Western-Blotting在粘放菌5519 I型菌毛鉴定中的应用
作者：梁景平 刘 正 朱 敏 黄冬生
单位：上海第二医科大学口腔医学院 200011
关键词：菌毛；SDS-PAGE电泳；粘放菌。
实用口腔医学杂志990501 〔摘要〕 目的：检测粘放菌5519 I型菌毛的纯度及Western-Blotting方法的特异性。方法：采用SDS-PAGE电泳和Western-Blotting免疫印迹法。结果：粘放菌5519 I型菌Mr大部分为54 000，少部分为38 000。Western-Blotting检测结果与SDS-PAGE结果相一致。结论：Western-Blotting在粘放菌菌毛鉴定中具有高度特异性。
Identification of type I fimbriae in A.viscosus
, 百拇医药
5519 with Western-Blotting
Liang Jingping,Liu Zheng,Zhu Min,et al. College of Stomatology, Shanghai Second Medical University,Shanghai 200011
〔Abstract〕Objective:To study the feasibility of Western-Blotting in the identification of type I fimbriae in A.Viscosus 5519.Method:SDS-PAGE electrophoresis and Western-Blotting were carried out to identificate type I fimbriae in A.Viscosus 5519.Results:The molecules of type I fimbriae of A.Viscosus 5519 detected by Western-Blotting were consistent with that by SDS-PAGE.Conclusion:Western-Blotting is feasible in identification of fimbriae of A.Viscosus.
, 百拇医药
Key words Fimbriae;SDS-PAGE electrophoresis;Actinomyces Viscosus
Western-Blotting(免疫印迹技术)作为一种快速、灵敏的筛选抗原和抗血清技术，在研究领域中用来进行抗原特性的描述，具有高度的特异性〔1〕。为此，本实验拟采用本方法对提取的粘放菌5519 I型菌毛的抗原及抗体进行分析、比较，探讨菌毛的抗原纯度。
1 材料和方法
1.1 菌毛的分离和提取
1.1.1 细菌的培养 本实验采用T14V变异菌株粘性放线菌5519(只含I型菌毛)，转种于TSA培养基微氧培养48 h，经革兰氏染色及生化反应鉴定为该菌后转种于20 L TSB培养基中，微需氧培养48 h取出备用。
, http://www.100md.com
1.1.2 菌毛的分离 将2万ml细菌培养液经4 000 r/min离心，20 min后收集菌细胞，以生理盐水反复清洗3次后，收集菌细胞在超声波中进行粉碎，低温高速离心(48 300×g) 20 min，去除菌细胞及细胞壁碎片，上清液低温高速离心(160 000×g) 24 h后，取沉淀物于0.1 mol/L Tris-HCl(TBS)溶液中，反复超声、离心3次，加入过饱和硫酸铵4 ℃过夜，经反复透析、浓缩后取得纯菌毛提取物，测定菌毛总蛋白量(4 g/L)。
1.2 SDS-PAGE电泳
1.2.1 本实验采用SDS-PAGE 电泳凝胶为体积分数为12.5%分离胶和体积分数为3.5%浓缩胶。(试剂及电泳仪为Bio-RAD公司产品)。
1.2.2 取上述方法提取的抗原50 μl加入50 μl样本稀释液，混匀加热后上样(每槽10 μl)，并以标准蛋白分子量进行对照。
, 百拇医药
1.2.3 电泳电流为浓缩胶20 mA，分离胶30 mA，电泳时间约3 h。
1.3 转移
1.3.1 SDS-PAGE 电泳结束后，切下标准分子量及含有样本的凝胶条带，以考马斯蓝染色。
1.3.2 将走样凝胶板放置半干式转移槽中转移至NC膜上，然后剪下一条宽约0.3 cm条带，放置伊红染色液中染色，观察样品条带，余下NC膜放置含体积分数为0.3%吐温-20的PBS液中封闭过夜。
1.4 ELISA试验
1.4.1 将NC膜划成约0.3～0.5 cm宽，放置反应槽板中；1.4.2 用含吐温-20的PBS(pH7.4,0.02 mol/L)液洗涤1次；
1.4.3 加入兔抗粘放菌5519 I型菌毛多克隆抗体(效价为1∶64，另外方法制备、提取)，稀释浓度分别为1∶100，1∶200及1∶400，每槽加入1 ml，置37 ℃摇床温育1 h，然后反复洗涤3次，每次3 min；
, 百拇医药
1.4.4 加入羊抗兔酶标抗体(1∶100，1∶200及1∶400稀释)，每槽加1 ml，置37 ℃温育1 h后取出，反复洗涤3次，每次3 min；
1.4.5 加入DAB底物液和终止液，观察反应结果。
2 结 果
2.1 SDS-PAGE电泳
从粘放菌5519 I型菌毛的琼脂糖凝胶电泳图像上可看到两条条带，与标准分子量相比较，一条相对分子质量大约为54 000，另一条大约为38 000(图1)。
图1 SDS-PAGE电泳
A粘放菌5519 I型菌毛提取物 B标准蛋白分子量
, http://www.100md.com
2.2 Western-Blotting检验结果
从Western-Blotting方法测定结果可以清晰地看到菌毛样品呈现二条带，与电泳结果一致(图2)
图2 Western-Blotting免疫印迹图
3 讨 论
3.1 I型菌毛的纯度
近年来，Western-Blotting 已被广泛地应用于研究蛋白质的纯度和抗原抗体的相互作用。与其它技术相比较，它主要通过利用生物分子间相互作用而予以特异性检出。这是因为亲和的甲、乙双方中，甲方被凝胶电泳分离已有了高纯度，再经印渍固定化，又使它获得了相对稳定性。印渍纸很薄，和凝胶相比，甲方是处在固定化介质表面，这又有了容易和乙方接近的机会，因为生物分子间相互作用具有高度特异性。当用乙方与之作用时，即使乙方处在其它分子群中，也能识别出甲方而发生相互作用，这就具有了高度灵敏性。因此，免疫印迹法所体现的高纯度、高稳定性和易接近性、高灵敏度，而且操作简便，装置简单以及多考贝等特点，使它成为探讨生物分子间相互作用的优良技术〔2〕。
, http://www.100md.com
粘放菌I型菌毛的提取和鉴定对于菌毛作用机理的研究具有重要的意义〔3，4〕，为此我们曾采用菌毛蛋白分子量的鉴定和透射电镜检查以及氨基酸组成分析以确定菌毛的纯度(另文报告)。为了进一步对提取的菌毛纯度进行鉴定，本实验采用了Western-Blotting对提取的菌毛作进一步的鉴定。结果显示，兔抗粘放菌I型菌毛的单克隆抗体能完全与粘放菌5519 I型菌毛相结合，出现清晰的条带，经与SDS-PAGE电泳相比较，其相对分子质量约为54 000和38 000，与我们先前的结果相一致，这不仅说明提取的菌毛蛋白纯度高，而且也说明制备提取的抗体纯度好、效价高。Maurer和John等也曾报道粘放菌I型菌毛具有两个不同组分，一组相对分子质量为54 000，可能为菌毛的主要蛋白成份，另一组为38 000，可能为I型菌毛的亚单位或者递解产物〔5〕。
3.2 上样样本量、印渍时间与印渍效率的关系
许多实验都证明，样本上样量，印渍时间与Western-Blotting方法的印渍效率有很大关系。就上样量而言，若蛋白质含量在10 μg以下则很难检出，若大于25 μg，则检测结果同样有很大差异〔6〕。为此，本实验在作预实验时也采用了二种不同含量的蛋白质进行样本上样。一组上样量为7.2 μg，另一组为16.5 μg，并进行对照，结果显示，16.5 μg印渍效果明显优于7.5 μg组。这再一次证明，要取得较好印渍效果，必须将样本上样量控制在一定的范围内，一般认为在10～25 μg内，才能取得较好的实验效果。此外，有人报道印渍的效果还取决于蛋白分子量与印渍时间的关系，如小分子蛋白Mr 30 000和Mr 45 000，只需30 min印渍时间即可达到最佳效果〔7，8〕。本实验中菌毛蛋白相对分子质量约在Mr 38 000～54 000间，我们结合以上经验，兼顾分子量，适当延长了印渍时间，同样取得了较好的印渍效果。
, http://www.100md.com
根据我们以往的实验结果，包括菌毛相对分子质量的测定、电镜检查、氨基酸组成以及此次Western-Blotting免疫印迹法检查，可以确定，从粘放菌5519中提取的I型菌毛具有二个蛋白相对分子质量，一为Mr 54 000，另一为Mr 38 000。今后应进一步研究这二个相对分子质量之间的关系以及在细菌粘附中的作用。
本课题为国家自然科学基金资助课题，项目编号 39670782
参考文献
1彭秀玲主编.基因工程实验技术.第2版.长沙：湖南科学技术出版社,1997.156～161
2 范培昌编著.生物大分子印渍技术和应用.上海：上海科学文献出版社，1986.233～234
3 Revis GJ,Vatter AE,Crowel AJ,et al.Antibody against the type Ag2 fimbriae of Actinomyces viscosus T14V inhibit lactose-sensitive bacterial adherence.Infect Immun,1982,36(3):1217
, 百拇医药
4 Masnda NRP,Ellen RP,Fillery EO,et al.Chemical and immunological surface fibrils of strains representing six taxonomic groups of Actinomyces viscosus and Actinomyces naeslundii. Infect immun, 1985,39:1325
5 Maurer L,Orndorff PE.Identification and characterization of genes determining receptor binding and pilus length of Escherichin coli type I pili.Bacteriology,1987,169:640
6 Gibson W.Protease-facilitated tranefer of high-molecular-weight protein during electrotransfer to nitrocellulase.Anal Biochem, 1981,118:1
, http://www.100md.com
7 How JG, Hershey JWB.A sensitive immunoblotting method for measuring protein synthesis initiation factor levels in lysates of Escherichia Coli. J Biol Chem,1981,256:12836
8 Ohlesson BG,Westrom BR,Karlsson BW.Enzymoblotting:A method for localizing proteinases and their zymogens using paranitroanilide substrates after agarose gel electrophoresis and transfer to nitrocellulose.Anal Biochem,1986,152:239
(收稿：1998-09-02 修回：1999-05-03), 百拇医药
单位：上海第二医科大学口腔医学院 200011
关键词：菌毛；SDS-PAGE电泳；粘放菌。
实用口腔医学杂志990501 〔摘要〕 目的：检测粘放菌5519 I型菌毛的纯度及Western-Blotting方法的特异性。方法：采用SDS-PAGE电泳和Western-Blotting免疫印迹法。结果：粘放菌5519 I型菌Mr大部分为54 000，少部分为38 000。Western-Blotting检测结果与SDS-PAGE结果相一致。结论：Western-Blotting在粘放菌菌毛鉴定中具有高度特异性。
Identification of type I fimbriae in A.viscosus
, 百拇医药
5519 with Western-Blotting
Liang Jingping,Liu Zheng,Zhu Min,et al. College of Stomatology, Shanghai Second Medical University,Shanghai 200011
〔Abstract〕Objective:To study the feasibility of Western-Blotting in the identification of type I fimbriae in A.Viscosus 5519.Method:SDS-PAGE electrophoresis and Western-Blotting were carried out to identificate type I fimbriae in A.Viscosus 5519.Results:The molecules of type I fimbriae of A.Viscosus 5519 detected by Western-Blotting were consistent with that by SDS-PAGE.Conclusion:Western-Blotting is feasible in identification of fimbriae of A.Viscosus.
, 百拇医药
Key words Fimbriae;SDS-PAGE electrophoresis;Actinomyces Viscosus
Western-Blotting(免疫印迹技术)作为一种快速、灵敏的筛选抗原和抗血清技术，在研究领域中用来进行抗原特性的描述，具有高度的特异性〔1〕。为此，本实验拟采用本方法对提取的粘放菌5519 I型菌毛的抗原及抗体进行分析、比较，探讨菌毛的抗原纯度。
1 材料和方法
1.1 菌毛的分离和提取
1.1.1 细菌的培养 本实验采用T14V变异菌株粘性放线菌5519(只含I型菌毛)，转种于TSA培养基微氧培养48 h，经革兰氏染色及生化反应鉴定为该菌后转种于20 L TSB培养基中，微需氧培养48 h取出备用。
, http://www.100md.com
1.1.2 菌毛的分离 将2万ml细菌培养液经4 000 r/min离心，20 min后收集菌细胞，以生理盐水反复清洗3次后，收集菌细胞在超声波中进行粉碎，低温高速离心(48 300×g) 20 min，去除菌细胞及细胞壁碎片，上清液低温高速离心(160 000×g) 24 h后，取沉淀物于0.1 mol/L Tris-HCl(TBS)溶液中，反复超声、离心3次，加入过饱和硫酸铵4 ℃过夜，经反复透析、浓缩后取得纯菌毛提取物，测定菌毛总蛋白量(4 g/L)。
1.2 SDS-PAGE电泳
1.2.1 本实验采用SDS-PAGE 电泳凝胶为体积分数为12.5%分离胶和体积分数为3.5%浓缩胶。(试剂及电泳仪为Bio-RAD公司产品)。
1.2.2 取上述方法提取的抗原50 μl加入50 μl样本稀释液，混匀加热后上样(每槽10 μl)，并以标准蛋白分子量进行对照。
, 百拇医药
1.2.3 电泳电流为浓缩胶20 mA，分离胶30 mA，电泳时间约3 h。
1.3 转移
1.3.1 SDS-PAGE 电泳结束后，切下标准分子量及含有样本的凝胶条带，以考马斯蓝染色。
1.3.2 将走样凝胶板放置半干式转移槽中转移至NC膜上，然后剪下一条宽约0.3 cm条带，放置伊红染色液中染色，观察样品条带，余下NC膜放置含体积分数为0.3%吐温-20的PBS液中封闭过夜。
1.4 ELISA试验
1.4.1 将NC膜划成约0.3～0.5 cm宽，放置反应槽板中；1.4.2 用含吐温-20的PBS(pH7.4,0.02 mol/L)液洗涤1次；
1.4.3 加入兔抗粘放菌5519 I型菌毛多克隆抗体(效价为1∶64，另外方法制备、提取)，稀释浓度分别为1∶100，1∶200及1∶400，每槽加入1 ml，置37 ℃摇床温育1 h，然后反复洗涤3次，每次3 min；
, 百拇医药
1.4.4 加入羊抗兔酶标抗体(1∶100，1∶200及1∶400稀释)，每槽加1 ml，置37 ℃温育1 h后取出，反复洗涤3次，每次3 min；
1.4.5 加入DAB底物液和终止液，观察反应结果。
2 结 果
2.1 SDS-PAGE电泳
从粘放菌5519 I型菌毛的琼脂糖凝胶电泳图像上可看到两条条带，与标准分子量相比较，一条相对分子质量大约为54 000，另一条大约为38 000(图1)。
图1 SDS-PAGE电泳
A粘放菌5519 I型菌毛提取物 B标准蛋白分子量
, http://www.100md.com
2.2 Western-Blotting检验结果
从Western-Blotting方法测定结果可以清晰地看到菌毛样品呈现二条带，与电泳结果一致(图2)
图2 Western-Blotting免疫印迹图
3 讨 论
3.1 I型菌毛的纯度
近年来，Western-Blotting 已被广泛地应用于研究蛋白质的纯度和抗原抗体的相互作用。与其它技术相比较，它主要通过利用生物分子间相互作用而予以特异性检出。这是因为亲和的甲、乙双方中，甲方被凝胶电泳分离已有了高纯度，再经印渍固定化，又使它获得了相对稳定性。印渍纸很薄，和凝胶相比，甲方是处在固定化介质表面，这又有了容易和乙方接近的机会，因为生物分子间相互作用具有高度特异性。当用乙方与之作用时，即使乙方处在其它分子群中，也能识别出甲方而发生相互作用，这就具有了高度灵敏性。因此，免疫印迹法所体现的高纯度、高稳定性和易接近性、高灵敏度，而且操作简便，装置简单以及多考贝等特点，使它成为探讨生物分子间相互作用的优良技术〔2〕。
, http://www.100md.com
粘放菌I型菌毛的提取和鉴定对于菌毛作用机理的研究具有重要的意义〔3，4〕，为此我们曾采用菌毛蛋白分子量的鉴定和透射电镜检查以及氨基酸组成分析以确定菌毛的纯度(另文报告)。为了进一步对提取的菌毛纯度进行鉴定，本实验采用了Western-Blotting对提取的菌毛作进一步的鉴定。结果显示，兔抗粘放菌I型菌毛的单克隆抗体能完全与粘放菌5519 I型菌毛相结合，出现清晰的条带，经与SDS-PAGE电泳相比较，其相对分子质量约为54 000和38 000，与我们先前的结果相一致，这不仅说明提取的菌毛蛋白纯度高，而且也说明制备提取的抗体纯度好、效价高。Maurer和John等也曾报道粘放菌I型菌毛具有两个不同组分，一组相对分子质量为54 000，可能为菌毛的主要蛋白成份，另一组为38 000，可能为I型菌毛的亚单位或者递解产物〔5〕。
3.2 上样样本量、印渍时间与印渍效率的关系
许多实验都证明，样本上样量，印渍时间与Western-Blotting方法的印渍效率有很大关系。就上样量而言，若蛋白质含量在10 μg以下则很难检出，若大于25 μg，则检测结果同样有很大差异〔6〕。为此，本实验在作预实验时也采用了二种不同含量的蛋白质进行样本上样。一组上样量为7.2 μg，另一组为16.5 μg，并进行对照，结果显示，16.5 μg印渍效果明显优于7.5 μg组。这再一次证明，要取得较好印渍效果，必须将样本上样量控制在一定的范围内，一般认为在10～25 μg内，才能取得较好的实验效果。此外，有人报道印渍的效果还取决于蛋白分子量与印渍时间的关系，如小分子蛋白Mr 30 000和Mr 45 000，只需30 min印渍时间即可达到最佳效果〔7，8〕。本实验中菌毛蛋白相对分子质量约在Mr 38 000～54 000间，我们结合以上经验，兼顾分子量，适当延长了印渍时间，同样取得了较好的印渍效果。
, http://www.100md.com
根据我们以往的实验结果，包括菌毛相对分子质量的测定、电镜检查、氨基酸组成以及此次Western-Blotting免疫印迹法检查，可以确定，从粘放菌5519中提取的I型菌毛具有二个蛋白相对分子质量，一为Mr 54 000，另一为Mr 38 000。今后应进一步研究这二个相对分子质量之间的关系以及在细菌粘附中的作用。
本课题为国家自然科学基金资助课题，项目编号 39670782
参考文献
1彭秀玲主编.基因工程实验技术.第2版.长沙：湖南科学技术出版社,1997.156～161
2 范培昌编著.生物大分子印渍技术和应用.上海：上海科学文献出版社，1986.233～234
3 Revis GJ,Vatter AE,Crowel AJ,et al.Antibody against the type Ag2 fimbriae of Actinomyces viscosus T14V inhibit lactose-sensitive bacterial adherence.Infect Immun,1982,36(3):1217
, 百拇医药
4 Masnda NRP,Ellen RP,Fillery EO,et al.Chemical and immunological surface fibrils of strains representing six taxonomic groups of Actinomyces viscosus and Actinomyces naeslundii. Infect immun, 1985,39:1325
5 Maurer L,Orndorff PE.Identification and characterization of genes determining receptor binding and pilus length of Escherichin coli type I pili.Bacteriology,1987,169:640
6 Gibson W.Protease-facilitated tranefer of high-molecular-weight protein during electrotransfer to nitrocellulase.Anal Biochem, 1981,118:1
, http://www.100md.com
7 How JG, Hershey JWB.A sensitive immunoblotting method for measuring protein synthesis initiation factor levels in lysates of Escherichia Coli. J Biol Chem,1981,256:12836
8 Ohlesson BG,Westrom BR,Karlsson BW.Enzymoblotting:A method for localizing proteinases and their zymogens using paranitroanilide substrates after agarose gel electrophoresis and transfer to nitrocellulose.Anal Biochem,1986,152:239
(收稿：1998-09-02 修回：1999-05-03), 百拇医药