与神经末稍连接。失神经肌中，终板带变宽，脚板直径缩小50%左右，着色浅，分布弥散，位于萎缩肌纤维表面，脚板数无明显改变(图1 B)。Gros法复染后未见神经末稍。神经吻合组终板带呈窄带。脚板数无改变，部分脚板形态、着色恢复正常，部分仍呈萎缩。脚板排列由弥散状向线状恢复(图1 C)。Gros法复染后可见少量神经末稍与之相接。
, 百拇医药
A正常组 B失神经组 C失神经组
图1 AChE染色法显示胫前肌终板形态及分布 ×40
2.3 SYP染色 在正常肌的终板区肌间隙见特异的棕黄色颗粒状或点状着色，沿终板带排列，每个肌间隙有1～2个，数量与AChE法显示的脚板一致(图 2.A)。失神经肌无此特异染色，同阴性对照片。神经吻合组胫前肌终板区可见此特异染色颗粒，数量为正常的40%～60%。体积较小，着色较浅(图2 B)。
A正常组 B实验组
, 百拇医药
图2 SYP免疫组化染色所显示胫前肌中终板形态及分布×400
3 讨 论
神经肌肉接头(NMJ)是神经与肌肉的功能性连接结构，乙酰胆碱(ACh)在NMJ的传递实现了神经与肌肉的信息传递，其重建是肌肉功能恢复的基础。
AChE集中位于终板区肌膜表面，当失神经支配后，数量减少，但不会消失。再获神经支配后数量有一定的恢复。以往多采用AChE染色法，结合Gros法研究肌肉失神经和再获神经支配后，运动终板的退变和再生。失神经后AChE产生明显变化，一般认为需3个月以上，这必然延长实验周期。而加用Gros法复染时，即使正常肌肉也难以达到每个脚板区都有神经末梢相连接的理想情况，因此不宜用于定量描述终板再生。
SYP由神经元合成后沿轴浆流输送到神经终末，构成突触囊泡的特异性膜通道。与突触结构功能密切相关，参与调节神经递质(包括ACh)的释放〔4〕。神经切断后22～48 h囊泡即溃变消失。SYP的表达和突触的形成是一致的，出现SYP是突触重新发生的一种突触前终末特异性标志。骨胳肌功能的重建不仅要有神经纤维的再生和长入，更须重建NMJ。因此，用抗SYP组化染色，能更准确、快速地反映功能性的神经再生和肌功能恢复情况。
, 百拇医药
供体神经外膜开窗的端侧缝合，可诱发其侧支再生，到达靶肌肉，与肌肉重建功能性连接，并能减轻肌肉萎缩，恢复部分肌功能。其机理可能是失神经靶肌肉通过
氏带产生引导和再生诱导作用，促使供体神经发出额外的侧支。这种侧支除了供体神经在吻合部形成高位侧支外，还可能有因再生轴突的生长速度不一，当1根轴突先期到达靶肌肉时，其邻近的尚未获得神经支配的肌纤维，诱导该轴突发出低位侧支而获支配〔5〕。动物过度运动后的易疲劳表现，认为是再生神经纤维支配额外的肌纤维，过载的同时神经元体积尚未能代偿性增大，来维持正常的轴浆运输，加之再生的终扣形态和功能不成熟，出现了供不应求，表现出恢复神经再支配的肌肉的功能不全所致。本实验间接证明：①神经断端及靶器官可诱发供体神经侧枝生芽，使靶器功能得以部分恢复；②神经端侧缝合术是一种可行的功能性神经修复方法；③SYP组化染色能准确、及时地反映肌肉在失神经和再获神经支配后的运动终板的变化情况，较以往的方法，AChE和Gros法有明显优点。
, http://www.100md.com
参考文献
1Viterbo F,Trindade JC. End-to-side neurorrhaphy with romoval of the epineurial sheath: An experimental study in rats. Plast Reconstr Surg, 1994,94(7):1038
2 Tarasidis G, Watanabe O. End-to-side neurorrhaphy resulting in limited sensory axonal regeneration in rat model. Ann Otel Rhinol Laryngol, 1997,106(6):506
3 Bertelli JA. Is anxonal sprouting able to traverse the conjunctival layes of the peripheral nerve? A behioral,motor,and sensory study of end-to-side nerve anastomosis, Reconstr Microsurg, 1996,12(8):559
4 洪 岸，姚志彬. 老年大鼠学习记忆减退与海马结构的突触素改变.解剖学报, 1996,27(2):164
5 顾晓明，周树夏, 刘宝林.肌肉移植后的重组现象及其意义.实用口腔医学杂志,1992,8(3):131
(收稿：1999-01-26), 百拇医药
单位：西安第四军医大学口腔医学院颌面外科 710032
关键词：外科吻合术；神经肌肉；免疫组织化学
神经端侧缝合术后肌肉的组织学变化〔摘要〕 目的：研究神经端侧缝合术后靶肌肉的组织学变化和运动终板再生。方法：10只SD雄性大鼠分成A、B两组。A组：切断右侧腓总神经，将远侧断端以端侧缝合术式吻合到同侧胫神经外膜开窗部.。B组：切断右侧腓总神经，并将两断端分离。两组左侧后肢作为正常对照。术后2月作行为学检查。胫前肌取材行H E染色，胆碱酯酶染色和突触素免疫组化染色。结果：神经端侧缝合术后受体神经的靶肌肉功能得以恢复。组织学形态接近正常，神经肌肉接头可有效重建。结论：①神经端侧缝合术是一种有效的神经修复方法；②突触素组化染色用于研究运动终板的重建优于以往的胆碱酯酶染色法。
Histological observation of target muscle after end-to-side neurorrhaphy
, 百拇医药
Zhang Qi, Gu Xiaoming.Dept of Oral Maxillofacial Surgery, Stomatological Hospital, Fourth Military Medical University, Xi'an 710032
〔Abstract〕 Objective:To observe the histological changes and nerve muscle junction(NMJ) in the target muscle after end-to-side neurorrhaphy. Methods: 10 SD rats were randomly divided into two groups: Right common peroneal nerve was amputated, in group I the distal stump was sutured to the ipsilateral tibial nerve by the end-to-side way through an epineural window. In group Ⅱ the amputated right common peroneal nerve was severed as denervated control. The left legs of all rats were taken as normal control. After 2 months, all the rats were subjected to walking track analysis and histological examination. Results:The target muscle got partly functional recovery after end-to-side nurorrhaphy. New NMJ can be revived. Conclusion: ① The reinnervation of muscle can be recovered effectively by collateral sprouting after end-to-side neurorrhaphy. ② Synaptophysin immunohistochemical staining is an useful technique to study the reinnervation of muscle.
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Key words Surgical anastomosis;Nearomuscular junction(NMJ); Immunohistochemistry
神经端侧缝合术是在不切断供体神经纤维的前提下利用供体神经侧枝性生芽，达到修复神经损伤目的〔1〕。对该方法能否诱导神经再生、并使靶器官功能得以恢复、以及恢复的程度尚有分歧〔2,3〕。目前，研究多限于吻合口部的轴突再生情况，对于术后靶器官变化的研究尚未见报道。我们设计了该实验，以期通过对靶器官组织变化的研究，对靶器官功能恢复情况和该方法的可行性作初步探讨。
1 材料和方法
1.1 实验动物
健康雄性SD大鼠10只(第四军医大学实验动物中心提供)，体重200 g左右，简单数字法随机分成2组，每组5只。A组右侧后肢为实验侧，B组右侧后肢为失神经对照侧。左侧为正常对照。
, 百拇医药
1.2 手术方法
严格无菌操作。A组于右侧股正中切开，暴露神经，切断腓总神经，结扎中枢侧断端。在胫神经外侧纵行切开外膜1 mm，修成圆形小窗，以11-0无创缝线将腓总神经远侧断端与胫神经开窗部做外膜缝合。B组将右侧腓总神经切断，结扎断端。两组左侧不作处理。术后动物不作特殊功能训练。
1.3 行为学观察
术后2月见失神经组右侧足趾屈曲，不能伸展，行走靠足外侧支撑平衡；端侧吻合术组术侧足趾均能主动伸展，行走时展趾距更大。驱赶行走30 min后，表现出展趾距变小，足蜷缩等类似腓总神经损伤表现。
1.4 取材及切片
切取双侧胫前肌，在最大横径部沿肌纤维方向作冰冻连续切片15张，厚25 μm。5片用于乙酰胆碱脂酶(AChE)染色；5片用于AChE加Gros染色；5片用于突触素(SYP)免疫组化染色。切片入丙酮固定，干燥后冷冻保存，余留肌组织作HE染色。
, 百拇医药
1.5 胆碱酯酶组化染色
切片滴加胆碱酯酶孵育液，4 ℃过夜，水洗，封片。行Gros银染者水洗后，200 g/L硝酸银避光浸染45 min，体积分数为20%福尔马林洗，水洗，加氨银液显色，用200 g/L 20%氨水终止反应，水洗后，滴加2 g/L氯化金，入500 g/L硫代硫酸钠。封片。
1.6 免疫组织化学染色
切片浸入体积分数为0.3% H2O2 30 min，滴加ABB封闭剂，水洗后加1∶20工作血清(DaCo公司)室温30 min，加一抗1∶50兔抗SYP多抗(DaCo公司)，4 ℃过夜；0.01 mol/L PBS洗3次，滴加1∶100羊抗兔抗体(DaCo公司)37 ℃ 30 min, PBS洗3次，加SABC复合物(武汉博士德公司)30 min，PBS洗3次，DAB显色。脱水透明，封片。以PBS代替一抗作为阴性对照。
, 百拇医药
2 结 果
2.1 HE染色 失神经肌肌细胞广泛萎缩，呈多样性，个别肿胀崩解，核居中，肌纤维间及肌束间纤维组织增多。端侧缝合术组肌纤维形态大小接近正常，在小范围有轻度萎缩，肌束内外有少量纤维增生，但明显区别于失神经肌肉的表现。
2.2 AChE染色 镜下正常胫前肌终板带窄，由大小一致的棕黑色盘状着色区排列而成。着色区位于肌纤维表面(图1 A)。Gros法复染后可见部分终板与神经末稍连接。失神经肌中，终板带变宽，脚板直径缩小50%左右，着色浅，分布弥散，位于萎缩肌纤维表面，脚板数无明显改变(图1 B)。Gros法复染后未见神经末稍。神经吻合组终板带呈窄带。脚板数无改变，部分脚板形态、着色恢复正常，部分仍呈萎缩。脚板排列由弥散状向线状恢复(图1 C)。Gros法复染后可见少量神经末稍与之相接。
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A正常组 B失神经组 C失神经组
图1 AChE染色法显示胫前肌终板形态及分布 ×40
2.3 SYP染色 在正常肌的终板区肌间隙见特异的棕黄色颗粒状或点状着色，沿终板带排列，每个肌间隙有1～2个，数量与AChE法显示的脚板一致(图 2.A)。失神经肌无此特异染色，同阴性对照片。神经吻合组胫前肌终板区可见此特异染色颗粒，数量为正常的40%～60%。体积较小，着色较浅(图2 B)。
A正常组 B实验组
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图2 SYP免疫组化染色所显示胫前肌中终板形态及分布×400
3 讨 论
神经肌肉接头(NMJ)是神经与肌肉的功能性连接结构，乙酰胆碱(ACh)在NMJ的传递实现了神经与肌肉的信息传递，其重建是肌肉功能恢复的基础。
AChE集中位于终板区肌膜表面，当失神经支配后，数量减少，但不会消失。再获神经支配后数量有一定的恢复。以往多采用AChE染色法，结合Gros法研究肌肉失神经和再获神经支配后，运动终板的退变和再生。失神经后AChE产生明显变化，一般认为需3个月以上，这必然延长实验周期。而加用Gros法复染时，即使正常肌肉也难以达到每个脚板区都有神经末梢相连接的理想情况，因此不宜用于定量描述终板再生。
SYP由神经元合成后沿轴浆流输送到神经终末，构成突触囊泡的特异性膜通道。与突触结构功能密切相关，参与调节神经递质(包括ACh)的释放〔4〕。神经切断后22～48 h囊泡即溃变消失。SYP的表达和突触的形成是一致的，出现SYP是突触重新发生的一种突触前终末特异性标志。骨胳肌功能的重建不仅要有神经纤维的再生和长入，更须重建NMJ。因此，用抗SYP组化染色，能更准确、快速地反映功能性的神经再生和肌功能恢复情况。
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供体神经外膜开窗的端侧缝合，可诱发其侧支再生，到达靶肌肉，与肌肉重建功能性连接，并能减轻肌肉萎缩，恢复部分肌功能。其机理可能是失神经靶肌肉通过
氏带产生引导和再生诱导作用，促使供体神经发出额外的侧支。这种侧支除了供体神经在吻合部形成高位侧支外，还可能有因再生轴突的生长速度不一，当1根轴突先期到达靶肌肉时，其邻近的尚未获得神经支配的肌纤维，诱导该轴突发出低位侧支而获支配〔5〕。动物过度运动后的易疲劳表现，认为是再生神经纤维支配额外的肌纤维，过载的同时神经元体积尚未能代偿性增大，来维持正常的轴浆运输，加之再生的终扣形态和功能不成熟，出现了供不应求，表现出恢复神经再支配的肌肉的功能不全所致。本实验间接证明：①神经断端及靶器官可诱发供体神经侧枝生芽，使靶器功能得以部分恢复；②神经端侧缝合术是一种可行的功能性神经修复方法；③SYP组化染色能准确、及时地反映肌肉在失神经和再获神经支配后的运动终板的变化情况，较以往的方法，AChE和Gros法有明显优点。, http://www.100md.com
参考文献
1Viterbo F,Trindade JC. End-to-side neurorrhaphy with romoval of the epineurial sheath: An experimental study in rats. Plast Reconstr Surg, 1994,94(7):1038
2 Tarasidis G, Watanabe O. End-to-side neurorrhaphy resulting in limited sensory axonal regeneration in rat model. Ann Otel Rhinol Laryngol, 1997,106(6):506
3 Bertelli JA. Is anxonal sprouting able to traverse the conjunctival layes of the peripheral nerve? A behioral,motor,and sensory study of end-to-side nerve anastomosis, Reconstr Microsurg, 1996,12(8):559
4 洪 岸，姚志彬. 老年大鼠学习记忆减退与海马结构的突触素改变.解剖学报, 1996,27(2):164
5 顾晓明，周树夏, 刘宝林.肌肉移植后的重组现象及其意义.实用口腔医学杂志,1992,8(3):131
(收稿：1999-01-26), 百拇医药