兔骨骼肌卫星细胞的体外培养及生长特性的研究
作者：徐蓬 顾晓明
单位：徐蓬(西安第四军医大学口腔颌面外科，710032)；顾晓明(西安第四军医大学口腔颌面外科，710032)
关键词：卫星细胞；细胞培养；兔；骨骼肌
实用口腔医学杂志000103 摘 要：目的：研究体外分离培养的兔骨骼肌卫星细胞(SC)的生物学特性。方法：采用细胞培养方法，对兔骨骼肌SC进行活细胞观察，并测定兔骨骼肌SC的细胞生长曲线、细胞分裂指数、细胞贴壁率。结果：①兔骨骼肌SC为梭形，呈长轴平行排列，具有明显的方向性；②体外培养的兔骨骼肌SC在10代以内生长稳定，超过10代以后肌SC的融合能力和形成肌管的能力也随之下降。结论：体外培养的兔骨骼肌SC在合适的传代比例和培养条件下在体外能够生存并保持其特性。从肌SC稳定的生物学特性看，可以将其作为研究肌肉受损后再生修复的细胞模型，用于检测和研究某些基因和生长因子对肌肉再生和功能恢复的影响。
, 百拇医药
分类号：Q813.1+1 文献标识码：A
文章编号：1001-3733(2000)01-0007-03
Culture and proliferative characteristics of rabbit skeletal muscle satellite cell
Xu Peng Gu Xianming
(Stomatological Hospital, Fourth Military Mekical University,Xi'an 710032)
Abstract：Objictive：To study the biological characteristics of rabbit skeletal muscle satellite cells(SCs)cultured in vitro. Methods:Invitro cell culture technique, morphological observation, cell counting, mitosis index and adhesion rate measuring were used to study the characteristics of the SCs.Results:(1)Scs were spindle and parallel along their longitudinal axis, showing obvious orientation.(2) SCs grew steadily within 10 passages, and their ability to fuse and form myotubes faded after 10 passages.Conclusion:SCs cultured from rabbit skeletal muscle can grow and maintain their characteristics in vitro provided appropriate passaging rate and culture condition.
, 百拇医药
Key words：Satellite cell; Cell cultivation; Rabbits; Skeletal muscle▲
肌卫星细胞(SC)是一种正常情况下位于成熟肌纤维表面的肌源性细胞。当肌纤维损伤或受到一定刺激后，即促使原来广泛分布的SC向受损区迁移并被激活，进行有丝分裂，随后SC之间相互融合或与受损肌纤维末端融合，融合后的细胞即开始合成收缩蛋白。通过这种方式恢复受损肌肉的连续性和收缩功能〔1〕。体外培养的兔骨骼肌SC与体内的SC相比，其生物学特性如何，发生了那些变化，将直接影响到利用SC进行进一步的研究，目前相关的研究报道很少。本实验的目的在于对体外分离培养的兔骨骼肌SC的生物学特性进行研究，并比较组织块法、改良酶消化法和密度梯度离心法3种方法获得的兔骨骼肌SC的活细胞形态和生长特性。
1 材料和方法
1.1 实验动物为两月龄新西兰白兔。
, 百拇医药
1.2 采用组织块法、改良酶消化法和密度梯度离心法〔2〕分离兔比目鱼肌的SC，进行培养。对三种方法所获SC利用倒置显微镜进行活细胞形态观察；采用MTT法测定SC的生长曲线；同时测定SC的分裂指数和细胞贴壁率。
2 结 果
2.1 原代或传代后的肌SC倒置显微镜下的观察
2.1.1 组织块法 兔骨骼肌SC原代培养后第3天，在组织块周围长出梭形细胞和星形细胞，细胞体积中等，散在分布，细胞间较少见紧密连接(图1)。第9～10天，培养瓶中细胞长满。从第7天开始，梭形细胞的排列开始出现方向性，它们的长轴平行排列，部分细胞之间开始出现融合，形成多核细胞，同时有肌管形成。星形细胞呈网状排列。传代后的细胞部分呈梭形，多呈方向性排列；部分呈星形。融合的梭形细胞数量明显增加(3～6个/20×10倍视野)。根据免疫组化染色鉴定的结果，可确定该细胞是肌SC，但随传代次数的增加，星形细胞数量迅速增加，其生长速度远远快于梭形细胞。这样，在一定的生长时间内，梭形细胞数量相对逐渐减少。
, 百拇医药
2.1.2 改良酶消化法 原代培养24 h后即开始有细胞贴壁，多为梭形细胞，经鉴定是肌SC，呈长轴平行排列，少数为星形细胞。第3天部分肌SC即开始出现融合，肌管结构形成现象多见。传代后观察同组织块法。
2.1.3 密度梯度离心法 将细胞悬液加入15 ml离心管中，其下方为11.5 ml 20% Percoll，最底层为60% Percoll 1.5 ml。然后进行离心。根据密度指示球可划分为7层。各层容积分别为1～4层各2.5 ml，5、6、7层分别为2.1、0.5、1.4 ml(图2)。取第6、7层细胞进行培养，在原代培养24 h后即开始有细胞贴壁，几乎全部是梭形细胞，呈长轴平行排列，星形细胞和圆形细胞(红细胞)极为少见。从第3天开始出现梭形细胞融合成多核细胞和肌管形成现象。传代后几乎全部为梭形细胞，梭形细胞融合成多核细胞以及肌管形成现象多见(图3)。
, 百拇医药 图1 组织块法获得的细胞，第3 天(20×)
图2 密度梯度离心法各层细胞分布
图3 密度梯度离心法获得的细胞，可见梭形细胞融合，肌管形成(20×，HE染色)。
2.2 兔骨骼肌SC的生长曲线
从图4中可以看出，细胞在接种培养后第2天数量有所减少，属于生长适应期。第3 天细胞数量重新开始增加。第4～6天细胞增殖速度最快，到第7 天增殖速度逐渐减慢。
图4 兔骨骼肌卫星细胞生长曲线
, 百拇医药
根据细胞生长曲线上对数生长期始末两点间吸光度值的变化，应用以下公式可以计算出兔骨骼肌SC数的相对吸光度值倍增时间。
DT=t×log2/(logN-logN0)
DT为吸光度值增加1倍的时间，N0为培养第1 天的相对吸光度值，N为生长高峰时相对的吸光度值，t为倍增时间(h)。
计算结果：肌SC相对吸光度值倍增时间为72 h。
2.3 兔骨骼骨SC的分裂指数变化
图5示在培养接种24 h后，开始出现细胞分裂相，但数量很少。培养到72 h，细胞分裂达到高峰，此后逐渐下降，至第7 天已看不见有细胞分裂相，分裂指数降为零。
, 百拇医药
图5 兔骨骼肌卫星细胞分裂指数曲线
图6 兔骨骼肌卫星细胞贴壁率曲线
2.4 兔骨骼肌SC贴壁率曲线
从图6中可以看出，肌SC在接种后2 h就有近45%的细胞贴壁，接种6 h后，贴壁率接近80%，12 h以后，90%以上的细胞贴壁。
3 讨 论
通过对3种方法获得的兔骨骼肌SC的活细胞形态和生长特性的观察发现，以密度梯度离心法获得的肌SC纯化率(平均75%以上)最高。组织块法获得的细胞相当混杂，不可避免地混有成纤维细胞样细胞、红细胞、骨骼肌细胞和血管平滑肌细胞，影响体外对肌SC的培养和研究。改良酶消化法中由于经过Len's网过滤〔3〕，去除了肌纤维，但是也含有部分成纤维细胞样细胞，并且SC的含量不高，所以也影响体外对肌SC的培养和研究。密度梯度离心法获得的SC比例高，杂质细胞少。以密度梯度离心法获得的细胞为例，SC为梭形，呈长轴平行排列，具有明显的方向性，这与其在体内的排列方式，即与肌纤维长轴平行的情况相符合。因肌SC在某种因素刺激下将被激活而形成肌细胞，肌细胞要完成功能性收缩，要求细胞的排列必须具有同向性，杂乱无章地排列既不能表现力，也不能表现位移。肌SC的按方向排列和融合的倾向是这种细胞内在的功能特性之一。
, 百拇医药
从肌SC的生长特性来看，体外培养的兔骨骼肌SC在10代以内生长稳定，尤以第3代至第8代之间最为稳定。由于肌SC被认为是成肌干细胞，故应容易传代并保持其特性。但本实验中超过10代以后，肌SC的数量和特性均有所减低，典型的肌SC数量下降，其融合能力和形成肌管的能力也随之下降，可能是体外环境不同于体内环境如神经支配、神经介质等多种因素作用的结果。但它们在合适的传代比例和培养条件下在体外还是能够生存并保持其特性的。另一方面，肌SC的增殖速度低于正常成纤维细胞和一般体外培养的肿瘤细胞系，后两者在体外的增殖速度均较快，倍增时间一般在20 h左右，分裂指数最高峰在30‰～40‰，比肌SC高1.5倍。这是因为正常肌SC在体内环境中基本处于休眠状态，不表现增殖，只有在肌肉失神经支配或肌肉受到损伤的情况下才被激活，进入增殖状态。在体外培养中，从肌SC稳定的增殖速率看，可以将其作为研究肌肉受损后再生修复的细胞模型，用于检测和研究某些基因和生长因子对肌肉再生和功能恢复的影响。从肌SC的贴壁率测定结果看，兔骨骼肌SC对体外培养条件的适应性较强，可在短时间内(2 h)开始附壁存活，而且传代后存活率更高，对利用该细胞进行体外研究提供了稳定的模型。
, 百拇医药
基金项目：本研究为国家自然科学基金资助(编号：39770803)
参考文献：
[1]Campion DR.The muscle satellite cell:A review.Int Rev Cytol,1984,87:225
[2]Yablonka-Reuveni Z,Nameroff M.Skeletal muscle cell populations separation and partial characterization of fibroblast like cells from embryonic tissue using density centrifugation.Histochemistry,1987,87:27
[3]Ray CJ,Zibaitis A,Race LK.Cellular cardiomyoplasty:Myocardial regeneration with satellite cell in plantation.Ann Thorac Surg,1995,60:12
收稿日期：1998-03-30
修改日期：1999-10-08, http://www.100md.com
单位：徐蓬(西安第四军医大学口腔颌面外科，710032)；顾晓明(西安第四军医大学口腔颌面外科，710032)
关键词：卫星细胞；细胞培养；兔；骨骼肌
实用口腔医学杂志000103 摘 要：目的：研究体外分离培养的兔骨骼肌卫星细胞(SC)的生物学特性。方法：采用细胞培养方法，对兔骨骼肌SC进行活细胞观察，并测定兔骨骼肌SC的细胞生长曲线、细胞分裂指数、细胞贴壁率。结果：①兔骨骼肌SC为梭形，呈长轴平行排列，具有明显的方向性；②体外培养的兔骨骼肌SC在10代以内生长稳定，超过10代以后肌SC的融合能力和形成肌管的能力也随之下降。结论：体外培养的兔骨骼肌SC在合适的传代比例和培养条件下在体外能够生存并保持其特性。从肌SC稳定的生物学特性看，可以将其作为研究肌肉受损后再生修复的细胞模型，用于检测和研究某些基因和生长因子对肌肉再生和功能恢复的影响。
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分类号：Q813.1+1 文献标识码：A
文章编号：1001-3733(2000)01-0007-03
Culture and proliferative characteristics of rabbit skeletal muscle satellite cell
Xu Peng Gu Xianming
(Stomatological Hospital, Fourth Military Mekical University,Xi'an 710032)
Abstract：Objictive：To study the biological characteristics of rabbit skeletal muscle satellite cells(SCs)cultured in vitro. Methods:Invitro cell culture technique, morphological observation, cell counting, mitosis index and adhesion rate measuring were used to study the characteristics of the SCs.Results:(1)Scs were spindle and parallel along their longitudinal axis, showing obvious orientation.(2) SCs grew steadily within 10 passages, and their ability to fuse and form myotubes faded after 10 passages.Conclusion:SCs cultured from rabbit skeletal muscle can grow and maintain their characteristics in vitro provided appropriate passaging rate and culture condition.
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Key words：Satellite cell; Cell cultivation; Rabbits; Skeletal muscle▲
肌卫星细胞(SC)是一种正常情况下位于成熟肌纤维表面的肌源性细胞。当肌纤维损伤或受到一定刺激后，即促使原来广泛分布的SC向受损区迁移并被激活，进行有丝分裂，随后SC之间相互融合或与受损肌纤维末端融合，融合后的细胞即开始合成收缩蛋白。通过这种方式恢复受损肌肉的连续性和收缩功能〔1〕。体外培养的兔骨骼肌SC与体内的SC相比，其生物学特性如何，发生了那些变化，将直接影响到利用SC进行进一步的研究，目前相关的研究报道很少。本实验的目的在于对体外分离培养的兔骨骼肌SC的生物学特性进行研究，并比较组织块法、改良酶消化法和密度梯度离心法3种方法获得的兔骨骼肌SC的活细胞形态和生长特性。
1 材料和方法
1.1 实验动物为两月龄新西兰白兔。
, 百拇医药
1.2 采用组织块法、改良酶消化法和密度梯度离心法〔2〕分离兔比目鱼肌的SC，进行培养。对三种方法所获SC利用倒置显微镜进行活细胞形态观察；采用MTT法测定SC的生长曲线；同时测定SC的分裂指数和细胞贴壁率。
2 结 果
2.1 原代或传代后的肌SC倒置显微镜下的观察
2.1.1 组织块法 兔骨骼肌SC原代培养后第3天，在组织块周围长出梭形细胞和星形细胞，细胞体积中等，散在分布，细胞间较少见紧密连接(图1)。第9～10天，培养瓶中细胞长满。从第7天开始，梭形细胞的排列开始出现方向性，它们的长轴平行排列，部分细胞之间开始出现融合，形成多核细胞，同时有肌管形成。星形细胞呈网状排列。传代后的细胞部分呈梭形，多呈方向性排列；部分呈星形。融合的梭形细胞数量明显增加(3～6个/20×10倍视野)。根据免疫组化染色鉴定的结果，可确定该细胞是肌SC，但随传代次数的增加，星形细胞数量迅速增加，其生长速度远远快于梭形细胞。这样，在一定的生长时间内，梭形细胞数量相对逐渐减少。
, 百拇医药
2.1.2 改良酶消化法 原代培养24 h后即开始有细胞贴壁，多为梭形细胞，经鉴定是肌SC，呈长轴平行排列，少数为星形细胞。第3天部分肌SC即开始出现融合，肌管结构形成现象多见。传代后观察同组织块法。
2.1.3 密度梯度离心法 将细胞悬液加入15 ml离心管中，其下方为11.5 ml 20% Percoll，最底层为60% Percoll 1.5 ml。然后进行离心。根据密度指示球可划分为7层。各层容积分别为1～4层各2.5 ml，5、6、7层分别为2.1、0.5、1.4 ml(图2)。取第6、7层细胞进行培养，在原代培养24 h后即开始有细胞贴壁，几乎全部是梭形细胞，呈长轴平行排列，星形细胞和圆形细胞(红细胞)极为少见。从第3天开始出现梭形细胞融合成多核细胞和肌管形成现象。传代后几乎全部为梭形细胞，梭形细胞融合成多核细胞以及肌管形成现象多见(图3)。
, 百拇医药 图1 组织块法获得的细胞，第3 天(20×)
图2 密度梯度离心法各层细胞分布
图3 密度梯度离心法获得的细胞，可见梭形细胞融合，肌管形成(20×，HE染色)。
2.2 兔骨骼肌SC的生长曲线
从图4中可以看出，细胞在接种培养后第2天数量有所减少，属于生长适应期。第3 天细胞数量重新开始增加。第4～6天细胞增殖速度最快，到第7 天增殖速度逐渐减慢。
图4 兔骨骼肌卫星细胞生长曲线
, 百拇医药
根据细胞生长曲线上对数生长期始末两点间吸光度值的变化，应用以下公式可以计算出兔骨骼肌SC数的相对吸光度值倍增时间。
DT=t×log2/(logN-logN0)
DT为吸光度值增加1倍的时间，N0为培养第1 天的相对吸光度值，N为生长高峰时相对的吸光度值，t为倍增时间(h)。
计算结果：肌SC相对吸光度值倍增时间为72 h。
2.3 兔骨骼骨SC的分裂指数变化
图5示在培养接种24 h后，开始出现细胞分裂相，但数量很少。培养到72 h，细胞分裂达到高峰，此后逐渐下降，至第7 天已看不见有细胞分裂相，分裂指数降为零。
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图5 兔骨骼肌卫星细胞分裂指数曲线
图6 兔骨骼肌卫星细胞贴壁率曲线
2.4 兔骨骼肌SC贴壁率曲线
从图6中可以看出，肌SC在接种后2 h就有近45%的细胞贴壁，接种6 h后，贴壁率接近80%，12 h以后，90%以上的细胞贴壁。
3 讨 论
通过对3种方法获得的兔骨骼肌SC的活细胞形态和生长特性的观察发现，以密度梯度离心法获得的肌SC纯化率(平均75%以上)最高。组织块法获得的细胞相当混杂，不可避免地混有成纤维细胞样细胞、红细胞、骨骼肌细胞和血管平滑肌细胞，影响体外对肌SC的培养和研究。改良酶消化法中由于经过Len's网过滤〔3〕，去除了肌纤维，但是也含有部分成纤维细胞样细胞，并且SC的含量不高，所以也影响体外对肌SC的培养和研究。密度梯度离心法获得的SC比例高，杂质细胞少。以密度梯度离心法获得的细胞为例，SC为梭形，呈长轴平行排列，具有明显的方向性，这与其在体内的排列方式，即与肌纤维长轴平行的情况相符合。因肌SC在某种因素刺激下将被激活而形成肌细胞，肌细胞要完成功能性收缩，要求细胞的排列必须具有同向性，杂乱无章地排列既不能表现力，也不能表现位移。肌SC的按方向排列和融合的倾向是这种细胞内在的功能特性之一。
, 百拇医药
从肌SC的生长特性来看，体外培养的兔骨骼肌SC在10代以内生长稳定，尤以第3代至第8代之间最为稳定。由于肌SC被认为是成肌干细胞，故应容易传代并保持其特性。但本实验中超过10代以后，肌SC的数量和特性均有所减低，典型的肌SC数量下降，其融合能力和形成肌管的能力也随之下降，可能是体外环境不同于体内环境如神经支配、神经介质等多种因素作用的结果。但它们在合适的传代比例和培养条件下在体外还是能够生存并保持其特性的。另一方面，肌SC的增殖速度低于正常成纤维细胞和一般体外培养的肿瘤细胞系，后两者在体外的增殖速度均较快，倍增时间一般在20 h左右，分裂指数最高峰在30‰～40‰，比肌SC高1.5倍。这是因为正常肌SC在体内环境中基本处于休眠状态，不表现增殖，只有在肌肉失神经支配或肌肉受到损伤的情况下才被激活，进入增殖状态。在体外培养中，从肌SC稳定的增殖速率看，可以将其作为研究肌肉受损后再生修复的细胞模型，用于检测和研究某些基因和生长因子对肌肉再生和功能恢复的影响。从肌SC的贴壁率测定结果看，兔骨骼肌SC对体外培养条件的适应性较强，可在短时间内(2 h)开始附壁存活，而且传代后存活率更高，对利用该细胞进行体外研究提供了稳定的模型。
, 百拇医药
基金项目：本研究为国家自然科学基金资助(编号：39770803)
参考文献：
[1]Campion DR.The muscle satellite cell:A review.Int Rev Cytol,1984,87:225
[2]Yablonka-Reuveni Z,Nameroff M.Skeletal muscle cell populations separation and partial characterization of fibroblast like cells from embryonic tissue using density centrifugation.Histochemistry,1987,87:27
[3]Ray CJ,Zibaitis A,Race LK.Cellular cardiomyoplasty:Myocardial regeneration with satellite cell in plantation.Ann Thorac Surg,1995,60:12
收稿日期：1998-03-30
修改日期：1999-10-08, http://www.100md.com