磁导向甲氨蝶呤缓释药物对口底癌HSC-2细胞生长和起微结构的影响
作者：张皖清 毛天球 吴军正 李焰
单位：张皖清(第四军医大学口腔医学院，710032；现在304医院工作)；毛天球(第四军医大学口腔医学院，710032)；吴军正(第四军医大学口腔医学院，710032)；李焰(第四军医大学口腔医学院，710032)
关键词：甲氨蝶呤；缓释制剂；口底；癌；超微结构
实用口腔医学杂志000123 摘 要：目的：探讨磁导向甲氨蝶呤缓释药物(FM-MTX)对人口底癌HSC-2细胞生长及细胞超微结构的影响。方法：对照组为不加药物处理组，实验组加入剂量为100 μg/L的FM-MTX药物处理，采用MTT法观察HSC-2细胞的生长曲线，并分别于不同时间(1,4,24,48,72 h)收获细胞，透射电镜观察各时间点细胞的超微结构变化。结果：FM-MTX药物处理后，口底癌HSC-2细胞生长明显受到抑制；透射电镜观察到药物作用早期，瘤细胞溶酶体大量增生，4 h后瘤细胞胞浆溶酶体开始吞噬磁性微粒，48 h溶酶体膜开始裂解，颗粒释放到胞浆内。72 h后溶解、液化，溶酶体膜消失，呈现胞浆空泡结构。线粒体和内质网肿胀、缺嵴、断裂。结论：甲氨蝶呤缓释药物能诱导口底癌HSC-2细胞死亡，对其有明显的杀伤作用。其作用机制尚需进一步研究。
, 百拇医药
分类号：R739.8 文献标识码：A
文章编号：1001-3733(2000)01-0071-03
Effects of magnetic methotrexate conjugates on the proliferation and ultrastructure of HSC-2 cells
Zhang Wanqing Mao Tianqiu Wu Junzheng et al.
(Stomatological Hospital,Fourth Military Medical University,Xi'an 710032)
Abstract：Objective：To investigate the effects of magnetic methotrexate conjugates(FM-MTX) on the multiplication and ultrastructure of human oral floor carcinoma HSC-2 cells .Methods:HSC-2 cells were treated with 100 μg/L of FM-MTX, the growth curves were measured by MTT methods. The cells were harvested at 1, 4, 24, 48 and 72 h respectively, and then observed under transmission electron microscope(TEM). Results:The growth of HSC-2 cells decreased remarkably in FM-MTX treated groups. Increase of mitochondria and lysosomes in the cytoplasma were observed in the early time after treatment. 4 h later the ferromagnetic microspheres were found in the lysosomes. 48 h later, parts of lysosome membrane dissolved and magnetic microspheres exocytosis were found.Conclusion:FM-MTX can inhibit the growth of HSC-2 cells and induce the destructure of HSC-2 cells.
, 百拇医药
Key words：Ultrastructure; Carcinoma; Mouth floor, Sustained release preparation drug;Methotrexate.
磁导向甲氨蝶呤缓释药物(简称FM-MTX)是通过化学交联制得的磁性甲氨蝶呤白蛋白缓释针剂〔1〕。它具有明显的抗肿瘤作用，能抑制舌癌Tca8113细胞从G1期进入S期，使S期进展延缓，从而导致G1期比例增加，并出现细胞凋亡〔2〕。体内治疗，通过外加磁场的靶向定位，对裸鼠移植瘤有明显的抑制作用〔3〕。本实验通过药物作用不同时间细胞电镜切片，观察FM-MTX对人口底癌HSC-2细胞生长及细胞超微结构的影响。
1 材料与方法
1.1 细胞系及细胞培养
, 百拇医药
人口底鳞癌细胞系HSC-2，由第四军医大学口腔医学院细胞生物教研室提供。在37 ℃ φ(CO2)=5%及饱和湿度条件下，含体积分数φ=15%的小牛血清的RPMI1640(GIBCO)培养液中培养。
1.2 药物
磁导向甲氨蝶呤缓释药物FM-MTX，是通过化学交联法制得〔1〕。分装后备用，用完全培养液稀释。
1.3 FM-MTX对HSC-2细胞系细胞增殖的影响
取生长旺盛的HSC-2口底癌细胞接种于96孔板，同时种6块板，培养24 h后，加药FM-MTX及游离MTX，并设立加外磁场(M+)和不加外磁场(M-)对照及空白对照组。药物质量浓度为100 μg/L，每组设立4个平行孔。分别在加药后第1，2，3，4，5，6 d各取一块培养板加入MTT PBS 溶液，采用MTT法检测各孔光吸收值A490。以时间为横座标，以相对光吸收值A490为枞座标，分别绘出4种细胞在FM-MTX 及MTX两种药物作用下的生长曲线。方法见文献〔4〕。
, 百拇医药
1.4 FM-MTX进入瘤细胞后超微结构观察
HSC-2口底癌细胞传至中号培养瓶6瓶，培养24 h后，取5瓶，每瓶加入FM-MTX100 μg/L，继续培养，分别于1、4、24、48、72 h收获细胞，透射电镜观察FM-MTX药物颗粒进入瘤细胞的内在化过程。
2 结 果
2.1 FM-MTX对人口底癌HSC-2细胞增殖的影响
MTX法每天检测FM-MTX及游离MTX在加外磁场(M+)、不加外磁场(M-)持续作用1～6 d时，人口底癌HSC-2细胞的增殖状况如图1所示。从图中可以看出，从第3 d起FM-MTX及MTX已表现出明显的细胞抑制作用，随着时间增加，抑制作用加强。
2.2 透射电镜观察
, 百拇医药
对照组HSC-2细胞连接紧密，桥粒、半桥粒结构较多。加入FM-MTX药物组，1 h后，透射电镜下可见瘤细胞内溶酶体大量增生，胞浆内分泌小泡较多。溶酶体内尚未见到FM颗粒的沉积(图2)。多数细胞核呈椭圆形，部分核出现较规则的肾形。药物处理4 h后可见溶酶体内有吞噬的FM超微磁粒；瘤细胞胞浆线粒体肿胀、增多，内质网扩张，胞浆糖原颗粒增多。(图3)。24 h则见溶酶体明显增大，FM颗粒增多(图5)。48 h溶酶体膜裂解，胞浆内可见磁微粒(图6)。线粒体肿胀明显，内摄磁性颗粒。线粒体膜裂解，内质网断裂(图4)。72 h后磁微粒释放于胞浆外(图7)。细胞连接稀松，桥粒、半桥粒结构少见。细胞体积缩小。
图1 FM-MTX及MTX在加外磁场(M+)和不加外磁场(M-)作用下对HSC-2细胞生长增殖的影响
, 百拇医药
图2 HSC-2细胞溶酶体大量增生，胞浆内分泌小泡较多。(TEM×12K)
图3 胞浆线粒体肿胀、增多，内质网扩张，胞浆糖原颗粒增多。(TEM×10K)
图4 线粒体肿胀明显，内摄磁性颗粒。线粒体膜裂解，内质网断裂。(TEM×10K)
图5 胞浆溶酶体内摄取大量磁性颗粒。(TEM×30K)
图6 胞浆溶酶体膜裂解，磁微粒释放于胞浆中。(TEM×40K)
, 百拇医药
图7 细胞外可见磁微粒。(TEM×20K)
3 讨 论
癌细胞的一个重要特征是不断增殖。对癌细胞增殖的抑制效果是鉴定癌细胞诱导分化的一个重要指标。本实验观察到磁导向甲氨蝶呤缓释药物FM-MTX100 μg/L对人口底癌HSC-2细胞生长有明显的抑制作用。药物作用48 h后瘤细胞生长明显抑制，并随着药物作用时间延长，对细胞生长的抑制作用增强。
超微结构观察到，HSC-2细胞经100 μg/L的FM-MTX药物处理后，多数细胞核呈椭圆形，部分核出现较规则的肾形，这说明100 μg/L的FM-MTX可使HSC-2细胞向单核细胞系分化〔5〕。药物作用后胞浆线粒体肿胀，缺嵴，内质网扩张、断裂，细胞连接结构减少，胞浆分泌小泡减少。说明100 μg/L的FM-MTX即可降低HSC-2细胞的分泌能力。Song等在对内质网进行系统研究发现，内质网为合成分泌性蛋白质和酶类的主要细胞器，与细胞的侵袭力密切相关〔6〕。我们观察到瘤细胞的内质网扩张、断裂、推断药物作用可减小细胞的侵袭能力。
, 百拇医药
我们通过药物作用后不同时间点的超微结构观察，明确了胞浆溶酶体为磁性微粒的摄取和代谢靶。药物作用1 h溶酶体大量增生；4 h后可见溶酶体内有吞噬的FM超微磁粒；24 h则见溶酶体明显增大，吞噬的FM颗粒增多；48 h溶酶体膜裂解，胞浆内可见磁微粒；72 h后磁微粒释放于胞浆外。其具体作用机理仍需进一步研究。
基金项目：国家自然科学基金资助项目 39070871
国家新药基金资助项目 93-(62)-N-42
参考文献：
[1]张皖清,毛天球,孙玉鹏,等.磁导向甲氨蝶呤缓释药物的研制及含量测定.实用口腔医学杂志，2000，16(1)：61
[2]张皖清,毛天球,吴军正,等.磁导向甲氨蝶呤缓释药物杀伤舌癌细胞的内在化过程.实用口腔医学杂，2000,16(1):58
, 百拇医药
[3]张皖清,马定祥,毛天球,等.磁微粒负载甲氨蝶呤对舌癌移植瘤的靶向治疗实验研究.实用口腔医学杂志,1990,6:147
[4]Wu JZ,Situ ZO,Wang W,et al.Chemosensitivity of salivary gland and oral cancer cell lines.Chin Med J,1992,105:1026
[5]Gonda MN.Ultrastructural studies of surface features of human normal and tumur cells in tissue cultrure by scanning and transmission electrom microscopy.J Natl Cancer Institute,1976,56:245
[6]Song J,Lee C,Lin CH,et al.Electrom microscopic studies of the endoplasmic reticulum in whole mount cultures cells fixed with potassium permangenate.J Struct Biol,1991,107:106
收稿日期：1998-08-24
修改日期：1999-11-01, http://www.100md.com
单位：张皖清(第四军医大学口腔医学院，710032；现在304医院工作)；毛天球(第四军医大学口腔医学院，710032)；吴军正(第四军医大学口腔医学院，710032)；李焰(第四军医大学口腔医学院，710032)
关键词：甲氨蝶呤；缓释制剂；口底；癌；超微结构
实用口腔医学杂志000123 摘 要：目的：探讨磁导向甲氨蝶呤缓释药物(FM-MTX)对人口底癌HSC-2细胞生长及细胞超微结构的影响。方法：对照组为不加药物处理组，实验组加入剂量为100 μg/L的FM-MTX药物处理，采用MTT法观察HSC-2细胞的生长曲线，并分别于不同时间(1,4,24,48,72 h)收获细胞，透射电镜观察各时间点细胞的超微结构变化。结果：FM-MTX药物处理后，口底癌HSC-2细胞生长明显受到抑制；透射电镜观察到药物作用早期，瘤细胞溶酶体大量增生，4 h后瘤细胞胞浆溶酶体开始吞噬磁性微粒，48 h溶酶体膜开始裂解，颗粒释放到胞浆内。72 h后溶解、液化，溶酶体膜消失，呈现胞浆空泡结构。线粒体和内质网肿胀、缺嵴、断裂。结论：甲氨蝶呤缓释药物能诱导口底癌HSC-2细胞死亡，对其有明显的杀伤作用。其作用机制尚需进一步研究。
, 百拇医药
分类号：R739.8 文献标识码：A
文章编号：1001-3733(2000)01-0071-03
Effects of magnetic methotrexate conjugates on the proliferation and ultrastructure of HSC-2 cells
Zhang Wanqing Mao Tianqiu Wu Junzheng et al.
(Stomatological Hospital,Fourth Military Medical University,Xi'an 710032)
Abstract：Objective：To investigate the effects of magnetic methotrexate conjugates(FM-MTX) on the multiplication and ultrastructure of human oral floor carcinoma HSC-2 cells .Methods:HSC-2 cells were treated with 100 μg/L of FM-MTX, the growth curves were measured by MTT methods. The cells were harvested at 1, 4, 24, 48 and 72 h respectively, and then observed under transmission electron microscope(TEM). Results:The growth of HSC-2 cells decreased remarkably in FM-MTX treated groups. Increase of mitochondria and lysosomes in the cytoplasma were observed in the early time after treatment. 4 h later the ferromagnetic microspheres were found in the lysosomes. 48 h later, parts of lysosome membrane dissolved and magnetic microspheres exocytosis were found.Conclusion:FM-MTX can inhibit the growth of HSC-2 cells and induce the destructure of HSC-2 cells.
, 百拇医药
Key words：Ultrastructure; Carcinoma; Mouth floor, Sustained release preparation drug;Methotrexate.
磁导向甲氨蝶呤缓释药物(简称FM-MTX)是通过化学交联制得的磁性甲氨蝶呤白蛋白缓释针剂〔1〕。它具有明显的抗肿瘤作用，能抑制舌癌Tca8113细胞从G1期进入S期，使S期进展延缓，从而导致G1期比例增加，并出现细胞凋亡〔2〕。体内治疗，通过外加磁场的靶向定位，对裸鼠移植瘤有明显的抑制作用〔3〕。本实验通过药物作用不同时间细胞电镜切片，观察FM-MTX对人口底癌HSC-2细胞生长及细胞超微结构的影响。
1 材料与方法
1.1 细胞系及细胞培养
, 百拇医药
人口底鳞癌细胞系HSC-2，由第四军医大学口腔医学院细胞生物教研室提供。在37 ℃ φ(CO2)=5%及饱和湿度条件下，含体积分数φ=15%的小牛血清的RPMI1640(GIBCO)培养液中培养。
1.2 药物
磁导向甲氨蝶呤缓释药物FM-MTX，是通过化学交联法制得〔1〕。分装后备用，用完全培养液稀释。
1.3 FM-MTX对HSC-2细胞系细胞增殖的影响
取生长旺盛的HSC-2口底癌细胞接种于96孔板，同时种6块板，培养24 h后，加药FM-MTX及游离MTX，并设立加外磁场(M+)和不加外磁场(M-)对照及空白对照组。药物质量浓度为100 μg/L，每组设立4个平行孔。分别在加药后第1，2，3，4，5，6 d各取一块培养板加入MTT PBS 溶液，采用MTT法检测各孔光吸收值A490。以时间为横座标，以相对光吸收值A490为枞座标，分别绘出4种细胞在FM-MTX 及MTX两种药物作用下的生长曲线。方法见文献〔4〕。
, 百拇医药
1.4 FM-MTX进入瘤细胞后超微结构观察
HSC-2口底癌细胞传至中号培养瓶6瓶，培养24 h后，取5瓶，每瓶加入FM-MTX100 μg/L，继续培养，分别于1、4、24、48、72 h收获细胞，透射电镜观察FM-MTX药物颗粒进入瘤细胞的内在化过程。
2 结 果
2.1 FM-MTX对人口底癌HSC-2细胞增殖的影响
MTX法每天检测FM-MTX及游离MTX在加外磁场(M+)、不加外磁场(M-)持续作用1～6 d时，人口底癌HSC-2细胞的增殖状况如图1所示。从图中可以看出，从第3 d起FM-MTX及MTX已表现出明显的细胞抑制作用，随着时间增加，抑制作用加强。
2.2 透射电镜观察
, 百拇医药
对照组HSC-2细胞连接紧密，桥粒、半桥粒结构较多。加入FM-MTX药物组，1 h后，透射电镜下可见瘤细胞内溶酶体大量增生，胞浆内分泌小泡较多。溶酶体内尚未见到FM颗粒的沉积(图2)。多数细胞核呈椭圆形，部分核出现较规则的肾形。药物处理4 h后可见溶酶体内有吞噬的FM超微磁粒；瘤细胞胞浆线粒体肿胀、增多，内质网扩张，胞浆糖原颗粒增多。(图3)。24 h则见溶酶体明显增大，FM颗粒增多(图5)。48 h溶酶体膜裂解，胞浆内可见磁微粒(图6)。线粒体肿胀明显，内摄磁性颗粒。线粒体膜裂解，内质网断裂(图4)。72 h后磁微粒释放于胞浆外(图7)。细胞连接稀松，桥粒、半桥粒结构少见。细胞体积缩小。
图1 FM-MTX及MTX在加外磁场(M+)和不加外磁场(M-)作用下对HSC-2细胞生长增殖的影响
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图2 HSC-2细胞溶酶体大量增生，胞浆内分泌小泡较多。(TEM×12K)
图3 胞浆线粒体肿胀、增多，内质网扩张，胞浆糖原颗粒增多。(TEM×10K)
图4 线粒体肿胀明显，内摄磁性颗粒。线粒体膜裂解，内质网断裂。(TEM×10K)
图5 胞浆溶酶体内摄取大量磁性颗粒。(TEM×30K)
图6 胞浆溶酶体膜裂解，磁微粒释放于胞浆中。(TEM×40K)
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图7 细胞外可见磁微粒。(TEM×20K)
3 讨 论
癌细胞的一个重要特征是不断增殖。对癌细胞增殖的抑制效果是鉴定癌细胞诱导分化的一个重要指标。本实验观察到磁导向甲氨蝶呤缓释药物FM-MTX100 μg/L对人口底癌HSC-2细胞生长有明显的抑制作用。药物作用48 h后瘤细胞生长明显抑制，并随着药物作用时间延长，对细胞生长的抑制作用增强。
超微结构观察到，HSC-2细胞经100 μg/L的FM-MTX药物处理后，多数细胞核呈椭圆形，部分核出现较规则的肾形，这说明100 μg/L的FM-MTX可使HSC-2细胞向单核细胞系分化〔5〕。药物作用后胞浆线粒体肿胀，缺嵴，内质网扩张、断裂，细胞连接结构减少，胞浆分泌小泡减少。说明100 μg/L的FM-MTX即可降低HSC-2细胞的分泌能力。Song等在对内质网进行系统研究发现，内质网为合成分泌性蛋白质和酶类的主要细胞器，与细胞的侵袭力密切相关〔6〕。我们观察到瘤细胞的内质网扩张、断裂、推断药物作用可减小细胞的侵袭能力。
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我们通过药物作用后不同时间点的超微结构观察，明确了胞浆溶酶体为磁性微粒的摄取和代谢靶。药物作用1 h溶酶体大量增生；4 h后可见溶酶体内有吞噬的FM超微磁粒；24 h则见溶酶体明显增大，吞噬的FM颗粒增多；48 h溶酶体膜裂解，胞浆内可见磁微粒；72 h后磁微粒释放于胞浆外。其具体作用机理仍需进一步研究。
基金项目：国家自然科学基金资助项目 39070871
国家新药基金资助项目 93-(62)-N-42
参考文献：
[1]张皖清,毛天球,孙玉鹏,等.磁导向甲氨蝶呤缓释药物的研制及含量测定.实用口腔医学杂志，2000，16(1)：61
[2]张皖清,毛天球,吴军正,等.磁导向甲氨蝶呤缓释药物杀伤舌癌细胞的内在化过程.实用口腔医学杂，2000,16(1):58
, 百拇医药
[3]张皖清,马定祥,毛天球,等.磁微粒负载甲氨蝶呤对舌癌移植瘤的靶向治疗实验研究.实用口腔医学杂志,1990,6:147
[4]Wu JZ,Situ ZO,Wang W,et al.Chemosensitivity of salivary gland and oral cancer cell lines.Chin Med J,1992,105:1026
[5]Gonda MN.Ultrastructural studies of surface features of human normal and tumur cells in tissue cultrure by scanning and transmission electrom microscopy.J Natl Cancer Institute,1976,56:245
[6]Song J,Lee C,Lin CH,et al.Electrom microscopic studies of the endoplasmic reticulum in whole mount cultures cells fixed with potassium permangenate.J Struct Biol,1991,107:106
收稿日期：1998-08-24
修改日期：1999-11-01, http://www.100md.com