不同培养条件对骨骼肌细胞增殖及分化的影响
作者：秦瑞峰 顾晓明 张浩
单位：秦瑞峰(西安第四军医大学口腔医学院颌面外科)；顾晓明(西安第四军医大学口腔医学院颌面外科)；张浩(第四军医大学生物化学教研室，710032)
关键词：骨骼肌；肌细胞；分化
实用口腔医学杂志000105
摘 要：目的：研究不同培养条件对骨骼肌细胞增殖及分化的影响。方法：以体外培养小鼠肌母细胞C2 C12为研究模型，对照组用含φ=10%胎牛血清液培养，实验组培养基改变为φ=2%胎牛血清的DMEM液，分别于更换培养液后24、48、72 h，观察细胞形态变化。结果：对照组细胞形态实验前后无变化，实验组24、48 h时部分细胞出现死亡，72 h存活细胞开始融合，肌管形成。结论：胎牛血清含量为φ=2%的DMEM液有促进肌母细胞分化，从而进一步形成肌管的作用；含φ=10%的DMEM不能使之分化，提示不同血清含量的DMEM培养基对体外培养的骨骼肌细胞的增殖和分化有重要影响。
, 百拇医药
分类号：R337.1 R329.2+8 文献标识码：A
文章编码：1001-3733(2000)01-0014-03
The affection of fetal bovine serum concerntration on the proliferation and differentiation of skeletal muscle cells in vitro
Qin Ruifeng Gu Xiaoming Zhang Hao.
(Department of Oral and Maxillofacial Surgery, Stomatological College, Fourth Military Medical University, Xi'an 710032)
, 百拇医药
Abstract：Objective：To investigate the effects of different concerntration of fetal bovine serum(FBS) on the proliferation and differentiation of skeletal muscle cells. Methods: Murine C2C12 myoblasts were used in this experiment, the cells of control group were maintained in Dulbeccco's modified eagle's medium(DMEM)supplemented with 10% FBS,those of experimental groups were in DMEM with 2% FBS .Morphology of the cells was observed with phase contrast photomicroscopy 24, 48 and 72 hours after set-up of the cultures. Results: No morphological changes wave observed in the control group; floating cells were observed in the 24 and 48 hour cultures, and multinucleated myotubes were observed in the 72 hour cultures in the experimental group. Conclusion: DMEM supplemented with 2% FBS can induce differentiation of myocytes and formation of multinucleated myotubes in vitro.
, 百拇医药
Keywords：Skeletal muscles; Myocyte; Differentiation▲
生物体都能对外界信号发生反应，其中很多是以含量的变化这一形式传给细胞，如激素、生长因子、神经调节因子及其它分子。肌肉细胞的发育成熟和分化等各个阶段也均受到各种因子网络调节的影响，需要很多营养成分。一般认为已经发育成熟的肌肉不具有再生能力，肌卫星细胞发现以来，随着对其研究的不断深入，人们逐渐认识φ=10%的DMEM不能使之分化，提示不同血清含量的DMEM培养基对体外培养的骨骼肌细胞的增殖和分化有重要影响。
1 材料与方法
1.1 细胞培养
C2C12细胞(Proton教授惠赠)，2.5g/L胰蛋白酶消化,吸管吹打,制成细胞悬液,以细胞数1× 109/L密度接种于培养瓶 或35mm直径培养皿内,分别用含体积分数(φ)10%或2%胎牛血清的DMEM培养(部分皿内有盖玻片,为染色用)随后置于孵育臬培养(φ=CO2), 至对数生长期进行实验。
, 百拇医药
1.2 实验分组
取培养至对数生长期细胞的培养瓶随机分为对照级和实验组。对照组含φ=10%胎牛血清DMEM液，实验组培养基忙乱变为φ=2%胎牛清DMEM液，分别于更换培养液后24、48、72h用倒置显微镜观察细胞的形态变化、照相。两组实验平行进行。
1.3 台盼兰排斥实验
制备单细胞悬液，稀释至细胞数1×10/L，取9滴细胞悬液移入小试管中，加1滴5g/L台盼兰溶液，浸染3min，在倒置显微镜下分别计数500个相邻的活细胞和死细胞。根据公式：活细胞率=
活细胞总数＝
计算细胞活力，每组均重复计数5次。
1.4 统计处理
, 百拇医药
按Student t检验。
2 结果
2.1 图1示实验组和对照组的C2C12细胞形态上出现明显差异。对照组中骨骼肌肌母细胞继续增殖，形态为长梭形，星形，细胞核位于中央，大小均一，实验前后形态无改变，数量明显增加。实验组在含φ=2%胚胎牛血清的DMEM培养基培养24 h后，镜下见有的细胞变圆皱缩，出现中毒颗粒，部分细胞开始出现凋亡或死亡，存活细胞相互连接成网，细胞形态未见明显变化，至72 h后存活肌母细胞形态发生明显改变，细胞开始融合，出现多核肌管。肌管体积为单个肌母细胞3～5倍，核有3～9个不等，最多可达15个。肌管之间相互连接成长条，形成网状。φ=2%的培养基培养至1月后出现了肌肉短暂的收缩现象。
, 百拇医药
图1 C2 C12细胞在φ=10%血清DMEM培养(A)在φ=2%血清DMEM培养24 h(B)、48 h(C)、72 h(D) 时光镜图像(×100)
2.2 台盼蓝染色显示，对照组在继续培养24、48、72 h后，活细胞率各数值之间统计差别都不明显。而实验组在培养24、48 h活细胞与同时期的对照组相比，差别非常显著(P<0.01)，其中48 h 时细胞活力最差，细胞死亡在48 h内达到高峰(约20%～30%)。以后细胞死亡逐渐减少，72 h时活细胞率无明显差别(表1)。
表1 血清含量对骨骼肌细胞活力的影响 (
±s)%
继续培养时间(h)
24
, 百拇医药 48
72
对照组
98.23±0.37
97.28±0.57
97.12±0.21
实验组
88.66±1.56①
76.53±2.97①
97.18±0.68
n=5同时期两组比较 ①P<0.01
, 百拇医药 3 讨 论
C2 C12小鼠肌母细胞在φ=10%胎牛血清DMEM培养液中不断增殖，表现在数量增加，而细胞的形态不发生改变。培养条件的改变，即将DMEM培养液中血清含量由10%减少至2%，细胞变化非常显著。表现在数量上：24 h后部分细胞出现凋亡或死亡(凋亡的检测另有文章阐述)，活细胞率下降；形态上：约70%～80%的鼠肌母细胞开始出现分化现象，肌母细胞离开初始的细胞周期，而进入细胞分化阶段，细胞开始融合，形成多核肌管。实验组24 h和48 h时与对照组活细胞比率差异明显，可见外部培养条件改变，鼠肌母细胞经历了一系列变化，刺激肌母细胞特异性基因开放，表达特异性蛋白，而这一过程尤以环境改变后的24 h和48 h为显著，72 h后细胞逐渐生长趋于稳定，这种过程是不可逆的。
肌肉的再生是重要的研究课题。以往观念认为骨骼肌损伤后几乎不能再生，其后研究肌卫星细胞对于损伤后修复起重要作用，能够激活、分化、形成肌管。损伤后的肌细胞是否依赖于损伤部位周围环境中能促进其再生的化学物质，如各种营养因子、激素等的变化，从而调节肌细胞的再生与分化，一直是许多学者研究的热点〔4〕。最近研究发现肌肉的再生和分化是由各种肌肉转录因子调节的，肌肉转录因子包括MyoD、myogenin、Myf4、Myf5等〔5〕。Koishi〔6〕发现在正常胚胎发育体轴下，肌肉系统形成时MyoD升高,MyoD蛋白与特殊的功能有关，卫星细胞在新生和再生肌肉中包含高水平MyoD蛋白，卫星细胞融合成肌管后MyoD免疫活性快速消失。Fuchbauer〔7〕发现MyoD在鼠肌肉生成细胞中表达，能够刺激鼠单核肌母细胞分化成多核肌管。 肌母细胞开始分化时，在MyoD和Myf5有正常表达的鼠肌母细胞中，去除了 myogenin基因不能使肌母细胞分化形成肌纤维，说明myogenin在基因通路中位于MyoD和Myf5下游，并在刺激肌细胞分化中有重要作用〔8～10〕。
, 百拇医药
我们以C2 C12小鼠肌母细胞为模型研究不同含量胎牛血清的DMEM培养基对肌母细胞的营养作用结果表明：φ=2%胎牛血清的DMEM培养下，肌母细胞就可获得再生和进一步分化的能力，这有着怎样的生理意义仍有许多的工作要做。血清含量的降低使得一部分细胞凋亡或死亡，另一部分向更高级肌管分化，其机理可能是：①胎牛血清中含有丝裂原，丝裂原能促进肌母细胞增殖，高丝裂原浓度时肌细胞分化特异性基因受到抑制，细胞处于增殖状态；血清含量降低时丝裂原浓度下降，使抑制解除，肌母细胞开始分化；②外部营养条件的下降，肌母细胞离开增殖周期，向更高级分化，也可能是生物节能以适应环境的一种体现。究竟哪一种物质的减小促进了肌细胞的分化，这些物质在肌肉再生中的作用机理仍有待进一步的研究。控制肌母细胞的分化为体外研究肌细胞分化中各种细胞因子作用的阶段提供了一个较好的实验模型，为更深入地探索肌细胞分化的机理打下了基础。
基金项目：本课题为国家自然科学基金资助，编号 39770803
参考文献：
, http://www.100md.com
[1]Mauro A.Satellite cells of skeletal muscle fibre. J Biophys Biochem Cyto,1996,9:493
[2]Allen RE, Rankin LL. Regulation of satellite cells during skeletal muscle growth and development. Pro Soc Exp Biol Med,1990,194(2):81
[3]Tuner DC. Differentiation in cultures derived from embryonic chicken muscle: The postmitotic fusion capable myoblast as a distinct cell type. Differentiation, 1978,10:81
, 百拇医药 [4]Schmal BH, Hellhammer V.The number of nuclei in adult rat muscles with special reference to satellite cell. Anat Rec,1997,189:169
[5]Ludolhn DC, Konieczny SF.Transcription factor families:Muscling in on the myogenic program.FASEB J, 1995,9:1595
[6]Koishi K,Zhang M, Mclennan IS,et al.MyoD protein accumulates in satellite cells and is neurally regulated in regenerating myotubes and skeletal muscle fibers.Dev Dyn,1995,202(3):244
, 百拇医药
[7]Fuchtbauer EM, Westphal H. MyoD and myogenin are coexpressed in regenerationg skeletal muscle of the mouse. Dev Dyn, 1992,193:34
[8]Hasty P,Bradley A,Morris JH ,et al.Muscle deficiency and neonatal death in mice with a targeted mutation in the myogenin gene. Nature,1993,364:501
[9]Rudnicki MA,Schnegelsberg PNJ,Stead RH,et al.MyoD or Myf-5 is required for the formation of skeletal muscle.Cell,1993,75:1351
[10]Epstein JA,Lam P,Jepeal L, et al.Pax3 inhabits myogenic differentiation of cultured myoblast cells.J Biochem,1995,270:11719
收稿日期：1998-12-20
修改日期：1999-04-28, 百拇医药
单位：秦瑞峰(西安第四军医大学口腔医学院颌面外科)；顾晓明(西安第四军医大学口腔医学院颌面外科)；张浩(第四军医大学生物化学教研室，710032)
关键词：骨骼肌；肌细胞；分化
实用口腔医学杂志000105
摘 要：目的：研究不同培养条件对骨骼肌细胞增殖及分化的影响。方法：以体外培养小鼠肌母细胞C2 C12为研究模型，对照组用含φ=10%胎牛血清液培养，实验组培养基改变为φ=2%胎牛血清的DMEM液，分别于更换培养液后24、48、72 h，观察细胞形态变化。结果：对照组细胞形态实验前后无变化，实验组24、48 h时部分细胞出现死亡，72 h存活细胞开始融合，肌管形成。结论：胎牛血清含量为φ=2%的DMEM液有促进肌母细胞分化，从而进一步形成肌管的作用；含φ=10%的DMEM不能使之分化，提示不同血清含量的DMEM培养基对体外培养的骨骼肌细胞的增殖和分化有重要影响。
, 百拇医药
分类号：R337.1 R329.2+8 文献标识码：A
文章编码：1001-3733(2000)01-0014-03
The affection of fetal bovine serum concerntration on the proliferation and differentiation of skeletal muscle cells in vitro
Qin Ruifeng Gu Xiaoming Zhang Hao.
(Department of Oral and Maxillofacial Surgery, Stomatological College, Fourth Military Medical University, Xi'an 710032)
, 百拇医药
Abstract：Objective：To investigate the effects of different concerntration of fetal bovine serum(FBS) on the proliferation and differentiation of skeletal muscle cells. Methods: Murine C2C12 myoblasts were used in this experiment, the cells of control group were maintained in Dulbeccco's modified eagle's medium(DMEM)supplemented with 10% FBS,those of experimental groups were in DMEM with 2% FBS .Morphology of the cells was observed with phase contrast photomicroscopy 24, 48 and 72 hours after set-up of the cultures. Results: No morphological changes wave observed in the control group; floating cells were observed in the 24 and 48 hour cultures, and multinucleated myotubes were observed in the 72 hour cultures in the experimental group. Conclusion: DMEM supplemented with 2% FBS can induce differentiation of myocytes and formation of multinucleated myotubes in vitro.
, 百拇医药
Keywords：Skeletal muscles; Myocyte; Differentiation▲
生物体都能对外界信号发生反应，其中很多是以含量的变化这一形式传给细胞，如激素、生长因子、神经调节因子及其它分子。肌肉细胞的发育成熟和分化等各个阶段也均受到各种因子网络调节的影响，需要很多营养成分。一般认为已经发育成熟的肌肉不具有再生能力，肌卫星细胞发现以来，随着对其研究的不断深入，人们逐渐认识φ=10%的DMEM不能使之分化，提示不同血清含量的DMEM培养基对体外培养的骨骼肌细胞的增殖和分化有重要影响。
1 材料与方法
1.1 细胞培养
C2C12细胞(Proton教授惠赠)，2.5g/L胰蛋白酶消化,吸管吹打,制成细胞悬液,以细胞数1× 109/L密度接种于培养瓶 或35mm直径培养皿内,分别用含体积分数(φ)10%或2%胎牛血清的DMEM培养(部分皿内有盖玻片,为染色用)随后置于孵育臬培养(φ=CO2), 至对数生长期进行实验。
, 百拇医药
1.2 实验分组
取培养至对数生长期细胞的培养瓶随机分为对照级和实验组。对照组含φ=10%胎牛血清DMEM液，实验组培养基忙乱变为φ=2%胎牛清DMEM液，分别于更换培养液后24、48、72h用倒置显微镜观察细胞的形态变化、照相。两组实验平行进行。
1.3 台盼兰排斥实验
制备单细胞悬液，稀释至细胞数1×10/L，取9滴细胞悬液移入小试管中，加1滴5g/L台盼兰溶液，浸染3min，在倒置显微镜下分别计数500个相邻的活细胞和死细胞。根据公式：活细胞率=
活细胞总数＝
计算细胞活力，每组均重复计数5次。1.4 统计处理
, 百拇医药
按Student t检验。
2 结果
2.1 图1示实验组和对照组的C2C12细胞形态上出现明显差异。对照组中骨骼肌肌母细胞继续增殖，形态为长梭形，星形，细胞核位于中央，大小均一，实验前后形态无改变，数量明显增加。实验组在含φ=2%胚胎牛血清的DMEM培养基培养24 h后，镜下见有的细胞变圆皱缩，出现中毒颗粒，部分细胞开始出现凋亡或死亡，存活细胞相互连接成网，细胞形态未见明显变化，至72 h后存活肌母细胞形态发生明显改变，细胞开始融合，出现多核肌管。肌管体积为单个肌母细胞3～5倍，核有3～9个不等，最多可达15个。肌管之间相互连接成长条，形成网状。φ=2%的培养基培养至1月后出现了肌肉短暂的收缩现象。
, 百拇医药
图1 C2 C12细胞在φ=10%血清DMEM培养(A)在φ=2%血清DMEM培养24 h(B)、48 h(C)、72 h(D) 时光镜图像(×100)
2.2 台盼蓝染色显示，对照组在继续培养24、48、72 h后，活细胞率各数值之间统计差别都不明显。而实验组在培养24、48 h活细胞与同时期的对照组相比，差别非常显著(P<0.01)，其中48 h 时细胞活力最差，细胞死亡在48 h内达到高峰(约20%～30%)。以后细胞死亡逐渐减少，72 h时活细胞率无明显差别(表1)。
表1 血清含量对骨骼肌细胞活力的影响 (
±s)%继续培养时间(h)
24
, 百拇医药 48
72
对照组
98.23±0.37
97.28±0.57
97.12±0.21
实验组
88.66±1.56①
76.53±2.97①
97.18±0.68
n=5同时期两组比较 ①P<0.01
, 百拇医药 3 讨 论
C2 C12小鼠肌母细胞在φ=10%胎牛血清DMEM培养液中不断增殖，表现在数量增加，而细胞的形态不发生改变。培养条件的改变，即将DMEM培养液中血清含量由10%减少至2%，细胞变化非常显著。表现在数量上：24 h后部分细胞出现凋亡或死亡(凋亡的检测另有文章阐述)，活细胞率下降；形态上：约70%～80%的鼠肌母细胞开始出现分化现象，肌母细胞离开初始的细胞周期，而进入细胞分化阶段，细胞开始融合，形成多核肌管。实验组24 h和48 h时与对照组活细胞比率差异明显，可见外部培养条件改变，鼠肌母细胞经历了一系列变化，刺激肌母细胞特异性基因开放，表达特异性蛋白，而这一过程尤以环境改变后的24 h和48 h为显著，72 h后细胞逐渐生长趋于稳定，这种过程是不可逆的。
肌肉的再生是重要的研究课题。以往观念认为骨骼肌损伤后几乎不能再生，其后研究肌卫星细胞对于损伤后修复起重要作用，能够激活、分化、形成肌管。损伤后的肌细胞是否依赖于损伤部位周围环境中能促进其再生的化学物质，如各种营养因子、激素等的变化，从而调节肌细胞的再生与分化，一直是许多学者研究的热点〔4〕。最近研究发现肌肉的再生和分化是由各种肌肉转录因子调节的，肌肉转录因子包括MyoD、myogenin、Myf4、Myf5等〔5〕。Koishi〔6〕发现在正常胚胎发育体轴下，肌肉系统形成时MyoD升高,MyoD蛋白与特殊的功能有关，卫星细胞在新生和再生肌肉中包含高水平MyoD蛋白，卫星细胞融合成肌管后MyoD免疫活性快速消失。Fuchbauer〔7〕发现MyoD在鼠肌肉生成细胞中表达，能够刺激鼠单核肌母细胞分化成多核肌管。 肌母细胞开始分化时，在MyoD和Myf5有正常表达的鼠肌母细胞中，去除了 myogenin基因不能使肌母细胞分化形成肌纤维，说明myogenin在基因通路中位于MyoD和Myf5下游，并在刺激肌细胞分化中有重要作用〔8～10〕。
, 百拇医药
我们以C2 C12小鼠肌母细胞为模型研究不同含量胎牛血清的DMEM培养基对肌母细胞的营养作用结果表明：φ=2%胎牛血清的DMEM培养下，肌母细胞就可获得再生和进一步分化的能力，这有着怎样的生理意义仍有许多的工作要做。血清含量的降低使得一部分细胞凋亡或死亡，另一部分向更高级肌管分化，其机理可能是：①胎牛血清中含有丝裂原，丝裂原能促进肌母细胞增殖，高丝裂原浓度时肌细胞分化特异性基因受到抑制，细胞处于增殖状态；血清含量降低时丝裂原浓度下降，使抑制解除，肌母细胞开始分化；②外部营养条件的下降，肌母细胞离开增殖周期，向更高级分化，也可能是生物节能以适应环境的一种体现。究竟哪一种物质的减小促进了肌细胞的分化，这些物质在肌肉再生中的作用机理仍有待进一步的研究。控制肌母细胞的分化为体外研究肌细胞分化中各种细胞因子作用的阶段提供了一个较好的实验模型，为更深入地探索肌细胞分化的机理打下了基础。
基金项目：本课题为国家自然科学基金资助，编号 39770803
参考文献：
, http://www.100md.com
[1]Mauro A.Satellite cells of skeletal muscle fibre. J Biophys Biochem Cyto,1996,9:493
[2]Allen RE, Rankin LL. Regulation of satellite cells during skeletal muscle growth and development. Pro Soc Exp Biol Med,1990,194(2):81
[3]Tuner DC. Differentiation in cultures derived from embryonic chicken muscle: The postmitotic fusion capable myoblast as a distinct cell type. Differentiation, 1978,10:81
, 百拇医药 [4]Schmal BH, Hellhammer V.The number of nuclei in adult rat muscles with special reference to satellite cell. Anat Rec,1997,189:169
[5]Ludolhn DC, Konieczny SF.Transcription factor families:Muscling in on the myogenic program.FASEB J, 1995,9:1595
[6]Koishi K,Zhang M, Mclennan IS,et al.MyoD protein accumulates in satellite cells and is neurally regulated in regenerating myotubes and skeletal muscle fibers.Dev Dyn,1995,202(3):244
, 百拇医药
[7]Fuchtbauer EM, Westphal H. MyoD and myogenin are coexpressed in regenerationg skeletal muscle of the mouse. Dev Dyn, 1992,193:34
[8]Hasty P,Bradley A,Morris JH ,et al.Muscle deficiency and neonatal death in mice with a targeted mutation in the myogenin gene. Nature,1993,364:501
[9]Rudnicki MA,Schnegelsberg PNJ,Stead RH,et al.MyoD or Myf-5 is required for the formation of skeletal muscle.Cell,1993,75:1351
[10]Epstein JA,Lam P,Jepeal L, et al.Pax3 inhabits myogenic differentiation of cultured myoblast cells.J Biochem,1995,270:11719
收稿日期：1998-12-20
修改日期：1999-04-28, 百拇医药